• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    銅綠假單胞菌中exoU、lasI基因的表達及耐藥性研究

    2022-03-03 07:03:58張潔莉王麗霞安靜劉丹丹翟文霞吳琳乾李妤蓉
    微生物與感染 2022年5期
    關(guān)鍵詞:銅綠毒力單胞菌

    張潔莉,王麗霞,安靜,劉丹丹,翟文霞,吳琳乾,李妤蓉

    邢臺醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院檢驗科,河北 邢臺 054000

    銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是臨床上最常見的致病菌之一,常在機體免疫力低下時導(dǎo)致各種急慢性感染,其院內(nèi)感染發(fā)生率在革蘭氏陰性菌中居前列,并呈逐年上升的趨勢[1]。銅綠假單胞菌多重耐藥導(dǎo)致臨床抗感染治療難度增加,而其感染的發(fā)生發(fā)展與其表達的多種毒力因子密切相關(guān)[2]。研究證實,Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)參與了銅綠假單胞菌的感染和致病過程,且T3SS分泌的多種效應(yīng)蛋白多與急性感染有關(guān)。ExoU、ExoS、ExoT、ExoY是T3SS分泌的4種主要效應(yīng)蛋白,特別是ExoU和ExoS的表達水平與感染和炎癥的程度相關(guān),對預(yù)后有顯著影響[3]。此外,群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing,QS)廣泛存在于銅綠假單胞菌,對其多種毒力基因表達有調(diào)控作用。Las系統(tǒng)是QS的重要組成部分,可調(diào)控外毒素A(exotoxin A)、LasA蛋白酶、堿性蛋白酶(alkaline protease)等多種蛋白及酶的合成,與細菌的致病性和耐藥性密切相關(guān)[4]。因此,抑制QS進而對毒力因子釋放進行有效調(diào)控,已成為銅綠假單胞菌感染治療的重要研究方向。本研究通過分析銅綠假單胞菌中exoU、lasI基因表達差異與其耐藥性之間的關(guān)系,以期為臨床合理用藥及抗感染藥物研發(fā)提供新的方向。

    1 材料和方法

    1.1 菌株來源

    選取2019年6月—2020年12月邢臺醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院收集和分離的640株銅綠假單胞菌,分別來自痰液標本(330株)、血液標本(142株)、膿液標本(97株)、穿刺液標本(23株)、引流液標本(36株)、膽汁標本(12株)。所有標本均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)標準[5]進行驗證,且將重復(fù)和不合格樣本剔除。陽性質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853(購自溫州市康泰生物科技有限公司)。

    1.2 菌株鑒定與藥敏試驗

    采用BD PhoenixTM-100全自動微生物分析儀(美國BD公司)鑒定所有銅綠假單胞菌。采用瓊脂稀釋法檢測銅綠假單胞菌對常用抗生素的敏感性,藥敏試驗過程和結(jié)果均參照美國臨床和實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準。

    1.3 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)

    采用細菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA作為模板,并根據(jù)特異性引物進行PCR擴增。PCR引物序列均參考相關(guān)文獻設(shè)計并委托上海華大基因科技有限公司合成制備,引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系共25 μL,主要包括2.5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL dNTP混合物,以及濃度均為10 mmol/L的0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物,另加入16.9 μL無菌雙蒸水、濃度為5 U/μL的0.1 μL DNA聚合酶和2.0 μL DNA模板。

    PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 1 min,退火30 s(exoU、exoS、lasI退火溫度分別為58 ℃、54 ℃、56 ℃),72 ℃ 1 min,循環(huán)35次;72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行凝膠成像并觀察。

    1.4 熒光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)檢測毒力基因表達

    參照RNA提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)說明書提取銅綠假單胞菌總RNA,取1 μg用 PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后按SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)說明書進行熒光qPCR,內(nèi)參為rpoD基因。采用2-ΔΔct計算目標基因的相對表達量(relative quantification,RQ)[6]。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    表1 PCR引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 lasI、exoS、exoU基因片段擴增成功

    利用瓊脂糖凝膠電泳對lasI、exoS、exoU基因片段的PCR擴增產(chǎn)物進行檢測,目的基因條帶大小正確,檢測結(jié)果如圖1所示。

    2.2 不同來源銅綠假單胞菌中各基因分布特征

    640株銅綠假單胞菌主要來自痰液(51.56%)、血液(22.19%)及膿液(15.16%)標本。exoS+/exoU-基因組合在各標本中均檢出率最高,其在痰液、血液和膿液標本中的檢出率分別為56.97%(188/330)、71.83%(102/142)和67.01%(65/97)。結(jié)果如表2所示。

    2.3 不同來源銅綠假單胞菌的藥敏試驗結(jié)果

    藥敏試驗結(jié)果顯示,640株銅綠假單胞菌對10種抗菌藥物均有不同程度的耐藥,且痰液來源的菌株對亞胺培南的耐藥率高于血液、膿液及其他來源的菌株(P<0.001)。結(jié)果如表3所示。

    M: Marker; Lane 1: lasI gene-negative control; Lanes 2-4: lasI gene; Lane 5: exoS gene-negative control; Lanes 6-8: exoS gene; Lane 9: exoU gene-negative control; Lanes 10-12: exoU gene.

    表2 不同標本來源銅綠假單胞菌中各基因分布特征

    表3 不同標本來源銅綠假單胞菌的耐藥性比較

    2.4 不同基因型銅綠假單胞菌的耐藥性比較

    攜帶exoU銅綠假單胞菌對亞胺培南,慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星等氨基糖苷類,左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類,以及阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物均具有較高的耐藥率(P<0.001),攜帶exoS的銅綠假單胞菌對氨曲南具有較高的耐藥率(P<0.05),lasI缺失的銅綠假單胞菌對各抗菌藥物的耐藥率顯著降低(P<0.001)。結(jié)果如表4所示。

    2.5 基因表達水平及相關(guān)性分析

    實時熒光qPCR結(jié)果顯示,exoU缺失(exoU-)后,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達水平較于exoU未缺失(exoU+)下降(P=0.025,0.013,見圖2);172株攜帶exoU的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達水平與exoU的表達水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.645,r2=0.416,P<0.001;r=-0.587,r2=0.345,P<0.001,詳見圖3);423株攜帶exoS的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達水平與exoS的表達水平也呈顯著負相關(guān)(r=-0.618,r2=0.382,P<0.001;r=-0.532,r2=0.283,P<0.001,詳見圖4)。lasI缺失后,其下游毒力基因lasA、aprX表達水平顯著降低(P<0.001,見圖5),且lasA、aprX的表達水平與lasI表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.489,r2=0.239,P<0.001;r=0.512,r2=0.262,P<0.001)。具體結(jié)果如圖6所示。

    表4 不同基因型銅綠假單胞菌的耐藥性比較

    圖2 exoU+與exoU-銅綠假單胞菌中ptrA和exsA的表達水平

    圖3 ptrA、exsA表達水平與exoU表達水平的相關(guān)性

    圖4 ptrA、exsA表達水平與exoS表達水平的相關(guān)性

    *P<0.001 compared with lasI+ group.

    3 討論

    銅綠假單胞菌是廣泛存在于人體皮膚以及呼吸道的致病菌,在機體抵抗力低下時可誘發(fā)感染和炎癥反應(yīng)。隨著抗生素的大量和廣泛使用,其耐藥性呈上升趨勢,且耐藥機制較為復(fù)雜[7]。T3SS作為銅綠假單胞菌與外界交流、獲取所需養(yǎng)分及將分泌的毒性蛋白傳輸至外界環(huán)境的重要途徑,可分泌包括ExoU、ExoS在內(nèi)的多種效應(yīng)蛋白,從而發(fā)揮致病作用[8]。 ExoU 能導(dǎo)致細胞膜發(fā)生快速損傷和壞死,且具有腺苷酸環(huán)化酶及磷脂酶活性,是T3SS中最具破壞性的細菌毒素[9]。ExoS可顯著抑制宿主細胞的吞噬作用,導(dǎo)致細胞凋亡,其毒力僅次于ExoU,還具有二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶活性[10]。這兩種主要毒力因子的表達對感染的嚴重程度和預(yù)后具有決定性作用。本研究的640株銅綠假單胞菌主要來源于痰液(51.56%)、血液(22.19%)及膿液(15.16%)標本。exoS+/exoU-基因組合在各標本中均檢出率最高,其在痰液、血液和膿液標本中的檢出率分別為56.97%(188/330)、71.83%(102/142)和67.01%(65/97),提示銅綠假單胞菌毒力基因表達與感染部位之間無明顯的相關(guān)性。

    圖6 lasA、aprX表達水平與lasI表達水平的相關(guān)性

    國外研究表明,ExoU不僅會引起宿主細胞發(fā)生損傷,使感染病灶中的銅綠假單胞菌大量繁殖,還能促使其他條件致病菌引發(fā)進一步的雙重感染,從而加重病情,影響預(yù)后[11-12]。細菌毒力基因常與其耐藥性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),640株銅綠假單胞菌對10種抗菌藥物均有不同程度的耐藥,且痰液來源的銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率高于血液、膿液及其他來源的菌株(P<0.001)。攜帶exoU的銅綠假單胞菌對亞胺培南,慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星等氨基糖苷類,左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類,以及阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物均具有較高的耐藥率(P<0.001),耐藥率40%以上;攜帶exoS的銅綠假單胞菌對氨曲南具有較高的耐藥率(P<0.05)。攜帶exoS或exoU的銅綠假單胞菌對哌拉西林/他唑巴坦及頭孢吡肟的耐藥率均低于20%,可考慮將此類藥物作為本地區(qū)銅綠假單胞菌感染的經(jīng)驗性治療藥物。值得關(guān)注的是,很少有研究報道攜帶exoU的銅綠假單胞菌對氨基糖苷類的耐藥性,這可能是因為不同地區(qū)的抗生素使用習(xí)慣不同,導(dǎo)致細菌耐藥性存在一定的差異,這可能與細菌基因位點變異有關(guān),但具體機制須進一步探討[13]。目前,關(guān)于T3SS分泌的效應(yīng)蛋白表達調(diào)控機制的研究不多。銅綠假單胞菌中T3SS基因表達主要受轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ExsA的調(diào)控,而PtrA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14]。本研究發(fā)現(xiàn),攜帶exoU或exoS基因的銅綠假單胞菌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達與exoU或exoS的表達呈顯著負相關(guān)(P<0.001)。ptrA基因過表達時,會明顯抑制exoU、exoS的表達,且exsA的表達也明顯下降,提示PtrA可能通過調(diào)節(jié)ExsA表達而影響ExoU、ExoS等的表達,從而推測T3SS可能通過調(diào)控ptrA等負調(diào)控基因的表達來調(diào)節(jié)相關(guān)效應(yīng)蛋白的表達[15]。

    銅綠假單胞菌QS具有調(diào)控300多個毒力基因的能力,與細菌生物被膜形成及細菌致病性密切相關(guān)。研究證實,抑制銅綠假單胞菌QS可有效降低細菌的致病性及耐藥程度[16],已成為目前臨床細菌感染治療及耐藥性研究的重點。Las系統(tǒng)作為QS的重要組成部分,主要由lasI、lasR基因構(gòu)成[17]。稅劍等[18]的研究證實,缺乏lasI、lasR基因的銅綠假單胞菌的成膜能力顯著下降,甚至不能形成生物膜,從而其對常規(guī)抗菌藥物的敏感性大大提高。本研究結(jié)果顯示,lasI缺失的銅綠假單胞菌對各類抗菌藥物的耐藥率顯著降低(P<0.001),與鄂順梅等[19]的研究結(jié)果一致。本文進一步研究發(fā)現(xiàn),lasI缺失的銅綠假單胞菌下游毒力基因lasA、aprX的表達水平顯著降低(P<0.001),且lasA、aprX的表達水平與lasI表達水平顯著正相關(guān)(r=0.489,P<0.001;r=0.512,P<0.001),提示Las系統(tǒng)對其下游毒力基因具有一定的正反饋調(diào)節(jié)作用。銅綠假單胞菌QS具有級聯(lián)調(diào)控和反饋機制:Las系統(tǒng)處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)頂端,在感受到刺激信號后最先啟動激活,并促使lasI表達上調(diào)。因此,Las系統(tǒng)為QS的正向調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控下游毒力基因的表達[19-20]。

    綜上所述,exoU表達與銅綠假單胞菌的耐藥性顯著相關(guān),ptrA可能是exoU表達的潛在負調(diào)控基因,而lasI缺失會明顯抑制銅綠假單胞菌QS毒力基因的表達及耐藥性的產(chǎn)生。

    猜你喜歡
    銅綠毒力單胞菌
    12種殺菌劑對三線鐮刀菌的室內(nèi)毒力測定
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:04
    阿維菌素與螺螨酯對沾化冬棗截形葉螨的毒力篩選及田間防效研究
    槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:21
    持續(xù)性根尖周炎中牙齦卟啉單胞菌的分離與鑒定
    共代謝基質(zhì)促進銅綠假單胞菌降解三十六烷的研究
    水稻白葉枯病菌Ⅲ型效應(yīng)物基因hpaF與毒力相關(guān)
    銅綠假單胞菌金屬酶及整合酶的檢測
    齊口裂腹魚腸道氣單胞菌的分離鑒定
    銅綠假單胞菌的分布及耐藥性分析
    表皮葡萄球菌感染的相關(guān)毒力因子概述
    久久热在线av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 在线av久久热| 嫩草影视91久久| 国产麻豆69| 悠悠久久av| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品第二区| 久久免费观看电影| 又黄又粗又硬又大视频| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利视频精品| 国产精品一区二区在线观看99| 大码成人一级视频| 美女午夜性视频免费| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩电影二区| 午夜激情久久久久久久| 成年动漫av网址| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品亚洲成国产av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩大片免费观看网站| 日韩视频在线欧美| 免费av中文字幕在线| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品高清国产在线一区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜福利视频精品| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产免费现黄频在线看| 人妻人人澡人人爽人人| 精品福利永久在线观看| 不卡av一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 天堂俺去俺来也www色官网| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲综合色网址| 麻豆国产av国片精品| e午夜精品久久久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 午夜激情久久久久久久| 国产在线视频一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 成人手机av| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 色视频在线一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日本91视频免费播放| 精品少妇内射三级| svipshipincom国产片| 午夜老司机福利片| 美女大奶头黄色视频| 久久久国产精品麻豆| 午夜激情av网站| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲人成网站在线观看播放| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产亚洲av高清不卡| 精品久久久久久电影网| 国产av一区二区精品久久| 国产成人a∨麻豆精品| 久久99一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 少妇人妻 视频| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕av电影在线播放| 大话2 男鬼变身卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人国产av品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 成人国产一区最新在线观看 | 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av男天堂| 亚洲精品一二三| 亚洲国产最新在线播放| 日韩大码丰满熟妇| 午夜福利视频在线观看免费| 制服人妻中文乱码| 国产高清不卡午夜福利| 少妇 在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 青春草视频在线免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产精品偷伦视频观看了| 精品亚洲成a人片在线观看| 青青草视频在线视频观看| 日本a在线网址| 晚上一个人看的免费电影| 一边亲一边摸免费视频| 国产一区二区激情短视频 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美xxⅹ黑人| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日本wwww免费看| 日韩欧美一区视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一个人免费看片子| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 搡老岳熟女国产| 大片免费播放器 马上看| 欧美精品一区二区免费开放| 精品一品国产午夜福利视频| 99久久综合免费| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩电影二区| 最近手机中文字幕大全| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久天堂一区二区三区四区| 老司机亚洲免费影院| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲精品日本国产第一区| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 黄色一级大片看看| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av男天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 另类精品久久| 大话2 男鬼变身卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产最新在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国精品久久久久久国模美| 色视频在线一区二区三区| 中国国产av一级| 国产一区二区 视频在线| 青草久久国产| 人妻一区二区av| 国产亚洲一区二区精品| 中国国产av一级| 免费人妻精品一区二区三区视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜免费成人在线视频| 成年动漫av网址| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久青草综合色| 日韩一本色道免费dvd| 天天影视国产精品| 久久人人爽人人片av| 悠悠久久av| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 又大又黄又爽视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产精品一区二区精品视频观看| 最新在线观看一区二区三区 | 啦啦啦 在线观看视频| 热re99久久精品国产66热6| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲一区中文字幕在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产三级黄色录像| 黄色 视频免费看| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 十分钟在线观看高清视频www| 视频区欧美日本亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 又大又爽又粗| 亚洲精品一二三| 日韩一区二区三区影片| 青春草亚洲视频在线观看| 18在线观看网站| 蜜桃在线观看..| 另类精品久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 黄频高清免费视频| 赤兔流量卡办理| 婷婷色av中文字幕| 精品少妇内射三级| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 宅男免费午夜| 日韩一本色道免费dvd| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机影院毛片| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品第二区| 日日夜夜操网爽| 中文字幕色久视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 大码成人一级视频| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久精品免费免费高清| 午夜激情av网站| 一级毛片女人18水好多 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美精品av麻豆av| 欧美日韩一级在线毛片| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产又色又爽无遮挡免| 午夜精品国产一区二区电影| 美国免费a级毛片| 多毛熟女@视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产有黄有色有爽视频| 国产不卡av网站在线观看| 超碰97精品在线观看| av电影中文网址| 久久国产精品人妻蜜桃| 性少妇av在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产日韩欧美亚洲二区| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 91麻豆av在线| 欧美日韩一级在线毛片| 大型av网站在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女视频免费永久观看网站| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品偷伦视频观看了| 男女之事视频高清在线观看 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜av观看不卡| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品.久久久| a级片在线免费高清观看视频| 丝袜喷水一区| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品第二区| 欧美性长视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品欧美亚洲77777| av片东京热男人的天堂| 成人手机av| 母亲3免费完整高清在线观看| 一区二区av电影网| 午夜福利视频精品| 久热爱精品视频在线9| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲第一av免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久9热在线精品视频| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久久久久久久久大奶| 精品人妻1区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 国产人伦9x9x在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产国语露脸激情在线看| 国产色视频综合| 日韩av在线免费看完整版不卡| 黄频高清免费视频| 天天添夜夜摸| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜福利一区二区在线看| 国产又爽黄色视频| 久久久国产欧美日韩av| 国产一级毛片在线| 激情视频va一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 五月天丁香电影| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲第一青青草原| 午夜福利一区二区在线看| 精品一区二区三卡| tube8黄色片| 久久久久久久国产电影| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 人妻人人澡人人爽人人| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丁香六月欧美| 免费在线观看日本一区| 黄色a级毛片大全视频| 9色porny在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美精品av麻豆av| 国产片内射在线| 国产激情久久老熟女| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久久视频综合| 国产97色在线日韩免费| av片东京热男人的天堂| av片东京热男人的天堂| 欧美黄色淫秽网站| 少妇的丰满在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产一区二区在线观看av| 极品人妻少妇av视频| 日本wwww免费看| av片东京热男人的天堂| 成人国语在线视频| 精品久久蜜臀av无| 少妇的丰满在线观看| 婷婷丁香在线五月| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜久久久在线观看| 精品一区在线观看国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美久久黑人一区二区| 国产一区二区 视频在线| 日本av手机在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 午夜日韩欧美国产| 一本大道久久a久久精品| 在现免费观看毛片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲中文字幕日韩| 欧美成人精品欧美一级黄| 自线自在国产av| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美97在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 尾随美女入室| 黄色视频不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 国产av精品麻豆| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 麻豆av在线久日| 国产精品一国产av| 国产成人av教育| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美久久黑人一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩 亚洲 欧美在线| 美女视频免费永久观看网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女午夜性视频免费| 18禁国产床啪视频网站| av有码第一页| 高清黄色对白视频在线免费看| 只有这里有精品99| 国产一区二区在线观看av| 日韩av免费高清视频| 欧美大码av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩电影二区| 美女主播在线视频| 国产1区2区3区精品| 嫩草影视91久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产成人a∨麻豆精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成年人免费黄色播放视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 十八禁网站网址无遮挡| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品久久久久久精品古装| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品999| 久久中文字幕一级| 亚洲美女黄色视频免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| bbb黄色大片| 校园人妻丝袜中文字幕| av欧美777| 国产成人91sexporn| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久免费观看电影| www日本在线高清视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久久久久免费视频了| 午夜视频精品福利| 久久精品成人免费网站| 一区二区三区乱码不卡18| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 中文欧美无线码| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产在线观看jvid| 大型av网站在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 另类精品久久| 国产人伦9x9x在线观看| 国产av精品麻豆| 亚洲精品国产一区二区精华液| 老司机深夜福利视频在线观看 | 18在线观看网站| 精品国产国语对白av| 国产淫语在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 美女视频免费永久观看网站| 午夜av观看不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 69精品国产乱码久久久| 好男人电影高清在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 韩国高清视频一区二区三区| 男人操女人黄网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜两性在线视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲av男天堂| 久久久精品94久久精品| 天堂8中文在线网| 日本欧美国产在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| videosex国产| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品福利观看| 亚洲成人国产一区在线观看 | 国精品久久久久久国模美| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜精品国产一区二区电影| 美女午夜性视频免费| 黄色一级大片看看| 蜜桃国产av成人99| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 五月天丁香电影| 亚洲精品一二三| 七月丁香在线播放| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕色久视频| 热99国产精品久久久久久7| 美女中出高潮动态图| 成人手机av| av不卡在线播放| 国产欧美亚洲国产| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品久久久久久精品古装| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜免费成人在线视频| 美女主播在线视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| www.av在线官网国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲国产精品国产精品| 中国美女看黄片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美人与善性xxx| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲熟女毛片儿| 天堂中文最新版在线下载| 日日夜夜操网爽| 久久亚洲精品不卡| 久久这里只有精品19| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久欧美国产精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产成人a∨麻豆精品| 97在线人人人人妻| 九草在线视频观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久热爱精品视频在线9| videosex国产| 久久影院123| 丝瓜视频免费看黄片| 人体艺术视频欧美日本| √禁漫天堂资源中文www| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品人妻久久久影院| av视频免费观看在线观看| 欧美另类一区| 考比视频在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 午夜福利免费观看在线| 婷婷色综合www| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品第二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 乱人伦中国视频| 久久精品成人免费网站| 两个人看的免费小视频| 日本五十路高清| cao死你这个sao货| xxx大片免费视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产三级黄色录像| a级片在线免费高清观看视频| 国产黄频视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 另类精品久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 嫁个100分男人电影在线观看 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产国语露脸激情在线看| 妹子高潮喷水视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 黄色片一级片一级黄色片| 国产日韩欧美在线精品| 人人澡人人妻人| 欧美日韩综合久久久久久| 色播在线永久视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲少妇的诱惑av| 激情五月婷婷亚洲| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成年人午夜在线观看视频| 男人操女人黄网站| 男人添女人高潮全过程视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品免费久久久久久久清纯 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 蜜桃在线观看..| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 激情五月婷婷亚洲| 成在线人永久免费视频| 激情视频va一区二区三区| 七月丁香在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲美女黄色视频免费看| 一个人免费看片子| 天堂8中文在线网| 久久99一区二区三区| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩av免费高清视频| 国产精品九九99| 9热在线视频观看99| 欧美日韩福利视频一区二区| 两个人免费观看高清视频| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩人妻精品一区2区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女边吃奶边做爰视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 又紧又爽又黄一区二区| 成人国语在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 在线观看免费午夜福利视频| 久久亚洲精品不卡| 丰满少妇做爰视频| 亚洲五月婷婷丁香| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 自线自在国产av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 另类精品久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜福利免费观看在线| 韩国高清视频一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久精品国产亚洲av涩爱| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | a 毛片基地| 亚洲欧洲国产日韩| 99久久人妻综合| 免费在线观看黄色视频的| 免费看av在线观看网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 男女边摸边吃奶| a级毛片黄视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 午夜福利一区二区在线看| 色综合欧美亚洲国产小说| tube8黄色片| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲综合色网址|