恥垢分枝桿菌MSMEG_4259的基因組維護功能研究

鄧茗芝，許原原，呂亮東

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的傳染性疾病，為全球十大死因之一[1]。近年來，隨著耐藥結(jié)核病患者的不斷增多，結(jié)核病的防治形勢越發(fā)嚴(yán)峻?，F(xiàn)有研究表明，結(jié)核分枝桿菌不存在基因間水平轉(zhuǎn)移，其耐藥性的產(chǎn)生均由基因組突變所致[2]。因此，闡明結(jié)核分枝桿菌DNA復(fù)制與修復(fù)的機制對于深入認(rèn)識結(jié)核分枝桿菌的致病機理和耐藥性形成具有重要意義。Rv2191基因及其同源基因廣泛存在于分枝桿菌屬中，而大腸埃希菌中不存在該同源基因。由于Rv2191蛋白包含DEDDh核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，曾被認(rèn)為是DNA復(fù)制體校正亞基DnaQ的同源蛋白，但研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌DnaQ不具備DNA復(fù)制的校對功能[3]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌慢性感染兔模型中，Rv2191在潛伏感染和復(fù)燃階段的表達(dá)顯著上調(diào)，提示Rv2191可能與細(xì)菌的持留狀態(tài)和復(fù)蘇有關(guān)[4]。然而，目前對Rv2191蛋白的生理功能還不清楚。

本研究通過比較結(jié)核分枝桿菌Rv2191與恥垢分枝桿菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)MSMEG_4259(Rv2191的同源物；以下簡寫為Ms4259)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)兩者具有高度同源性。因此，以恥垢分枝桿菌為模式，構(gòu)建Ms4259基因敲除(ΔMs4259)菌株，比較分析野生型與ΔMs4259菌株的生長速率、利福平(rifampicin，RIF)耐藥突變頻率、突變譜、DNA損傷應(yīng)答和對DNA損傷劑的耐受性，以研究Ms4259的生理功能和特性，從而發(fā)現(xiàn)Ms4259參與分枝桿菌基因組維護及DNA氧化損傷應(yīng)答，為進一步研究分枝桿菌致病和耐藥突變的形成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒恥垢分枝桿菌mc2155菌株、大腸埃希菌DH5α菌株和質(zhì)粒pYUB854均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑Middlebrook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自美國BD公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Phase Lock Gel購自中國TIANGEN公司；限制性核酸內(nèi)切酶、DNase Ⅰ、Q5超保真聚合酶購自美國NEB公司；RNA純化試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Ambion公司；SuperScriptTMⅣ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)購自日本TaKaRa公司；常用抗生素購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物本研究所用引物如表1所示。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)大腸埃希菌采用 LB液體培養(yǎng)基(37 ℃、220 r/min)和 LB固體培養(yǎng)基 (37 ℃靜置)分別培養(yǎng)12～18 h；恥垢分枝桿菌采用含0.2%甘油、0.05%吐溫80的 Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(37 ℃、100 r/min)和含0.2%甘油的Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基(37 ℃靜置)分別培養(yǎng)2～3 d。

1.2.3 敲除菌株及回補菌株的構(gòu)建利用同源重組方法進行基因敲除。以恥垢分枝桿菌mc2155的基因組DNA為模板，通過引物 Ms4259KO-F1/Ms4259KO-R1和Ms4259KO-F2/Ms4259KO-R2分別擴增上下臂，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后依次連接至質(zhì)粒pYUB854，采用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法[5]將重組質(zhì)粒導(dǎo)入恥垢分枝桿菌mc2155，獲得ΔMs4259菌株。然后，利用引物4259testF/4259testR來驗證Ms4259基因是否敲除成功。為了能夠充分回補，通過分析恥垢分枝桿菌核糖體圖譜[6]， 選擇較高轉(zhuǎn)錄水平的基因groL1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域作為回補基因的表達(dá)元件。以Rpro-F/Rpro-R為引物，通過PCR擴增該基因本身的18 bp及前290 bp，將PCR產(chǎn)物連接至pMV361質(zhì)粒，命名為pMV361-Rpro。用引物MS4259-F/MS4259-R擴增回補基因片段Ms4259，而后連接至質(zhì)粒pMV361-Rpro。將構(gòu)建好的回補質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化ΔMs4259感受態(tài)細(xì)胞，獲得ΔMs4259+Ms4259回補菌株。

表1 PCR引物

1.2.4 生長曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。吹散混勻，以終吸光度值OD600=0.02接種于20 mL新鮮Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 搖床培養(yǎng)。6 h后，每隔3 h測一次菌液OD600值，并記錄匯總作圖。

1.2.5 突變頻率測定將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以終OD600=0.02接種于10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基稀釋菌液至OD600=0.000 1，分裝至30個細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 cm2)，5 mL菌液/瓶，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～1。吸取30 μL菌液，用含0.05%吐溫80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with 0.05% Tween 80，PBST)梯度稀釋至105，分別吸取50 μL涂布于2個LBG平板(LB固體培養(yǎng)基+0.2%甘油)，37 ℃培養(yǎng)3 d，記錄單克隆數(shù)，并計算涂板菌液的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。CFU值=2×10×105×C，C為LBG平板長出的單菌落數(shù)。每個樣品的2個LBG平板計算的CFU取平均值作為每1 mL涂板菌液的活菌數(shù)。將剩余菌液約4.5 mL轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，4 000 r/min離心6 min，收集菌體。將菌體用 100 μL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基重懸，全部涂布于含有100 μg/mL利福平的Middlebrook 7H10平板，37 ℃ 培養(yǎng)4～5 d，記錄單克隆數(shù)。利福平耐藥突變頻率=利福平平板上長出的單菌落數(shù)/計算的涂板菌液的總活菌數(shù)。

1.2.6 突變譜分析收集利福平耐藥菌落，接種于200 μL含100 μg/mL利福平的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)6～7 d。收集菌體，用200 μL ddH2O洗滌2次，重懸于20 μL ddH2O，98 ℃金屬浴10 min以提取基因組DNA。4 000 r/min離心6 min，取上清液作為PCR模板，使用引物RpoB-F/RpoB-R擴增rpoB基因的I簇區(qū)域，PCR產(chǎn)物進行雙向測序。

1.2.7 RNA提取將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以O(shè)D600=0.02的濃度轉(zhuǎn)接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。室溫、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用1 mL TRIzol[7]重懸，使TRIzol與細(xì)菌充分接觸，將混合物轉(zhuǎn)移至2 mL螺口管(含500 μL 0.1 mm二氧化鋯珠)，冰水浴3 min。均質(zhì)儀裂解菌體步驟如下：5 000 r/min，破碎5次，每次35 s，冰上間隔至少1 min。破碎完成后，4 ℃、16 000 g離心5 min，吸取上層液體于Phase Lock Gel，加入300 μL氯仿，劇烈振蕩20 s，室溫放置10 min使之分層。4 ℃、16 000 g離心10 min，緩慢吸取上層溶液于新的1.5 mL離心管(RNase-free)中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻10次，冰水浴30 min。4 ℃、20 000 g離心30 min，將沉淀物用1 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌1次。室溫下干燥核酸沉淀，加入100 μL 1×DNase Ⅰ Buffer(含5 μL RNase-free DNase Ⅰ)，37 ℃水浴30 min。最后利用RNA純化試劑盒進行純化，將獲得的RNA保存于 -80 ℃。

1.2.8 qRT-PCR將提取的分枝桿菌RNA用SuperScriptTMⅣ First-strand Synthesis System試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA用TB Green? Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)試劑盒進行 qRT-PCR，利用引物對sigA-F/sigA-R、recA-F/recA-R、adnA-F/adnA-R、adnB-F/adnB-R和Ms4259-F/Ms4259-R分別對sigA、recA、adnA、adnB和Ms4259基因進行檢測和擴增。qRT-PCR的內(nèi)參基因選用sigA，其轉(zhuǎn)錄在氧化壓力條件下不受影響[8]。采用2-ΔΔCt法比較不同樣本間目的基因的差異表達(dá)水平。ΔΔCt=(Ct處理樣本目的基因-Ct處理樣本內(nèi)參基因) -(Ct對照樣本目的基因-Ct對照樣本內(nèi)參基因)。

1.2.9 氧氟沙星殺菌曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以O(shè)D600=0.02轉(zhuǎn)接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600=0.1，每個搖菌管分裝1 mL，加入1.5 μg/mL氧氟沙星，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置。在每個取樣時間點吸取30 μL菌液于270 μL PBST中，梯度稀釋，吸取5 μL點涂于LBG平板，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數(shù)和稀釋度，計算CFU值。CFU=2×100×a×c;其中a為稀釋倍數(shù),c為該稀釋度下存活的單菌落數(shù)。

1.2.10 叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)殺菌曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以菌液濃度OD600=0.02轉(zhuǎn)接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至終濃度OD600值為0.6～0.8。每個搖菌管分裝1 mL，加入1 mmol/L t-BHP，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)。在每個取樣時間點吸取30 μL菌液于270 μL PBST中，梯度稀釋，吸取5 μL點涂于LBG平板，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數(shù)和稀釋度，參照1.2.9小節(jié)方法計算CFU。

1.2.11 紫外線殺菌實驗將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以O(shè)D600=0.02的菌液濃度轉(zhuǎn)接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至菌液濃度OD600值為0.6～0.8。用PBST調(diào)至菌液濃度OD600=0.1，梯度稀釋至105，并點涂于不含抗生素的Middlebrook 7H10平板。待菌液晾干后，使用紫外交聯(lián)儀(美國UVP公司，HL-2000)照射，紫外線輻射劑量為5、10、15、20 mJ/cm2。照射完畢，立即用鋁箔紙包裹平板，于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2～4 d。記錄平板上每個稀釋梯度生長的單克隆數(shù)，計算CFU。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計并作圖。除rpoB突變譜分析使用卡方檢驗外，其余數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌Ms4259的氨基酸序列分析

利用美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)生物大分子序列比對搜索工具BLAST比較恥垢分枝桿菌mc2155的Ms4259與結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv2191的氨基酸序列，結(jié)果顯示氨基酸序列一致性為64%，相似性為74%，表明兩者具有高度同源性。因此，以恥垢分枝桿菌作為模式生物研究Ms4259的功能在一定程度上能夠提示Rv2191在結(jié)核分枝桿菌中的作用(見圖1)。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站InterPro進行蛋白質(zhì)功能預(yù)測和結(jié)構(gòu)域注釋，結(jié)果顯示Ms4259含有一個在N端的DEDDh核酸外切酶結(jié)構(gòu)域以及一個在C端的GIY-YIG核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域， 后者為核苷酸切除修復(fù)途徑中內(nèi)切酶UvrC、Cho和類似蛋白所具有的催化結(jié)構(gòu)域(見圖1)。

The black box is the DEDDh 3′-5′ exonuclease domain. Mtb UvrC is the N-terminal GIY-YIG endonuclease domain of Mycobacterium tuberculosis UvrC (residue 1-103).

2.2 Ms4259非恥垢分枝桿菌生長的必需基因

利用同源重組方法敲除恥垢分枝桿菌mc2155的Ms4259基因(見圖2A)，并用4259testF/4259testR引物驗證基因敲除菌株的基因型。結(jié)果如圖2B所示，野生型mc2155菌株能擴增出含目的基因Ms4259的片段(2 455 bp)，ΔMs4259菌株能擴增出含hyg抗性基因的片段 (3 432 bp)，空白對照無條帶，證明ΔMs4259敲除菌株構(gòu)建成功。通過測定野生型菌株和ΔMs4259菌株的生長曲線，發(fā)現(xiàn)兩者生長能力沒有差異(見圖2C)，提示Ms4259非恥垢分枝桿菌在富營養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長的必需基因。

A: Schematic diagram of strain genotypes and process of construction. B: Verification of knockout strain by genotyping PCR with primer 4259testF and 4259testR. C: Growth curves of wild type and ΔMs4259 strains.

2.3 Ms4259參與分枝桿菌基因組穩(wěn)定性的維護

氨基酸序列分析表明，Ms4259具有核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，提示其與DNA修復(fù)有關(guān)。為研究Ms4259對恥垢分枝桿菌基因組穩(wěn)定性的影響，本研究測定了施加DNA損傷壓力前后野生型菌株和ΔMs4259菌株的利福平耐藥自發(fā)突變頻率。圖3A結(jié)果顯示，在正常實驗室條件培養(yǎng)下，與野生型菌株相比，ΔMs4259敲除菌株的利福平耐藥自發(fā)突變頻率升高約1.9倍(P<0.05)，Ms4259回補菌株的自發(fā)突變頻率無顯著變化，即ΔMs4259敲除菌株的自發(fā)突變頻率升高表型能通過表達(dá)野生型Ms4259來實現(xiàn)表型回補。用H2O2處理后，野生型菌株和ΔMs4259菌株自發(fā)突變頻率分別升高約3.8和2.4倍(P<0.000 1)，但兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。絕大多數(shù)利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB基因Ⅰ簇，因此本研究分別對野生型菌株和ΔMs4259菌株自發(fā)形成的利福平耐藥菌落的rpoB基因Ⅰ簇區(qū)域進行測序。圖3B結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，ΔMs4259菌株的A: T>C: G突變比率明顯上升，增加約10倍。這些結(jié)果表明，Ms4259對維持分枝桿菌基因組的穩(wěn)定性具有重要性。

2.4 Ms4259參與氧化損傷應(yīng)答

利用熒光qRT-PCR來分析在正常生長狀態(tài)和H2O2處理條件下野生型菌株和ΔMs4259菌株的DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)情況。分枝桿菌的DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)主要包括SOS應(yīng)答途徑以及PafBC介導(dǎo)的調(diào)控途徑[9]，本研究選用2個途徑共同調(diào)控的recA以及單獨被PafBC介導(dǎo)調(diào)控的adnA和adnB，作為DNA損傷應(yīng)答基因[10]。結(jié)果顯示，無論是在正常生長條件還是氧化壓力條件下，野生型菌株與ΔMs4259菌株的DNA損傷修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異(見圖4A)。用5 mmol/L H2O2處理30 min后，recA、adnA和adnB的轉(zhuǎn)錄情況在野生型菌株和ΔMs4259菌株中的上調(diào)水平相似，即兩者在H2O2處理下具有相似的DNA損傷應(yīng)答能力。此外，野生型菌株的Ms4259基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)約7倍，表明Ms4259在轉(zhuǎn)錄水平參與了H2O2引起的氧化損傷應(yīng)答(見圖4B)。

2.5 Ms4259未參與恥垢分枝桿菌對DNA損傷劑的耐受

為進一步探討Ms4259是否可介導(dǎo)恥垢分枝桿菌對 DNA 損傷劑的耐受， 本研究測定了野生型菌株和ΔMs4259菌株在不同DNA損傷劑處理下的存活率。氧氟沙星作為喹諾酮類殺菌藥物，通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶來干擾DNA復(fù)制，從而達(dá)到殺菌效果。t-BHP是一種烷基氫有機過氧化物，能引起廣泛的DNA氧化損傷。紫外線主要使同一條DNA鏈上的相鄰嘧啶以共價鍵連成二聚體，從而導(dǎo)致DNA損傷。圖5結(jié)果顯示，野生型菌株與ΔMs4259菌株在氧氟沙星、t-BHP以及紫外線處理下的存活率無明顯差異，提示Ms4259缺失不影響恥垢分枝桿菌對 DNA 損傷劑引起的 DNA 結(jié)構(gòu)異常的耐受性。

A: Spontaneous and H2O2-induced RIFR mutation frequency. Results shown are mean±SEM of at least 24 independent experiments. *P<0.05, ***P<0.001. B: Mutation spectra expressed in percentage relative to the total mutations identified in the cluster I region of rpoB gene. The number of RIFR colonies selected for sequencing were shown in the center of the ring.

A: qRT-PCR analyses of gene expression in logarithmic-phase strains. All values are normalized to wild type strains. B: qRT-PCR analyses of gene expression in logarithmic-phase strains after exposure to 5 mmol/L H2O2 for 30 min. All values are normalized to untreated samples. Data shown are mean±SEM of three independent experiments.

A: Ofloxacin (1.5 μg/mL). B: t-BHP (1 mmol/L). C: Ultraviolet (0, 5, 10, 15 and 20 mJ/cm2).

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，較于野生型菌株缺失Ms4259的恥垢分枝桿菌的利福平耐藥自發(fā)突變頻率顯著上升，證實該基因參與恥垢分枝桿菌的基因組維護。但有研究通過波動試驗比較恥垢分枝桿菌野生型與ΔMs4259菌株的突變率，結(jié)果顯示無顯著差異[3]。須注意的是，突變率是指單位時間內(nèi)某種突變發(fā)生的概率，可表示為每個位點、每個基因、每個核苷酸或每個配子在每個世代或每次DNA復(fù)制時發(fā)生突變的概率，突變頻率則是指群體內(nèi)發(fā)生某種突變的細(xì)胞或個體數(shù)的比例[11]，兩者高度相關(guān)，但不相同。本研究結(jié)果與此并不沖突。

對篩選到的利福平耐藥菌株的rpoB基因進行測序，發(fā)現(xiàn)A: T>C: G突變在ΔMs4259菌株中發(fā)生的概率比野生型高10倍，提示Ms4259的基因組維護功能與A: T>C: G突變形成有關(guān)。A: T>C: G突變是細(xì)胞中最常見的與DNA氧化損傷相關(guān)的突變類型，與氧化型鳥嘌呤8-oxo-dG在復(fù)制過程中錯誤地?fù)饺牖蚪MDNA有關(guān)，該堿基易與腺嘌呤(adenine, A)形成錯配，導(dǎo)致A: T>C: G突變形成[12]。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)Ms4259在氧化壓力下轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)了7倍。以上結(jié)果提示，Ms4259可能參與了DNA氧化損傷的修復(fù)，但目前還不清楚該修復(fù)過程是發(fā)生在DNA復(fù)制階段還是復(fù)制后修復(fù)階段。

目前，對Ms4259及其同源基因的相關(guān)研究非常少。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌Rv2191在絲裂霉素C處理后能以PafBC介導(dǎo)途徑調(diào)控的方式誘導(dǎo)表達(dá)[13]，提示其與結(jié)核分枝桿菌的DNA損傷應(yīng)答有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。在結(jié)核分枝桿菌感染兔模型中，Rv2191在結(jié)核潛伏感染和復(fù)蘇階段表達(dá)水平提高，提示其可能參與了結(jié)核分枝桿菌的持留或復(fù)蘇[4]。細(xì)菌在潛伏感染時處于一種相對靜止代謝的狀態(tài)(不發(fā)生復(fù)制)，此狀態(tài)下細(xì)菌基因組面臨宿主細(xì)胞環(huán)境，即使DNA損傷也不會及時修復(fù)，因此細(xì)菌重新活化時須優(yōu)先表達(dá)DNA損傷修復(fù)基因，從而去修復(fù)受損的基因組，避免直接復(fù)制導(dǎo)致更嚴(yán)重的雙鏈斷裂[14]。然而，目前對分枝桿菌復(fù)蘇階段DNA修復(fù)和復(fù)制的機制研究還十分欠缺。

Ms4259蛋白的N端具有3′-5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，C端有類UvrC內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，提示其具有在同一個DNA序列上進行內(nèi)切后再利用自身外切酶活性進行核苷酸切除的潛在能力。目前研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)既復(fù)雜又冗余，具有堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、非同源端連接、單鏈退火、雙鏈DNA斷裂修復(fù)和非經(jīng)典的錯配修復(fù)等修復(fù)方式，這些DNA修復(fù)過程都須通過DNA損傷應(yīng)答途徑來上調(diào)特定的DNA損傷修復(fù)基因的水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ms4259缺失不會導(dǎo)致恥垢分枝桿菌突變頻率大幅升高，也不影響恥垢分枝桿菌在DNA損傷條件下的存活率。本文結(jié)論提示Ms4259在恥垢分枝桿菌的DNA代謝系統(tǒng)中可能是冗余的，也可能與特定條件下(如細(xì)菌休眠與復(fù)蘇)的DNA修復(fù)調(diào)控有關(guān)，相關(guān)機制有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究揭示了分枝桿菌Ms4259及其同源物的生理功能、突變譜特點及參與氧化壓力應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點，為進一步探討其作用機制奠定了基礎(chǔ)。