多種方法檢測(cè)乳粉中菌落總數(shù)能力驗(yàn)證樣品

◎ 李 璐，馬 寧

（山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 太原 030031）

能力驗(yàn)證是評(píng)價(jià)和證明實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段，也是一種非常有效的外部質(zhì)量評(píng)估方式。實(shí)驗(yàn)室可以通過參加能力驗(yàn)證檢測(cè)其對(duì)檢測(cè)程序、方法、設(shè)備、人員等運(yùn)行控制的有效性[1]，也可有效識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問題，監(jiān)督和改進(jìn)自身檢測(cè)能力，完善質(zhì)量管理體系[2]。2020年，本實(shí)驗(yàn)室參加由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織和實(shí)施的乳粉中菌落總數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證，兩個(gè)濃度的樣品檢測(cè)結(jié)果均為滿意。為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，此次考核由雙人平行試驗(yàn)，同時(shí)使用兩個(gè)廠家的培養(yǎng)基，并增加了顯色劑對(duì)照組和測(cè)試紙片對(duì)照組，本文對(duì)此次能力驗(yàn)證的過程和結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析，以期對(duì)其他實(shí)驗(yàn)室的能力驗(yàn)證活動(dòng)有所幫助和參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的乳粉中菌落總數(shù)的能力驗(yàn)證，編號(hào)為52、127。每個(gè)編號(hào)對(duì)應(yīng)1份為白色球狀西林瓶裝樣品和1袋乳粉樣品。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（北京陸橋，200717），平板計(jì)數(shù)瓊脂（青島海博，20200227），菌落總數(shù)測(cè)試片（3M，335JJJ），菌落總數(shù)測(cè)試片（北京陸橋，20190604AC），紅四氮唑（TTC，上海滬震實(shí)業(yè)，HZ10103901），磷酸鹽緩沖液（北京陸橋，200304）。

1.3 儀器設(shè)備

TOMY-700高壓滅菌鍋，Heratherm IGS 400培養(yǎng)箱，Scout SE-SE2001F電子天平，BagMixer 400VW拍擊式均質(zhì)器，Thermo 1384生物安全柜。

1.4 檢測(cè)方法

按照《乳粉中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書》（NIFDC-PT-252）和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）的要求進(jìn)行樣品處理、稀釋和培養(yǎng)計(jì)數(shù)[3]。

1.5 樣品處理及稀釋

在生物安全柜內(nèi)將含有菌落總數(shù)樣品的西林瓶打開，取225 mL磷酸鹽緩沖液加入到無菌均質(zhì)袋中，并將西林瓶?jī)?nèi)的小球加入到磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中，充分溶解。然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中，充分均質(zhì)混勻。依此方法分別對(duì)兩件樣品進(jìn)行處理。

取1 mL 1∶10樣品勻液加入到9 mL磷酸鹽緩沖液中，反復(fù)吹打使其混合均勻，制備1∶100樣品勻液，依此法共制備10-1～10-66個(gè)稀釋度稀釋液，按照GB 4789.2—2016進(jìn)行計(jì)數(shù)。由兩名人員同時(shí)使用兩種不同廠家來源的平板計(jì)數(shù)瓊脂進(jìn)行操作。為防止菌落蔓延和方便計(jì)數(shù)，另外一組在傾注培養(yǎng)基前，在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.001%的TTC。另外使用北京陸橋和3M的菌落總數(shù)測(cè)試片進(jìn)行計(jì)數(shù)，每片接種量為1 mL。以上各組置于36 ℃培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)由雙人獨(dú)立操作，使用北京陸橋和青島海博兩種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基設(shè)置TTC對(duì)照組，另外使用北京陸橋和3M的菌落總數(shù)測(cè)試片同時(shí)試驗(yàn)，結(jié)果見表1、表2。兩位檢驗(yàn)員的檢測(cè)結(jié)果基本一致，52號(hào)樣品的菌落總數(shù)最終報(bào)告為各組均值16 083 CFU·g-1。127號(hào)樣品因菌數(shù)較多，紙片法菌落重疊較為嚴(yán)重，不易計(jì)數(shù)，故呈現(xiàn)出較大誤差，故最終報(bào)告為平皿法的各組均值2 487.5 CFU·g-1。Z值分別為0.23、0.22，結(jié)果為滿意。

表2 127號(hào)樣品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果表

（續(xù)表2）

3 結(jié)論與討論

《乳粉中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃》（NIFDC-PT-252）為定量檢測(cè)項(xiàng)目，設(shè)計(jì)了2個(gè)不同濃度的樣品。本實(shí)驗(yàn)室兩個(gè)濃度的樣品菌落總數(shù)的測(cè)試結(jié)果均為滿意，但兩個(gè)樣品的結(jié)果報(bào)告值均略高于指定值（52和127號(hào)樣品的菌落總數(shù)指定值分別為14 000 CFU·g-1和2 200 CFU·g-1）。分析原因可能為從樣品稀釋至傾注培養(yǎng)基時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致樣液中菌數(shù)有所增殖。另外，127號(hào)樣品因生長(zhǎng)菌落數(shù)較多，使用菌落測(cè)試片檢測(cè)時(shí)菌落堆疊蔓延的情況較為嚴(yán)重，誤差較大，而且不同廠家的測(cè)試紙片結(jié)果差異較大。

實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵控制點(diǎn)分析。①設(shè)置雙人同時(shí)試驗(yàn)，減少人員操作誤差，兩人平行試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)滿足再現(xiàn)性要求，即對(duì)數(shù)值絕對(duì)差值不大于0.45[4]。②樣品應(yīng)充分稀釋并混合均勻，確保樣液的均一性，稀釋度至少制備至10-6，確保有適宜計(jì)數(shù)的平板。③設(shè)置TTC對(duì)照組，TTC不僅可使生長(zhǎng)菌落更易辨認(rèn)，還具有防止菌落蔓延的作用。但應(yīng)注意其使用濃度，《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010年版）》中建議使用濃度為0.001%[5]，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》中使用濃度為0.005%[6]。劉勝桃等[7]研究發(fā)現(xiàn)使用0.001%～0.002%的TTC用于乳及乳制品菌落總數(shù)檢測(cè)較為適宜，濃度過高會(huì)抑制菌落生長(zhǎng)。④培養(yǎng)至24 h、48 h時(shí)應(yīng)分別計(jì)數(shù)，防止菌落蔓延導(dǎo)致菌落無法計(jì)數(shù)的情況出現(xiàn)。

掌握以上關(guān)鍵操作點(diǎn)是獲得可靠試驗(yàn)數(shù)據(jù)的前提，通過多種方法相互驗(yàn)證，可以進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，使實(shí)驗(yàn)室報(bào)出結(jié)果時(shí)更具有把握。實(shí)驗(yàn)室可通過參加能力驗(yàn)證活動(dòng)不斷積累實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提升檢驗(yàn)人員的技能水平，確保實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量。