高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中維生素C含量的FAPAS能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

◎ 劉 靜，馬殿君，董 斌，施 法

（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116021；3.沈陽(yáng)食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110136）

維生素C又名抗壞血酸，具有很強(qiáng)的抗氧化性，可參與膠原蛋白和類固醇的合成、鐵的吸收等多種生物化學(xué)反應(yīng)[1]，具有預(yù)防動(dòng)脈硬化、提高免疫力、治療壞血病、預(yù)防衰老、減輕炎性反應(yīng)、防癌抗癌等作用[2-5]，是維護(hù)人體正常生理機(jī)能所必需的水溶性維生素。人體自身無(wú)法合成和儲(chǔ)存維生素C，必須從外界獲得[6]，在嬰幼兒配方乳粉中，維生素C是重要的必需營(yíng)養(yǎng)素[7]，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）對(duì)其指標(biāo)含量作了相應(yīng)的規(guī)定。維生素C烯醇式己糖酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，遇水、光、熱、氧都易發(fā)生降解[8]，所以快速準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)品中的維生素C對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)具有重要意義。

圖1 維生素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖

目前，維生素C的檢測(cè)方法主要有滴定法[9]、伏安法[10]、分光光度法[11-13]、紅外光譜法[14]、高效液相色譜法[15-18]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[19]等。滴定法、伏安法和分光光度法操作過(guò)程復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，而且專屬性不強(qiáng)，易受外界因素的干擾；紅外光譜法建模需要大量的樣品和較長(zhǎng)的周期，準(zhǔn)確度較差[20]；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)儀器和人員的水平要求較高，不太具有普遍適用性。高效液相色譜法具有高效、高靈敏度、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于產(chǎn)品的含量測(cè)定中，也是各國(guó)藥典和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中收錄的常規(guī)方法。針對(duì)乳粉中維生素C的測(cè)定，我國(guó)現(xiàn)行的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測(cè)定》（GB 5009.86—2016）和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素C的測(cè)定》（GB 5413.18—2010）。GB 5009.86—2016的第二法和 GB 5413.18—2010采用的是熒光分光光度法，該方法前處理步驟復(fù)雜，干擾因素較多，方法的重復(fù)性也不理想。本研究在GB 5009.86—2016第一法 高效液相色譜法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，改進(jìn)色譜系統(tǒng)，簡(jiǎn)化前處理步驟，使其更適用于嬰幼兒乳粉中維生素C的質(zhì)量控制。

為確保維生素C檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，定期參加外部質(zhì)量控制尤為必要，能力驗(yàn)證作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室用于質(zhì)量監(jiān)控的重要手段之一。目前，具備能力驗(yàn)證資格的機(jī)構(gòu)主要有中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）、英國(guó)分析實(shí)驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證公司（FAPAS）和英國(guó)分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（LGC）等[21]，其中，F(xiàn)APAS分析實(shí)驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證是專門從事食品檢驗(yàn)方面的能力評(píng)價(jià)體系，通過(guò)比對(duì)實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)試結(jié)果來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室的能力[22]。為提高乳粉相關(guān)檢測(cè)能力和水平，本實(shí)驗(yàn)室參加了2020年度FAPAS嬰幼兒配方乳粉中維生素C含量檢測(cè)的能力驗(yàn)證，通過(guò)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，不僅可以驗(yàn)證方法的可行性和人員的檢驗(yàn)水平，而且有助于發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室在管理或技術(shù)能力方面存在的問(wèn)題，并及時(shí)加以整改和完善，以持續(xù)提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平和質(zhì)控能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）、磷酸二氫銨（分析純）、磷酸（分析純）和偏磷酸（分析純）（國(guó)藥集團(tuán)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。維生素C對(duì)照品（L（+）-抗壞血酸）（純度100%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院）。實(shí)驗(yàn)樣品為FAPAS組織方提供的嬰兒配方乳粉，乳白色粉末，樣品編號(hào)為21120。質(zhì)控樣品購(gòu)自FAPAS組織方，編號(hào)為21115。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance acquity e2695 HPLC系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、2998二極管陣列檢測(cè)器以及Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；XP 205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MODEL868酸度計(jì)（Thermo公司）；Mili-Q去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

采用TechMate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0）（2∶98，V∶V）等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.7 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 溶液配制

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1.103 mg·mL-1）配制：精密稱取維生素C對(duì)照品22.06 mg，置20 mL棕色容量瓶中，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）溶解并定容至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

對(duì)照品使用溶液（110.3 μg·mL-1）配制：精密量取5 mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，置50 mL棕色容量瓶中，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋定容至刻度，搖勻，得對(duì)照品使用溶液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制：分別精密量取對(duì)照品使用溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL和8.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋至刻度，搖勻，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度分 別為 5.52 μg·mL-1、11.03 μg·mL-1、22.06 μg·mL-1、44.12 μg·mL-1、66.18 μg·mL-1和 88.24 μg·mL-1。

供試品溶液配制：準(zhǔn)確稱取混勻后的樣品粉末2 g，置于50 mL棕色容量瓶中，加適量偏磷酸溶液（20 g·L-1），振搖溶散后超聲提取20 min，放冷，加偏磷酸溶液（20 g·L-1）稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm水系濾膜后進(jìn)行液相分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

維生素C極性較大，在反相色譜柱上不易保留，GB 5009.86—2016的第一法采用離子對(duì)試劑與待測(cè)物結(jié)合的方式使其保留。離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱的傷害較大，且分析需要較長(zhǎng)的平衡時(shí)間，如果平衡時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致測(cè)得結(jié)果的重復(fù)性不符合要求。本實(shí)驗(yàn)嘗試多種緩沖鹽體系后，最終選擇磷酸二氫銨水溶液-甲醇作為流動(dòng)相系統(tǒng)，由于維生素C為酸性化合物，為了增強(qiáng)其保留效果，緩沖液體系用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0。該流動(dòng)相系統(tǒng)酸性較強(qiáng)，水相比例較大，對(duì)色譜柱的要求較高。試驗(yàn)考察了資生堂CAPCELL-PAK C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm） 和 TechMate C4ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）4種不同色譜柱的分離效果和耐用性。結(jié)果顯示，維生素C在C4色譜柱上的保留較差，且主峰與雜質(zhì)峰分不開(kāi)，影響維生素C的分析測(cè)定；資生堂CAPCELL-PAK C18和Eclipse XDB-C18色譜柱可以耐受低pH的流動(dòng)相體系，維生素C的峰形和分離尚可，但在進(jìn)行多個(gè)分析批的測(cè)定時(shí)，會(huì)出現(xiàn)色譜峰峰形變差和保留時(shí)間不穩(wěn)定的現(xiàn)象，這可能是由于高比例的水相體系造成色譜柱疏水塌陷，從而影響分離效果；TechMate C18-ST是一種耐寬pH范圍和高比例水相的色譜柱，適用于本研究采用的流動(dòng)相體系，該色譜柱不僅可以實(shí)現(xiàn)主峰與雜質(zhì)峰的完全分離，在連續(xù)進(jìn)行多個(gè)分析批的檢測(cè)時(shí)，穩(wěn)定性和耐用性均能符合實(shí)驗(yàn)要求，故實(shí)驗(yàn)最終采用TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行維生素C的分析測(cè)定。

2.2 提取溶劑的選擇

維生素C容易失去電子，具有還原性，是一種較強(qiáng)的還原劑，在水溶液中，尤其是堿性溶液中很容易被氧化，水溶液呈酸性時(shí)可抑制降解[23]。通過(guò)參考文獻(xiàn)及國(guó)標(biāo)中采用的提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)考察了草酸溶液、磷酸水溶液及偏磷酸水溶液為提取溶劑時(shí)對(duì)維生素C提取效率及峰形的影響。結(jié)果顯示，磷酸水溶液和偏磷酸水溶液提取維生素C的峰形優(yōu)于草酸作為提取溶劑時(shí)的峰形，但磷酸水溶液的濃度達(dá)到8%時(shí)提取回收率才達(dá)到滿意結(jié)果，考慮高濃度酸對(duì)分析儀器的損傷，實(shí)驗(yàn)最終選擇偏磷酸溶液作為提取溶劑，維生素C的峰形較理想，回收率符合要求。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

維生素C有兩種構(gòu)型，分別為L(zhǎng)（+）-抗壞血酸和D（-）抗壞血酸，在該實(shí)驗(yàn)條件下，二者可以達(dá)到基線分離，分離度為1.97，色譜圖見(jiàn)圖2。由于樣品中只檢測(cè)到了L（+）-抗壞血酸，故實(shí)驗(yàn)將測(cè)得的L（+）-抗壞血酸的含量作為維生素C的含量。對(duì)照品溶液和供試品溶液的液相色譜圖中維生素C的理論塔板數(shù)分別為12 256和10 443，峰形對(duì)稱，供試品溶液中維生素C峰與其他雜質(zhì)峰分離較好，空白溶劑不干擾樣品測(cè)定，該方法專屬性良好?？瞻兹軇┥V圖、對(duì)照品溶液及樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 L（+）-抗壞血酸和D（-）抗壞血酸的HPLC色譜圖

圖3 空白、對(duì)照品和樣品溶液的HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

取標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。以維生素C濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，維生素C的回歸方程為：A=104 076.11C-6 207.98（r=0.999 7，n=6），結(jié)果表明，維生素C在5.52～88.24 μg·mL-1，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取維生素C對(duì)照品溶液20 μL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，維生素C色譜峰保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為0.52%（n=6）和0.43%（n=6）。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品6份，按照“1.3.2”項(xiàng)下同法制備供試品溶液，采用“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算維生素C的含量。樣品中維生素C的平均含量為88.0 mg/100 g，RSD為1.16%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.3.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密量取已知含量的樣品1 g，分別加入“1.3.2”項(xiàng)下所配制的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL，每份樣品平行操作3份，按“1.3.2”項(xiàng)下同法制備供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=9），結(jié)果如表1所示。其平均回收率在97.50%～101.38%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.91%～1.66%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)使用的方法可靠，準(zhǔn)確度符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 維生素C的回收率及其RSD結(jié)果表（n=9）

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，分別于0 h、2 h、4 h、8 h和10 h進(jìn)樣，記錄維生素C色譜峰面積。結(jié)果顯示，維生素C的峰面積RSD為1.22%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果及判定

為減小實(shí)驗(yàn)誤差，保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用人員比對(duì)和質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)。每份樣品均采用雙人三平行，采用外標(biāo)法定量，維生素C測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)控樣品和能力驗(yàn)證樣品含量測(cè)定結(jié)果及判定表

由表2可知，人員比對(duì)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.25%～0.95%，偏差較小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果受人員差異的影響較小，由外部帶入的誤差在可控范圍內(nèi)。平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD均為1.16%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。本次能力驗(yàn)證的分析評(píng)價(jià)方式采取的是Z比分?jǐn)?shù)進(jìn)行確定。|Z|≤2為滿意；|Z|≥3為不滿意，應(yīng)采取糾正措施；2＜|Z|＜3為可疑，提示應(yīng)引起警戒[24]。由本次能力驗(yàn)證結(jié)果可知，質(zhì)控樣品21115的測(cè)定值在參考值范圍內(nèi)，Z值為-0.3，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法適用于嬰幼兒乳粉中維生素C的測(cè)定。采用該法測(cè)得的能力驗(yàn)證樣品中維生素C的結(jié)果Z值為-0.1，|Z|值＜2且接近0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為滿意。

根據(jù)FAPAS公布的此次嬰幼兒乳粉中維生素C能力驗(yàn)證的結(jié)果，全球共80家實(shí)驗(yàn)室參與此次實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證比對(duì)，73家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)|Z|≤2，結(jié)果判定為滿意，共有7家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)|Z|＞2，結(jié)果判定為不滿意，滿意率達(dá)到91%。本實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)|Z|值為0.1，結(jié)果非常接近中位值，說(shuō)明利用該方法檢測(cè)乳粉中維生素C是準(zhǔn)確可靠的。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有2個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。①由于維生素C不穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書的儲(chǔ)藏條件存放，開(kāi)封后應(yīng)立即檢測(cè)。②實(shí)驗(yàn)設(shè)置人員平行實(shí)驗(yàn)和質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置了空白對(duì)照，排除試劑污染和人員誤差，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。通過(guò)此次能力驗(yàn)證考核，驗(yàn)證了優(yōu)化后的檢驗(yàn)方法的適用性和準(zhǔn)確性，積累了乳粉檢測(cè)的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，提高了實(shí)驗(yàn)人員分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的信心。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)維生素C的特點(diǎn)和乳粉檢測(cè)的需要，建立了一種快速分離分析嬰幼兒乳粉中維生素C的高效液相色譜法。該方法與國(guó)標(biāo)方法相比，維生素C的同分異構(gòu)體分離更完全，分析時(shí)間更短；由于改進(jìn)了流動(dòng)相體系，使得重復(fù)性更好；采用該法測(cè)定能力驗(yàn)證樣品中的維生素C，|Z|為0.1，判定結(jié)果為滿意，表明該法可以用于嬰幼兒乳粉中維生素C的質(zhì)量檢測(cè)。該法不僅可以用于嬰幼兒乳粉中維生素C的含量測(cè)定，也可為食品和保健食品中維生素C的質(zhì)量控制提供參考。