桶裝水中銅綠假單胞菌檢驗方法的建立

◎ 樊惠華，侯磊磊，米林鋒，柴梅梅，郭 蓉

（榆林市食品檢驗檢測中心，陜西 榆林 719000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種重要的食源性和水源性致病菌，因其能夠在低營養(yǎng)的水環(huán)境中生存而廣泛存在于水中，是化膿性感染的重要致病菌之一[1]。銅綠假單胞菌屬于條件致病菌，對抵抗力較弱的人群存在較大的健康風(fēng)險。飲用水中如果含有銅綠假單胞菌，被人大量飲用或被胃腸黏膜有損傷的病人、嬰幼兒飲用，可能會導(dǎo)致腹瀉，嚴重者甚至可能感染該菌并引發(fā)相關(guān)疾病[2]。由于銅綠假單胞菌具有較大的危害性，美國、加拿大、日本、巴西及世界衛(wèi)生組織等多數(shù)國家和國際組織對飲用水中銅綠假單胞菌含量標(biāo)準(zhǔn)的要求是每250 mL不得檢出?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）微生物限量銅綠假單胞菌指標(biāo)，明確規(guī)定銅綠假單胞菌是必檢項之一，且每250 mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。該標(biāo)準(zhǔn)自2015年5月24日起實施，并且要求企業(yè)出廠前對每批次成品進行銅綠假單胞菌檢測。如果檢出銅綠假單胞菌，則為不合格產(chǎn)品，應(yīng)該停止銷售。同時，對已在市場上流通的超標(biāo)桶裝水必須召回。

近年來，桶裝水因其潔凈衛(wèi)生、不含雜質(zhì)、便利等優(yōu)點消費量不斷上升，在家庭和公共場所得到廣泛地使用。然而，關(guān)于銅綠假單胞菌污染桶裝水的報道也逐漸增多，甚至報道出食物中毒的事件[3-4]。榆林市食品檢驗檢測中心自2017年取得檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定以來，于2019年對市60多家水廠的桶裝水進行專項和監(jiān)督抽檢檢驗，發(fā)現(xiàn)不合格率達到10%左右，幾乎都是銅綠假單胞菌超標(biāo)所致，桶裝水的安全令人擔(dān)憂。目前，桶裝水中銅綠假單胞菌檢測技術(shù)可分為2類，分別為傳統(tǒng)國標(biāo)檢驗方法和以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的快檢方法，其中傳統(tǒng)方法主要是GB 8538—2016中的濾膜法以及改進培養(yǎng)基的銅綠假單胞菌培養(yǎng)方法；快速檢測方法則涉及Kirby-Bauer紙片擴散法和以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic，RAPD）分型法等。桶裝水的市場監(jiān)管中主要應(yīng)用傳統(tǒng)的國標(biāo)檢測方法，快速檢測的方法因其對檢驗人員的技術(shù)要求較高，不適用于一些中小型水廠的出廠檢驗。

本文針對榆林市的水廠實際狀況，為提高大型水廠、中小型水廠或者小型水廠銅綠假單胞菌的現(xiàn)場檢驗效率，在國標(biāo)的基礎(chǔ)上通過單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置取代傳統(tǒng)的百級潔凈環(huán)境中抽濾系統(tǒng)完成銅綠假單胞菌的初步檢驗，與國際方法檢驗過程比較，具有對檢測環(huán)境要求低、操作簡單的優(yōu)越性，可推廣應(yīng)用于本市桶裝水生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的不同規(guī)格桶裝飲用水銅綠假單胞菌的出廠檢驗。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

檢驗用的水樣為榆林市市場銷售的榆陽泉品牌桶裝飲用水，樣品在保質(zhì)期內(nèi)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC 13525），均購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與試劑

單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置包括取液管，其進液端設(shè)置有斜向穿刺口，其出液端連接有單向閥；過濾器，其進液端與單向閥連接，其出液端連接有截止閥；負壓計量瓶，其進液端通過連接管與截止閥連接，其出液端通過導(dǎo)氣管與負壓真空泵連接；過濾器內(nèi)設(shè)置有濾腔，濾腔內(nèi)填充有過濾介質(zhì)。采用的過濾介質(zhì)為微孔濾膜，具體操作過程包括：器械組裝→消毒→無菌穿刺引流→負壓流量控制→定量吸附過濾→制備樣貯藏→運輸→潔凈區(qū)濾膜轉(zhuǎn)移→轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)。該裝置為榆林市食品檢驗檢測中心專利產(chǎn)品[5]，見圖1。

圖1 單向負壓吸附取樣過濾裝置圖

SSM-6不銹鋼過濾系統(tǒng)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜，購自浙江泰林生物技術(shù)有限公司；直徑為47 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BXM-75V立式高壓蒸汽滅菌器，BXS-250可擴展試驗箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HFsafe 1500TE生物安全柜，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

CN瓊脂及配套試劑，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂、腦心浸出液肉湯、乙酰胺肉湯、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、納氏試劑和氧化酶試紙，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置與不銹鋼過濾系統(tǒng)對銅綠假單胞菌檢測方法比較

取銅綠假單胞菌（ATCC 27853）標(biāo)準(zhǔn)菌株F2代接種于BHI肉湯，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌移液管吸取10 μL于500 mL無菌生理鹽水中，制備陽性母液。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）中銅綠假單胞菌檢驗方法，對水樣進行銅綠假單胞菌檢測。

根據(jù)樣品的污染情況，將陽性水樣稀釋至10-6稀釋度，每一個梯度分別用兩種過濾裝置進行，不銹鋼過濾系統(tǒng)編號為A組，單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置編號為B組。A組量取250 mL水樣用直徑為47 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜過濾；B組量取250 mL水樣用直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm水系過濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上。平板于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（36±1）℃培養(yǎng)40～48 h，在培養(yǎng)20～24 h和40～48 h后觀察濾膜上菌落的生長情況并計數(shù)。銅綠假單胞菌在CN瓊脂上生長的菌落選擇和驗證步驟有3種：計數(shù)所有顯藍色或綠色（綠膿色素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，并進行綠膿菌素確證性試驗；計數(shù)濾膜上所有發(fā)熒光不產(chǎn)綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進行乙酰胺肉湯確證性試驗；將其他所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進行氧化酶測試及乙酰胺液體培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基確證性試驗。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理方法利用SPSS在線軟件對A組和B組銅綠假單胞菌檢測計數(shù)數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)接近1，二者具有完美的正相關(guān)關(guān)系。

1.4.3 單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯(lián)合驗證試驗

選7家有銅綠假單胞菌CMA檢測能力的實驗室，組成聯(lián)合驗證小組，統(tǒng)一驗證工作程序，統(tǒng)一檢測方法，統(tǒng)一陽性菌母液和單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置。根據(jù)1.4.1銅綠假單胞菌計數(shù)結(jié)果于300 mL陽性母液中加入400 mL無菌生理鹽水，終濃度控制在400 CFU·mL-1左右，分裝成7個100 mL陽性母液冷藏貯存，24 h內(nèi)運送至7家實驗室，同一時間時分別提取2 mL、20 mL和30 mL的母液量加入3桶同一批次18.9 L榆陽泉品牌桶裝水進行銅綠假單胞菌檢測驗證，編號A樣、B樣和C樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種過濾裝置檢測結(jié)果對比分析

分別用兩種過濾裝置對第1 d、第3 d、第5 d的水樣進行銅綠假單胞菌檢測（如圖2所示），將A組和B組銅綠假單胞檢測數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，A組和B組之間的相關(guān)系數(shù)值為0.997，并且呈現(xiàn)出0.01水平的顯著性，因而說明A組和B組之間有著顯著的正相關(guān)關(guān)系。具體結(jié)果見表1。

圖2 A組和B組10-3稀釋度第1 d、第3 d、第5 d的水樣銅綠假單胞菌檢測結(jié)果圖

表1 不同天數(shù)不同稀釋度銅綠假單胞菌計數(shù)結(jié)果表

2.2 實驗室間檢測結(jié)果比對分析

因桶裝水中雜菌較多，陽性母液長距離配送造成數(shù)量減少和桶裝水中銅綠假單胞菌分布不均勻等原因影響銅綠假單胞菌的計數(shù)結(jié)果，反饋結(jié)果只做定性分析。7家實驗室采用單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯(lián)合驗證銅綠假單胞菌檢測反饋結(jié)果統(tǒng)計見表2。結(jié)果顯示，除榆林市食品檢驗檢測中心實驗室A、B、C樣均檢出，檢出比為100%；其他實驗室A樣均未檢出，B、C樣均檢出，檢出比均為67%；總的檢出比為71%。其主要原因是銅綠假單胞菌不穩(wěn)定，水樣混合不夠均勻。另外，其他實驗對裝置的熟悉程度不同，導(dǎo)致低濃度A樣均未檢出，但B、C樣均檢出，說明裝置的檢出效果較好。

表2 7家實驗室銅綠假單胞菌檢出結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

通過單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置與不銹鋼過濾系統(tǒng)對銅綠假單胞菌檢測方法比較，以及單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置聯(lián)合驗證試驗反饋結(jié)果，由此可以說明單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置的可行性。聯(lián)合驗證最初的試驗設(shè)計時7家實驗室最終反饋定量的銅綠假單胞菌檢測結(jié)果，未達到預(yù)期目的原因分析有以下3點。

（1）母液濃度和穩(wěn)定性的問題。因銅綠假單胞菌在鹽水中不斷衰減，一直需要驗證，即使一次驗證完成后，濃度已經(jīng)又發(fā)生了變化，只能根據(jù)驗證結(jié)果，推算出大概濃度，所以無法確保濃度的準(zhǔn)確性。溫度、時間、長距離運輸?shù)韧庠跅l件對母液的影響，無法準(zhǔn)確推算出對銅綠假單胞菌產(chǎn)生的影響，保證不了母液的穩(wěn)定性，所以導(dǎo)致到達每個實驗室后銅綠假單胞菌數(shù)量不一致。

（2）銅綠假單胞菌制樣裝置的問題。裝置存在與實驗室現(xiàn)有抽濾裝置管路不匹配的問題，導(dǎo)致抽濾效果受影響。

（3）水樣的問題，水樣混合及均勻問題。陽性菌加入后，因桶裝純凈水的體積較大（18.9 L），沒有合適的混勻工具，只能靠人工手動盡量顛倒、旋轉(zhuǎn)進行混勻，不能保證水樣混合均勻，各實驗室間也存在差異。后續(xù)可與一些水廠合作，改進過濾裝置的同時，可實現(xiàn)水廠現(xiàn)場快速檢驗銅綠假單胞菌的試驗設(shè)想，形成簡單、易操作的相關(guān)操作規(guī)程。

近幾年，根據(jù)監(jiān)督抽檢和專項抽檢市場上的桶裝水檢測報告發(fā)現(xiàn)，微生物衛(wèi)生指標(biāo)不合格高于理化指標(biāo)，其中集中體現(xiàn)在銅綠假單胞菌超標(biāo)問題上，銅綠假單胞菌已成為桶裝水最突出的質(zhì)量安全問題。關(guān)于銅綠假單胞菌的耐藥性，以及對人體的毒害作用的報道不斷增多，控制桶裝水中銅綠假單菌污染問題已成為每一個桶裝水生產(chǎn)廠家急需解決的問題。通過對榆林市水廠的調(diào)研，分析了桶裝水從源頭到成品的每個環(huán)節(jié)，總結(jié)出了導(dǎo)致桶裝水中出現(xiàn)銅綠假單胞菌的原因，主要有4個方面。①生產(chǎn)企業(yè)對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)理解較少，多數(shù)水廠為保證水源的質(zhì)量，大多建設(shè)在市縣周邊的村鎮(zhèn)。企業(yè)工作人員食品安全意識淡薄，未進行相關(guān)檢驗培訓(xùn)，對銅綠假單胞菌的檢驗技術(shù)了解不夠。②水源污染問題，大部分生產(chǎn)企業(yè)多以淺層地下水或地表水為水源，均易受微生物污染。③桶裝水生產(chǎn)過程中管理控制不嚴格，生產(chǎn)環(huán)境不符合標(biāo)準(zhǔn)，機器設(shè)備設(shè)施的維護使用不到位，消毒劑使用劑量控制不合理等。④出廠檢驗執(zhí)行不到位。桶裝水生產(chǎn)企業(yè)除了要加強企業(yè)管理意識，還應(yīng)當(dāng)重視出廠檢驗的關(guān)鍵點控制。

本方法的建立可實現(xiàn)現(xiàn)場快速便捷地制備水質(zhì)微生物學(xué)檢驗樣本，避免敞開式環(huán)境污染，減少人員檢測過程中常規(guī)操作的工作強度，且解決了水樣檢測過程中傾倒液體、吸附轉(zhuǎn)移、濾膜過濾中繁雜的人工操作問題，還能夠提高實驗室外環(huán)境條件下的檢驗時效和工作效率。一種快速便捷的檢驗桶裝水中銅綠假單胞菌方法的建立，對榆林市桶裝水生產(chǎn)企業(yè)的管理控制起到積極監(jiān)管的作用。待單向負壓吸附取液微孔濾膜過濾裝置實現(xiàn)一次性無菌化生產(chǎn)，通過統(tǒng)一的檢驗操作培訓(xùn)，每一個水廠都可按批次要求出廠檢驗，及時發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，才能保證桶裝水的衛(wèi)生質(zhì)量，不僅可保障本市人民安全飲水，也可促進桶裝水生產(chǎn)企業(yè)的壯大發(fā)展。