牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響

杜珍珍，司琳清，李旭陽，徐鄭美，袁思琦，金吉東，原冬偉，付世新，周玉龍，魯文賡

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.科菲特飼料（長春）有限公司）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源于發(fā)育早期的中胚層，其在上世紀(jì)70年代被Friedenstein教授首次發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)[1]，它在1991年才被美國克利夫蘭西地大學(xué)Caplan教授正式命名為間充質(zhì)干細(xì)胞。而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是Zuk PA等[2]首次從脂肪血管周圍分離培養(yǎng)出來。

間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，是一類具有自我增殖能力、多譜系分化潛能、免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)組織損傷的多能干細(xì)胞。MSCs可以從脂肪組織和骨髓等組織器官中分離出來。它在特定條件下可以轉(zhuǎn)變成為一種或多種機(jī)體組織或器官的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞，胰腺細(xì)胞等[3]，其已在多種種屬動(dòng)物中成功分離并進(jìn)行研究，如小鼠、豬、犬、奶牛等。由于間充質(zhì)干細(xì)胞特殊的生物學(xué)特性，使得其成為研究熱點(diǎn)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有獲取容易、免疫原性低、無醫(yī)學(xué)倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)，使其成為了MSCs的重要來源。多種來源的MSCs都具有免疫調(diào)節(jié)能力，如骨髓來源MSCs、以及脂肪來源MSCs等，可以調(diào)節(jié)多個(gè)免疫系統(tǒng)的功能。為了發(fā)揮這種作用，MSCs必須被激活。MSCs可以抑制DC的成熟，從而抑制T淋巴細(xì)胞的過度活化，并可以降低NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性。由于這些特性，MSCs療法成為了在免疫相關(guān)疾病中具有潛力的替代療法。MSCs已用于臨床前和臨床研究以治療疾病，例如阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）[4]、膿毒血癥（Sepsis）[5]、多發(fā)性硬化（Multiple Sclerosis，MS）[6]和乳腺癌（breast cancer，BC）[7]的研究。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞已在各領(lǐng)域取得重大的研究成果，包括其在血液惡性疾病[8]、乳腺癌[9]、肺損傷[10]、心肌損傷[11]、肝癌[12]等的研究。間充質(zhì)干細(xì)胞不但擁有自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)功能，其還具有抗炎、抗氧化、促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[13]，其中旁分泌作用在近年來受到大量研究者廣泛關(guān)注及研究。

乳腺炎是一種炎癥反應(yīng)，其威脅著乳制品的安全與衛(wèi)生，更是嚴(yán)重威脅動(dòng)物福利。奶牛乳房感染是奶牛疾病中損失最大的疾病[14]，其特征是損傷了乳腺組織。這通常是由細(xì)菌感染引起的，全年均可發(fā)生，有明顯的季節(jié)性，不同的國家和地區(qū)奶牛乳腺炎的發(fā)病率也存在一定的差異。在國外，經(jīng)過多方面調(diào)查，人們（奶農(nóng)及獸醫(yī)）認(rèn)為奶牛乳腺炎是奶牛最疼痛的疾病，并將其按照疼痛等級(jí)進(jìn)行劃分（10分制），其中輕度乳腺炎為3，中度乳腺炎為5.7，重度乳腺炎為7.6[15]。當(dāng)動(dòng)物患乳腺炎時(shí)，動(dòng)物行為異常，采食及運(yùn)動(dòng)次數(shù)減少，躺臥時(shí)間延長，乳房紅腫等[16]。引起奶牛乳腺炎的病因較多，如病原菌的感染，環(huán)境因素，飼養(yǎng)管理不當(dāng)，牛體自身因素，遺傳因素，其他疾病影響。其中病原微生物的感染是奶牛乳腺炎主要的發(fā)病因素。多種不同的細(xì)菌和真菌都可引起乳腺炎，革蘭氏陰性大腸桿菌常常引起急性炎癥，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的乳腺炎[17]，革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌[18]則可能引起持續(xù)的、慢性的感染，引起輕度炎癥[19]。在很大程度上，針對(duì)這些病原體及物種的不同其宿主防御反應(yīng)的潛在機(jī)制也尚不清楚，持續(xù)的感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由于這些細(xì)菌病原體在農(nóng)場之間分布不同，并且根據(jù)病原體的特征，奶牛進(jìn)行有效免疫反應(yīng)的能力也有所不同。因此，了解哪些病原體可以引起奶牛發(fā)生乳腺炎，其對(duì)研究奶牛機(jī)體的有效免疫防護(hù)機(jī)制是非常重要的。

乳腺炎的歷史發(fā)展要從1947年，Murphy等[20]證實(shí)乳腺炎是由病原體入侵生物體導(dǎo)致的結(jié)果，隨后即是IMI的建立和炎癥的發(fā)展。在此之間，幾乎所有的奶牛乳腺炎都是由無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌引起的，根除病原菌是治療奶牛乳房炎重要的靶點(diǎn)，所以大多數(shù)治療方案最初都是針對(duì)這些病原體而研發(fā)的。這些治療推動(dòng)了應(yīng)用抗生素治療奶牛乳腺炎的發(fā)展，使得常規(guī)使用抗生素治療乳腺炎的方法得到了認(rèn)同[21]。由于無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌在1980年受到控制，但奶牛乳腺炎的患病率仍然很高，研究人員經(jīng)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎開始變得越來越普遍。并且隨著抗生素的濫用，使得金黃色葡萄球菌性乳腺炎在治療中發(fā)生了抗生素耐藥性，因此嚴(yán)格控制抗生素治療對(duì)奶牛乳腺炎是非常重要的。

在奶牛乳腺炎中最常見的病原體是大腸桿菌與金黃色葡萄球菌。革蘭氏陰性細(xì)菌釋放的脂多糖（LPS）被認(rèn)為是奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥的重要刺激因素[22]，可引起奶牛乳腺發(fā)生免疫反應(yīng)和炎癥。乳腺上皮細(xì)胞是乳腺中的主要細(xì)胞類型，它可以通過激活各種模式識(shí)別受體（PRR），Toll-like受體（TLR）和核苷酸寡聚域等，將LPS與病原體相關(guān)的分子模式分子結(jié)合[23]。通常，LPS與TLR或NLR的結(jié)合可導(dǎo)致順序的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致炎癥。核因子-κB（NF-κB）是與奶牛乳腺炎發(fā)展相關(guān)的炎癥關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它還是TLRs和其他免疫受體的下游信號(hào)分子。LPS誘導(dǎo)的經(jīng)典TLR4/NF-κB通路的激活會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL-1β，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6的上調(diào)，這些炎性介質(zhì)參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并具有全身作用[24]。

當(dāng)病原體侵入奶牛乳房時(shí)，可引起局部針對(duì)病原微生物的先天免疫防御系統(tǒng)。乳腺上皮除了具有生產(chǎn)牛奶的功能外，乳腺上皮還配備了一系列感受器，可檢測(cè)病原體的分子成分，乳腺上皮細(xì)胞已被證實(shí)能夠啟動(dòng)對(duì)病原菌的體外先天免疫應(yīng)答[24]。在這些模式識(shí)別受體（PPR）中，哺乳動(dòng)物中已經(jīng)詳細(xì)的描述了13種不同的TLR[25]。如TLR2與金黃色葡萄球菌的相互作用可導(dǎo)致各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑如NFκB和MAPK迅速而協(xié)調(diào)地激活[26]。NF-κB和MAPK信號(hào)通路負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，趨化因子的表達(dá)，是炎癥過程中必不可少的免疫介質(zhì)[27]。在先前的硒對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞研究中，表明在用LPS處理細(xì)胞后，硒對(duì)乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生有益作用，是因?yàn)槲梢酝ㄟ^抑制NF-κB和MAPK活化來抑制LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[28]。而在另一項(xiàng)研究中，將TNF-α刺激MAC-T細(xì)胞作為炎癥模型，TNFα對(duì)MAC-T細(xì)胞中的炎癥作用也是通過促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的，該信號(hào)通路涉及c-Jun N-末端激酶（JNK），細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38[29]。研究表明所有這三種MAPK的蛋白磷酸化均會(huì)刺激趨化蛋白的釋放，從而觸發(fā)免疫細(xì)胞從血液向乳腺的遷移[29]。

在奶牛乳腺炎的治療中常?？梢娀疾∨１憩F(xiàn)出牛奶或奶牛自身可見的異常，病牛的牛奶必須棄去。在農(nóng)場中，大多數(shù)的乳腺炎病例僅表現(xiàn)為輕度（牛奶異常）或中度癥狀，治療人員對(duì)這些不嚴(yán)重癥狀通常不及時(shí)進(jìn)行治療[30]。在國內(nèi)目前常使用中藥、抗生素、皮質(zhì)類激素、細(xì)菌素、有益菌、物理療法等方法進(jìn)行治療。且國內(nèi)農(nóng)場在臨床中治療乳腺炎時(shí)，輕微的乳房發(fā)紅癥狀，會(huì)常被忽略，當(dāng)癥狀進(jìn)一步加重時(shí)，會(huì)采取以上的方式進(jìn)行治療。乳腺炎是常見病，但治療的效果卻大不相同，抗生素的廣泛使用，使得多數(shù)乳腺炎病例耐藥性明顯增加，多數(shù)乳腺炎在治愈后常常導(dǎo)致奶牛泌乳能力極度下降，乳腺受損嚴(yán)重，且易復(fù)發(fā)，針對(duì)此后遺癥，目前國內(nèi)還沒有效果顯著的治療方案。在北美，大多數(shù)非嚴(yán)重乳腺炎的治療均由農(nóng)場工人進(jìn)行，獸醫(yī)監(jiān)督。對(duì)此病的治療也是使用抗生素治療，旨在控制乳腺的細(xì)菌感染。然而，這種方法并不總是有效的，抗生素使用不當(dāng)可能導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性。青霉素抗性可能是金黃色葡萄球菌最廣為人知的抗生素耐藥性，各國之間的水平差別很大，從20%到30%甚至超過85%不等[31]。此外，抗生素治療不會(huì)促進(jìn)奶牛乳腺組織的再生，因此，奶牛乳腺炎的治療變愈加困難。

MSCs在人類疾病的治療中，在損傷修復(fù)、腫瘤、炎癥方面已進(jìn)行了大量的研究。但是MSCs對(duì)于奶牛產(chǎn)業(yè)上的研究報(bào)道卻比較少。據(jù)報(bào)道Berly等[31]在2019年發(fā)表了關(guān)于牛胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)引起乳腺炎的病原體金黃色葡萄球菌抗增殖作用，他們利用胎牛骨髓來源的MSCs的條件培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抗菌潛力進(jìn)行了評(píng)估，得出了來自胎牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基在體外條件下具有平均降低約30%金黃色葡萄球菌相對(duì)生長的能力。這些都表明了MSCs抑菌應(yīng)用的潛力。而成年奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于金黃色葡萄球菌的作用尚不明確，因此，對(duì)成年奶牛脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)奶牛乳腺炎病原體金黃色葡萄球菌的作用進(jìn)行了研究，為尋找安全可開發(fā)的制劑去替代抗生素的治療方法提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

金黃色葡萄球菌菌株來自臨床奶牛乳腺炎病例的乳樣品；TSB培養(yǎng)基（美國BD公司）；營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（四季青）；P/S（碧云天）；DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY）；0.25%胰酶（中國，北京索萊寶）；奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室原代提取[11]）

1.2 金黃色葡萄球菌的純化與鑒定

取乳腺炎病例奶牛的乳樣，在4℃離心機(jī)中離心15 000 xg，1 min，棄除上層乳脂乳蛋白，將沉淀接種于營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)24 h。挑選出金黃色葡萄球菌菌落，在37℃恒溫?fù)u床中搖菌18 h，進(jìn)行1010倍比稀釋，取100 mL涂于固體營養(yǎng)瓊脂板中培養(yǎng)24 h。根據(jù)金黃色葡萄球菌生長狀態(tài)及特征，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，判斷其純化情況。

1.3 奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇

將液氮中第3代的奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在37℃水浴鍋中快速復(fù)蘇。取含1%P/S、10%FBS胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)凍存管內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1 000 xg，離心3 min，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/個(gè)·mL-1復(fù)蘇于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)。每24 h更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。

金黃色葡萄球菌從-80℃超低溫冰箱中取出，在37℃水浴鍋中快速復(fù)蘇。4℃離心機(jī)中15 000 xg，離心1 min，棄除金黃色葡萄球菌離心后上清液，取金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)瓊脂中，培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落在37℃恒溫?fù)u床中搖菌18 h，制成一級(jí)菌液，繼續(xù)取1%金黃色葡萄球菌菌液接種于新的液體TSB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床中搖晃18 h，制成二級(jí)菌液備用。

1.4 金黃色葡萄球菌群落數(shù)的確定

取震蕩培養(yǎng)18 h的二級(jí)菌液1 mL，經(jīng)PBS洗兩次，4℃離心機(jī)中15 000 xg，離心1 min，棄上清，用1 mL PBS重懸金黃色葡萄球菌。并加入到比色皿中，分光光度計(jì)測(cè)OD600nm值。進(jìn)行倍比稀釋，取100 mL金黃色葡萄倍比稀釋菌液進(jìn)行涂板培養(yǎng)18～24 h后，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5 金黃葡萄球菌生長曲線的測(cè)定

根據(jù)最終金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的確定，在含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入300 CFU金黃色葡萄球菌，分別培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18 h后，在不同時(shí)間段測(cè)量金黃色葡萄球菌的OD600nm值，根據(jù)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.6 奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)

將融合度達(dá)80%～90%的奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞數(shù)接種于24孔中的一個(gè)孔內(nèi)，取培養(yǎng)24 h上清液后，更換為新的DMEM/F12（10%FBS，無雙抗）培養(yǎng)基。將奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h上清液進(jìn)行離心15 000 xg，1 min，取上清備用。將實(shí)驗(yàn)分為三組，無細(xì)胞DMEM/F12培養(yǎng)基組（10%FBS，無雙抗），奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組，無奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)后上清液組。在24孔中的每個(gè)孔中各加入1 mL培養(yǎng)體系，每個(gè)孔內(nèi)加入300 CFU的金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)12 h后，取100μL培養(yǎng)物涂于固體營養(yǎng)瓊脂板中，培養(yǎng)18～24 h后計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，將金黃色葡萄球菌體外增殖情況數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0（加利福尼 亞州圣地亞哥的GraphPad InStat軟件）進(jìn)行分析，進(jìn)行正態(tài)性測(cè)試。并通過單向ANOVA比較每個(gè)重復(fù)的平均值。使用Tukey多重比較檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照之間金黃色葡萄球菌的相對(duì)生長，然后進(jìn)行方差齊性校正。結(jié)果用平均值±SEM來表示。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌鑒定

眼觀：培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌菌落呈現(xiàn)圓形或橢圓形扁平狀菌落，菌落顏色呈現(xiàn)金黃色（圖1B）。鏡檢：對(duì)金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色油鏡鏡檢，革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)藍(lán)紫色，為陽性，細(xì)菌呈現(xiàn)球狀均勻分布（圖1A）。

2.2 金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌在TSB培養(yǎng)基中搖菌18 h，OD600nm=0.5進(jìn)行1010倍比稀釋時(shí)，金黃色葡萄球菌為2.42×1011CFU·mL-1（圖2）。

圖2 金黃色葡萄球菌OD600 nm值與其菌落數(shù)Fig.2 Staphylococcus aureus OD600nm value and its colony number

2.3 金黃色葡萄球菌生長曲線測(cè)定

當(dāng)金黃色葡萄球菌在DMEM/F12（10%FBS，無雙抗）中培養(yǎng)2～10 h時(shí)，細(xì)菌測(cè)得的OD600nm的OD值無較大變化，當(dāng)培養(yǎng)12 h時(shí)細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，金黃色葡萄球菌快速增殖，而18 h時(shí)仍處于對(duì)數(shù)生長期（圖3）。

圖3 金黃色葡萄球菌在細(xì)胞用培養(yǎng)基DMEM/F12中的生長曲線Fig.3 Growth curve of Staphylococcus aureus in cell culture medium DMEM/F12

2.4 奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)結(jié)果

金黃色葡萄球菌與奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，從培養(yǎng)體系中取出100 mL進(jìn)行涂板，結(jié)果顯示與DMEM/F12對(duì)照組相比，奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞顯著抑制金黃色葡萄球菌體外增殖（*P<0.05）（圖4A、B），而奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的生長抑制作用極顯著（***P<0.001）（圖4C）。而與奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相比，奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h上清液對(duì)金黃色葡萄球菌體外增殖較為顯著抑制（**P<0.01）（圖4B、C）。成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有顯著的抑制金黃色葡萄球菌體外增殖的作用（圖4D）。

圖4 成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后金黃色葡萄球菌體外增殖情況Fig.4 In vitro proliferation of Staphylococcus aureus after co-culture of adult dairy cow adipose-derived mesenchymal stem cells and Staphylococcus aureus

3 討論

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來自實(shí)驗(yàn)室先前進(jìn)行原代提取的細(xì)胞[32]。在以前的研究中報(bào)道了胎牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞濃縮上清培養(yǎng)液具有抑制金黃色葡萄球菌的作用[31]，而在研究中未濃縮的成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞也表現(xiàn)出與胎牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相似的抑制細(xì)菌體外增殖的能力，這可能與細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞的分泌能力有關(guān)，而實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞活性較好，旁分泌能力強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力也較強(qiáng)。除此之外，為證明奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的生長影響，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用從臨床奶牛乳腺炎病例乳樣本中分離出來的金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，并根據(jù)金黃色葡萄球菌的生長特征及革蘭氏染色進(jìn)行了鑒定，確定了分離出細(xì)菌的為金黃色葡萄球菌，并進(jìn)行了下一步研究。為了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，首先確定金黃色葡萄球菌在TSB培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與OD600nm值，得出金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h時(shí)菌落數(shù)為2.42×1011CFU，根據(jù)OD600nm值與菌落數(shù)，計(jì)算出300 CFU的金黃色葡萄球菌。其次將金黃色葡萄球菌加入到DMEM/F12培養(yǎng)基中，測(cè)定金黃色葡萄球菌在DMEM/F12中的生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。當(dāng)金黃色葡萄球菌在DMEM/F12培養(yǎng)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，細(xì)菌活性及增殖能力較強(qiáng)。當(dāng)將金黃色葡萄球菌加入到奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中時(shí)，金黃色葡萄球菌進(jìn)入到了新的培養(yǎng)體系，繼續(xù)進(jìn)行新的生長增殖過程。因此，選用培養(yǎng)12 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)的金黃色葡萄球菌來研究奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)它的體外增殖影響。結(jié)果顯示成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出了抑制金黃色葡萄球菌體外增殖的能力，這可能是奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)12 h時(shí)已經(jīng)分泌了抑制金黃色葡萄球菌的抗菌肽。在以前的研究中，報(bào)道了人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于大腸桿菌、化膿性鏈球菌等增殖的影響，得出當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞在遇到細(xì)菌時(shí)，其激活了間充質(zhì)干細(xì)胞分泌抗菌肽的能力[17]。而在實(shí)驗(yàn)中，奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h上清液組表現(xiàn)出比奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組更為顯著的抑制細(xì)菌體外增殖的能力，推測(cè)可能是奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)24 h時(shí)已經(jīng)分泌了足夠的某種抗菌肽，這種抗菌肽在奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)12 h時(shí)的表達(dá)沒有比奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)分泌的多，這可能是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液組抑制細(xì)菌體外增殖的主要原因。目前為止，得知間充質(zhì)干細(xì)胞具有分泌β-防御素，bBD4A，NK-1等抗菌肽[33]，而在研究中并未對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。但實(shí)驗(yàn)中奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的這種抑制細(xì)菌體外增殖的能力，推測(cè)也是因其分泌了某種抗菌肽而產(chǎn)生的，具體是何種抗菌肽發(fā)揮的這種抑制細(xì)菌增殖的作用，將在未來的研究中對(duì)奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的這種抑制細(xì)菌增殖的能力進(jìn)行深入的探討與研究。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌處于對(duì)數(shù)生長期且體外生長狀態(tài)較好，當(dāng)將金黃色葡萄球菌與成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，成體奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出可以顯著降低金黃色葡萄球菌體外增殖的作用，并且奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h上清液表現(xiàn)出更為顯著有效的抑制臨床奶牛乳腺炎來源的病原體金黃色葡萄球菌的體外增殖。