基于組織結(jié)構(gòu)特征和蛋白質(zhì)與鈣含量比值的鹿茸分區(qū)研究

趙海平，姚夢杰，徐 源，劉 佳，岳志剛，齊曉妍，李春義

基于組織結(jié)構(gòu)特征和蛋白質(zhì)與鈣含量比值的鹿茸分區(qū)研究

趙海平1, 3，姚夢杰1，徐 源1，劉 佳1，岳志剛1，齊曉妍1，李春義2*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省鹿茸工程研究中心，吉林 長春 130112 2.鹿茸科學(xué)與產(chǎn)品技術(shù)研究所長春科技學(xué)院，吉林 長春 130600 3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109

建立客觀鹿茸分區(qū)方法。采集3種規(guī)格的鹿茸，分別為馬鹿三杈茸、梅花鹿三杈茸和二杠茸。通過縱向剖面、橫斷面和組織學(xué)切片對鹿茸內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征和組織類型進行分析，確定鹿茸的感官分區(qū)指標。通過測定鹿茸不同區(qū)段成分上的差異，設(shè)立數(shù)據(jù)化的分區(qū)指標。建立血管形態(tài)和骨密質(zhì)環(huán)2個感官分區(qū)指標，蠟片：無肉眼可見血管；粉片：血管細密，粗細均勻；蜂片：開始出現(xiàn)密質(zhì)骨時，周圍血管細密，中間粗，呈蜂窩狀；骨片：密質(zhì)骨連成骨密質(zhì)環(huán)。利用蛋白質(zhì)含量和鈣含量的比值設(shè)定了不同區(qū)段鹿茸分區(qū)值（PV值）：蠟片≥65.00，粉片6.30～64.99，蜂片4.70～6.29，骨片≤4.69。通過感官指標和PV值建立了鹿茸的客觀分區(qū)方法，能夠精確客觀地對鹿茸進行分區(qū)，不僅適用于不同種鹿茸，如馬鹿茸和梅花鹿茸；而且也適用于不同規(guī)格的鹿茸，如二杠茸和三杈茸；還能夠適用于不同加工方式處理的鹿茸，如傳統(tǒng)煮炸法和冷凍真空干燥法。該方法為增強鹿茸治療的針對性和促進鹿茸深加工奠定了基礎(chǔ)。

鹿茸；內(nèi)部組織特點；馬鹿三杈茸；梅花鹿三杈茸；二杠茸；分區(qū)值

鹿茸是鹿科動物梅花鹿Temminck或馬鹿Linnaeus的雄性未骨化密生茸毛的幼角，為雄鹿的第二性征。鹿茸作為我國的傳統(tǒng)中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。根據(jù)《中國藥典》2020年版，鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的功效[1]。由于鹿茸的組織成分從上到下并非勻質(zhì)，所以不同部位的藥效各有不同。同一鹿種不同區(qū)段的鹿茸價格迥異，自尖部到基部逐漸降低，尖部價格為基部價格的上百倍[2]。這種巨大的價格差距說明，在我國近2000年對鹿茸的應(yīng)用歷史過程中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)同一鹿種不同區(qū)段鹿茸之間的功效有著很大的差異。

鹿茸作為自然界唯一能夠完全再生的[3]、組織生長速度最快（達2.75 cm/d）[4]和骨化速度最快（平均高達250 g/d）[5-7]最快的哺乳動物器官，在近代成為組織器官發(fā)育[8]、再生[3]、軟骨和皮膚缺損修復(fù)[9]等方面的獨特研究模型。研究發(fā)現(xiàn)鹿茸的生長中心位于尖部，該部除皮膚外由既連續(xù)又可獨立區(qū)分的4個組織層構(gòu)成：間充質(zhì)層、前軟骨層、過度層和軟骨層；不同組織層的細胞種類、組織類型均不相同[10]?，F(xiàn)代生物學(xué)研究也證明同一鹿種不同區(qū)段鹿茸的功效也有顯著差別[11]。

雖然在傳統(tǒng)應(yīng)用和現(xiàn)代生物學(xué)均已發(fā)現(xiàn)鹿茸不同部位的差異，但由于沒有科學(xué)的、精確的、客觀的標準，鹿茸的分區(qū)只能憑主觀判斷進行操作。所以目前鹿茸的分區(qū)比較混亂，方法不一，而且不同文獻中對鹿茸同一個區(qū)段的稱謂也不一致。從業(yè)者常采用多區(qū)段的分法，如蠟片、半蠟片、白粉片、黃粉片、紅粉片、蜂片、骨片等。與之不同的是，學(xué)術(shù)上常采用4區(qū)段分法，如蠟片、粉片、蜂片、骨片[2]。除此，還有多種不同的稱謂，如張嵩等[12]將鹿茸的4個區(qū)段稱為蠟片、粉片、紗片、骨片；王艷梅等[13]將鹿茸的4個區(qū)段稱為蠟片、粉片、血片和骨片；而汪樹理等[14]、郭月秋等[15]將其稱為蠟片、粉片、紗片和骨片；還有人將其稱為嘴片、粉片、紗片骨片[16]。坊間還有血片（蠟片）、粉片和老角片之說。國內(nèi)也有人在分析鹿茸成分時采用西方的3區(qū)段分法：上部、中部、下部[17]。按照現(xiàn)行《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準》（NY/T1162-2006鹿茸片）（2006年頒布，以下統(tǒng)一簡稱為“行業(yè)標準”），鹿茸自尖部到基部分為蠟片、粉片、紗片、骨片4個區(qū)段。“行業(yè)標準”中對鹿茸的分區(qū)主要是根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗通過感觀對色澤、組織形態(tài)、氣味等方面進行人工主觀識別，缺乏明確的客觀指標，本研究中稱之為“傳統(tǒng)鹿茸分區(qū)方法”。由于傳統(tǒng)鹿茸分區(qū)方法不能科學(xué)地、精確地、客觀地區(qū)分鹿茸的不同區(qū)段，限制了臨床上不同區(qū)段鹿茸對不同疾病的針對性治療，致使鹿茸的功效沒有得到合理的利用；也阻礙了鹿茸質(zhì)量標準的制定和深加工產(chǎn)品的研發(fā)。本課題組認為，建立科學(xué)的、精確的客觀鹿茸分區(qū)方法，是使鹿茸這味傳統(tǒng)中藥走向現(xiàn)代化發(fā)展道路的先決條件。

本研究結(jié)合行業(yè)標準與傳統(tǒng)稱謂，將鹿茸這4個區(qū)段分別稱為蠟片、粉片（血片）、蜂片（紗片）、骨片；并依據(jù)鹿茸的外部形態(tài)，內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)特點和成分組成建立了客觀鹿茸分區(qū)方法，為使鹿茸的藥效得到科學(xué)合理地應(yīng)用，促進鹿茸這一傳統(tǒng)中藥走向現(xiàn)代化的發(fā)展道路奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

RM2255型石蠟切片機，德國萊卡公司；e2695型液相色譜，美國Waters公司；凱氏定氮儀，美國Tecator公司；MARS5型密閉微波消解儀，美國CEM公司；7700X型電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS），美國安捷倫公司；FDU-1100型冷凍干燥機，東京理化EYELA公司；DQ-100型手動參茸切片機，大德藥機有限公司；FW135型中藥粉碎機，天津泰斯特儀器公司。

2 方法

2.1 鹿茸樣品處理

采集能夠反映不同種類（包含馬鹿和梅花鹿）和不同發(fā)育時期（三杈茸和二杠茸）鹿茸，其中鮮茸（鋸茸后立即帶回實驗室，進行后續(xù)處理）和干茸（按照傳統(tǒng)煮炸加工方法干制，非排血茸）各3支（表1），包括馬鹿三杈茸（圖1-A、D）和梅花鹿三杈茸（圖1-B、E）、二杠茸（圖1-C、F）各6支。用于觀察內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)和測定成分。另采集1支梅花鹿三杈鮮茸，用于組織學(xué)分析。所有鹿茸均采集自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所試驗站，均具有種屬特異性的典型特征。

2.2 鹿茸內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)觀察和分區(qū)

將1支梅花鹿三杈鮮茸鋸成約20 cm的小段（圖2），沿正中縱向剖開。一側(cè)用于肉眼觀察不同區(qū)段的組織結(jié)構(gòu)，找出有標志性的形態(tài)特點；另一側(cè)沿縱向每隔一段距離（約0.5 cm）取0.2～0.3 mm厚的鹿茸組織樣品，用于組織學(xué)檢查，分析內(nèi)部組織類型。將其余鹿茸樣品按照如下程序進行切片：用酒精噴燈將鹿茸表面的茸毛燎掉，擦洗干凈，去掉側(cè)枝；鮮茸放置到?20 ℃過夜冷凍，干茸用蒸汽蒸軟；然后，用手動參茸切片機切成約2 mm厚的薄片，觀察不同區(qū)段的組織結(jié)構(gòu)和內(nèi)部形態(tài)特點。

圖2 梅花鹿三杈鮮茸縱切面

按照行業(yè)標準所描述的鹿茸不同區(qū)段的特征和經(jīng)驗，根據(jù)鹿茸縱向剖面和橫截面所展現(xiàn)出來的表型特征，對鹿茸進行分區(qū)。馬鹿三杈茸和梅花鹿三杈茸各分為7個區(qū)段，分別為蠟片區(qū)（wax-like，WL）、蠟粉片過渡區(qū)（WB）、粉片區(qū)（blood-color，BC）、粉蜂片過渡區(qū)（BH）、蜂片區(qū)（honeycomb-like，HL），蜂骨片過渡區(qū)（HB），骨片區(qū)（bone，B），共4個區(qū)段和3個過渡區(qū)段；梅花鹿二杠茸分為WL、BC、HL、B（鹿茸最基部約0.5 cm長的區(qū)段）4個區(qū)段。

2.3 組織學(xué)檢查

在縱向劈開的三杈鮮茸組織樣品，用10%的福爾馬林固定1周。用10%的甲酸脫鈣后，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，用蘇木素和伊紅染色，阿利辛藍復(fù)染。重點觀察WL、BC、HL、B 4個區(qū)段鹿茸內(nèi)部組織類型。

2.4 烘干和粉碎

鮮茸切片后，放?80 ℃預(yù)冷，然后用冷凍干燥機凍干；干茸切片后用65 ℃烘干。干制后的鹿茸片用中藥粉碎機粉碎，過100目篩。

2.5 HPLC分析

選擇凍干后粉碎的馬鹿和梅花鹿三杈茸，采用高效液相色譜法對鹿茸WL、BC、HL、B 4個區(qū)段的水溶性成分進行差異分析，主要分析4個區(qū)段的指紋圖譜和峰下面積的差異。

2.5.1 供試品溶液的制備 稱取凍干粉0.5 g，在50 mL離心管中用10 mL蒸餾水稀釋，置于超聲浴中，超聲30 min（50 kHz），離心15 min（10 000 r/min），收集上清液，用同樣方法再次提取殘渣，2次上清液合在一起，加水定容至25 mL。所得溶液通過0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.5.2 陰性對照溶液的制備 蒸餾水作為陰性對照溶液。

2.5.3 色譜條件 色譜分析使用Waters e2695系統(tǒng)（Waters，配2489UV檢測器，連接Waters Empower 3數(shù)據(jù)站），采用Pursuit XRs C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）在30 ℃下進行色譜分離。檢測波長260 nm，體積流量1 mL/min，每次進樣10 μL。流動相由甲醇（A）和水（B）組成，梯度洗脫：0～30 min，1%～10%A。該方法重復(fù)3次，獲得的結(jié)果均一致，作為本實驗的最終結(jié)果。

2.6 蛋白質(zhì)含量測定

鮮茸和干茸各個區(qū)段的鹿茸粉，采用凱氏定氮法，參照AOAC的官方分析方法[18]進行蛋白質(zhì)含量的測定。約0.2 g的鹿茸粉用15 mL H2SO4在420 ℃條件下處理2 h，冷卻后，滴定，總氮的量乘以6.25為蛋白質(zhì)的量[19]。當2個獨立測定之間的絕對差異超過10%時，重復(fù)測定。

2.7 鈣含量測定

鮮茸和干茸各個區(qū)段的鹿茸粉，采用ICP-MS法，按照孫偉麗等[20]描述的方法，進行鈣含量的測定。

2.8 分區(qū)值（PV）計算

PV值的設(shè)立的計算公式如下

PV＝Cp/Cca×105

Cp為蛋白質(zhì)的含量，Cca鈣的含量

WB、BH、HB的值分別用以區(qū)分WL、BC、HL、B。

2.9 統(tǒng)計分析

蛋白質(zhì)含量、鈣含量、PV值的數(shù)值，采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析并制圖。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)

通過對鹿茸縱剖面（圖2）、各區(qū)段橫斷面（圖3）和組織學(xué)切片的觀察（圖4）得知，對于同一區(qū)段，不同規(guī)格鹿茸、鮮茸和干茸的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)特點差別不明顯；而對于同一規(guī)格的鮮茸（或干茸）來說，不同區(qū)段之間差別明顯，組織類型也不一致，具體描述見表2。

A、D-干茸切片 E、H-鮮茸切片 A、E-蠟片（WL區(qū)），無肉眼可見血管，蠟質(zhì)肉樣 B、F-粉片（BC區(qū)），細密均勻的血管 C、G-蜂片（HL區(qū)），周圍血管細，中央血管粗，類似蜂巢狀，開始出現(xiàn)密質(zhì)骨（*處），但是有缺口（#處）沒有連成環(huán) D、H-骨片（B區(qū)），血管變粗，密質(zhì)骨（*處）連成環(huán)

A-WL區(qū)，間充質(zhì)，形成表面覆蓋有成軟骨細胞（箭頭）的柱狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有軟骨細胞（箭頭），說明開始向軟骨轉(zhuǎn)化 B-BC區(qū)，軟骨組織，可見藍染的連續(xù)的軟骨柱，內(nèi)部充滿軟骨細胞（箭頭），箭頭指向的為破軟骨細胞 C-HL區(qū)彌散的骨小梁依然可見大量的軟骨細胞（箭）和破軟骨細胞（*），表面覆蓋有成骨細胞（箭頭） D-B區(qū)，正在進行骨重建的骨小梁，成骨（箭頭）和破骨（箭頭）共存

表2 鹿茸4個區(qū)段內(nèi)部組織特征和類型

通過肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)3種規(guī)格鹿茸、鮮茸和干茸不同區(qū)段的共性差別在于血管形態(tài)、軟骨和骨柱及骨密質(zhì)環(huán)，因此選擇這3個指標用于分區(qū)。4個區(qū)段骨化程度逐漸加深；肉眼可見血管從無（WL區(qū)，圖3-A、E）到有，并逐漸增粗，當肉眼可見血管布滿整個鹿茸橫斷面時，為BC區(qū)（圖3-B、F），此區(qū)段血管細密，粗細均勻；軟骨和骨柱分布均勻，骨密質(zhì)環(huán)從無到有，當鹿茸橫斷面邊緣開始出現(xiàn)密質(zhì)骨時，為HL區(qū)（圖3-C、G），此區(qū)段周圍血管細密，中間粗，呈蜂窩狀；軟骨和骨柱變得破損無序，當鹿茸橫斷面邊緣的密質(zhì)骨連成環(huán)狀的骨密質(zhì)環(huán)時，為B區(qū)（圖3-D、H），此區(qū)段周圍血管細密，中間更粗，形成血竇。

3.2 內(nèi)部的組織類型

由梅花鹿三杈茸鮮茸不同區(qū)段的組織學(xué)切片（圖4）可以看出，WL區(qū)（圖4-A）形成表面覆蓋有成軟骨細胞的柱狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有軟骨細胞，此處已經(jīng)開始從間充質(zhì)向軟骨轉(zhuǎn)化。BC區(qū)（圖4-B）可見縱向血管分割的藍染的連續(xù)的軟骨柱，內(nèi)部充滿軟骨細胞。HL區(qū)（圖4-C）可見彌散的骨小梁與血竇，內(nèi)部依然含有大量的軟骨細胞和破軟骨細胞，表面覆蓋有成骨細胞。B區(qū)（圖4-D），由完整骨環(huán)圍繞的內(nèi)部組織分布著正在進行骨重建的骨小梁和大量的血竇，成骨細胞和破骨細胞共存。

3.3 水溶性成分差異比較

同一區(qū)段的馬鹿和梅花鹿三杈鮮茸的HPLC色譜圖類似，同一鹿茸4個區(qū)段HPLC峰數(shù)量相近，色譜圖見圖5，峰面積見圖6，沒有顯著差異（0.05）。

圖5 馬鹿(A)和梅花鹿(B) 三杈鮮茸4個區(qū)段的HPLC色譜圖比較

圖6 馬鹿和梅花鹿三杈鮮茸HPLC總峰面積比較(n＝6)

不同區(qū)段之間，不論是馬鹿還是梅花鹿三杈鮮茸的HPLC色譜峰的數(shù)量基本相同（圖5）；但色譜峰面積差別較大（圖7），峰面積值從尖部到基部逐漸降低，其中馬鹿三杈鮮茸相鄰區(qū)段之間差別顯著（＜0.05、＜0.01），梅花鹿三杈鮮茸粉片和蜂片。之間差異顯著（＜0.05），總體趨勢為WL的峰值最高，BC、HL、B依次降低。

相鄰區(qū)段比較：*P＜0.05 ** P＜0.01

3.4 4個區(qū)段蛋白質(zhì)含量的變化趨勢

鹿茸樣品的蛋白質(zhì)含量在46.14%～85.56%。不同規(guī)格、同一區(qū)段鹿茸組織的蛋白質(zhì)含量之間的差異不顯著，見圖8。除了馬鹿三杈茸的WB和HL（＜0.05）之外，其余區(qū)段的干茸和鮮茸之間的蛋白質(zhì)含量的差異均不顯著，見圖9。

A-4個區(qū)段 B-3個過渡區(qū)段

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區(qū)段比較：*P＜0.05

3種規(guī)格鹿茸的蛋白質(zhì)含量從尖部到基部均逐漸降低，WL、BC、HL、B4個區(qū)段的相鄰區(qū)段之間差異均達到顯著（＜0.05）或極顯著水平（＜0.01、0.001）；同一種鹿茸的4個區(qū)段蛋白質(zhì)含量逐漸降低，而某些區(qū)段與其過渡區(qū)段（如馬鹿三杈茸BH與HL，梅花鹿三杈茸BC與BH、BH與HL、HL與HB）之間存在差異不顯著的現(xiàn)象，見圖10。

相鄰區(qū)段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.5 4個區(qū)段鈣含量的變化趨勢

鹿茸樣品的鈣含量在0.08%～18.51%。除馬鹿三杈茸和梅花鹿三杈茸在WB存在差異顯著（＜0.05）的現(xiàn)象之外，3種規(guī)格之間的同一區(qū)段鹿茸的鈣含量差異不顯著（＞0.05），見圖11。除馬鹿三杈茸的WB、梅花鹿三杈茸WL和BC存在差異顯著（＜0.05）的現(xiàn)象之外，其余區(qū)段的干茸和鮮茸之間的鈣含量差異均不顯著（＞0.05），見圖12。

A-4個區(qū)段 B-3個過渡區(qū)段 2種規(guī)格同一區(qū)段比較：*P＜0.05

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區(qū)段比較：*P＜0.05

3種規(guī)格鹿茸的鈣含量從尖部到基部均逐漸升高，WL、BC、HL和B 4個區(qū)段的相鄰區(qū)段之間差異均達到極顯著水平（＜0.01，0.001）；同一鹿茸4個區(qū)段鈣含量逐漸升高，而某些區(qū)段與其過渡區(qū)段（馬鹿三杈茸HL與HB，梅花鹿三杈茸BC與BH、HL與HB）之間存在差異不顯著（＞0.05）的現(xiàn)象，見圖13。

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 相鄰區(qū)段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.6 4個區(qū)段PV值大小的變化趨勢

通過蛋白質(zhì)含量和鈣含量的比值設(shè)定的鹿茸PV值，數(shù)值范圍的跨度相比蛋白質(zhì)含量和鈣含量都大，分布在2.75～600.32，所以更能顯著地區(qū)分不同區(qū)段。3種規(guī)格鹿茸之間的同一區(qū)段的PV值差異不顯著，見圖14。除梅花鹿三杈茸的BC存在顯著差異（＜0.05）的現(xiàn)象之外，其余區(qū)段的干茸和鮮茸的PV值差異均不顯著，見圖15。

圖14 3種規(guī)格鹿茸之間的同一區(qū)段PV值的比較

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區(qū)段比較：*P＜0.05

3種規(guī)格鹿茸的PV值從尖部到基部均逐漸降低，其中馬鹿和梅花鹿三杈茸的WL、BC、HL和B4個區(qū)段的相鄰區(qū)段之間的差異均達到顯著（＜0.05）或極顯著水平（＜0.01、0.001）；同一鹿茸4個區(qū)段PV值逐漸升高，而某些區(qū)段與其過渡區(qū)段（馬鹿三杈茸WB與BC，梅花鹿三杈茸WB與BC、BC與BH、BH與HL、HL與HB）之間存在差異不顯著的現(xiàn)象，梅花鹿二杠茸蜂片和粉片的PV值差異不顯著，見圖16。

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 相鄰區(qū)段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

根據(jù)上述結(jié)果，將各區(qū)段的PV值進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表3。選擇馬鹿和梅花鹿三杈茸過渡區(qū)的PV值共12個數(shù)據(jù)，去掉一個最高值和一個最低值，剩余10個數(shù)值的平均值作為相鄰區(qū)段間的界限值。WL區(qū)PV值≥65.00，BC區(qū)PV值為6.30～64.99，HL區(qū)PV值為4.70～6.29，B區(qū)PV值≤4.69。

表3 鹿茸不同區(qū)段PV值(n＝6)

4 討論

目前鹿茸分區(qū)方法混亂、客觀指標和質(zhì)量標準缺乏等現(xiàn)狀，阻礙了鹿茸的深加工和藥用。因此，有必要建立科學(xué)的、精確的客觀鹿茸分區(qū)方法。我們認為客觀鹿茸分區(qū)方法，必須具備如下兩個條件：第一，無差別地適用于各種規(guī)格的鹿茸；第二，設(shè)有明顯的客觀指標。本研究根據(jù)不同區(qū)段鹿茸的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)和成分組成，首次設(shè)立了“血管形態(tài)”和“骨密質(zhì)環(huán)”2個指標作為鹿茸分區(qū)的感官指標。同時首次根據(jù)鹿茸中蛋白和鈣含量比值設(shè)立“PV值”這一指標，通過客觀數(shù)值將各個區(qū)段進行了數(shù)據(jù)化，并為相鄰區(qū)段之間設(shè)立了明顯的界線，定義了每個區(qū)段的數(shù)值范圍，使鹿茸分區(qū)更為合理，還能將深加工鹿茸產(chǎn)品的原材料定位到鹿茸的某一區(qū)段。

不同區(qū)段鹿茸的組織結(jié)構(gòu)、類型和成分組成各不相同。從鹿茸縱剖面（圖2）、橫斷面（圖3）和組織學(xué)切片（圖4）可以看出，不同區(qū)段組織結(jié)構(gòu)和類型之間清晰的變化。本研究的組織學(xué)結(jié)果顯示：鹿茸4個區(qū)段骨化程度從尖部到基部逐漸增大，該結(jié)果與赤鹿[10]、白尾鹿[21]的研究結(jié)果一致。液相色譜分析、代謝組學(xué)[2, 22]分析結(jié)果顯示，鹿茸不同區(qū)段成分含量和種類均有一定程度的差異。理論推測，（1）可能是上述差異造成了不同區(qū)段鹿茸的藥效存在一定的差異，如鹿茸不同區(qū)段在抗骨質(zhì)疏松方面的功效顯著不同[11]；（2）可以利用這種差異來區(qū)別鹿茸的不同區(qū)段。

對于不同區(qū)段鹿茸的成分含量，本研究通過對總水溶性成分含量（HPLC法測定）和單一種類（蛋白質(zhì)和鈣）成分含量兩種方式進行分析。對同一區(qū)段來說，HPLC法測定的總水溶性成分含量在不同規(guī)格鹿茸之間差異不顯著，說明該方法能夠同時適用于3種規(guī)格的鹿茸，但是由于HPLC法不能有效地區(qū)分的梅花鹿三杈茸鮮茸的不同區(qū)段。因此，本研究中使用的HPLC測定法不滿足構(gòu)建客觀鹿茸分區(qū)方法的條件。

3種規(guī)格鹿茸4個相鄰區(qū)段之間的PV值（圖16）達到差異顯著的水平（除梅花鹿二杠茸粉片和蜂片之間的PV值外）。相對于單一成分的蛋白質(zhì)含量（圖10）和鈣的含量（圖13）來說，PV值的數(shù)值在各區(qū)段之間的差距更大，因此更靈敏，使分區(qū)效果更好。對于不同種類和規(guī)格的鹿茸來說，各區(qū)段的PV值處于同一水平（表1）：同一區(qū)段的馬鹿茸和梅花鹿茸的PV值之間沒有顯著差異（圖14）；同一區(qū)段的梅花鹿三杈茸和二杠茸的PV值之間沒有顯著差異（圖14）；同一區(qū)段的干茸和鮮茸的PV值之間沒有顯著差異（圖15）。上述結(jié)果說明，該PV值不僅適用于種間的鹿茸，不同規(guī)格的鹿茸，也能夠適用于不同加工方式處理的鹿茸。

梅花鹿二杠茸粉片和蜂片之間的PV值（圖16）出現(xiàn)了不顯著的現(xiàn)象。對于同一區(qū)段來說，3種規(guī)格的鹿茸、干茸和鮮茸之間的蛋白質(zhì)含量、鈣含量和PV值也偶爾存在著差異顯著的現(xiàn)象。這是因為本研究中所用的樣品，全是采用傳統(tǒng)鹿茸分區(qū)方法進行劃分的，人為操作誤差較大。這一現(xiàn)象也證明了傳統(tǒng)鹿茸分區(qū)方法的可靠性較差。PV值的使用能很好地克服這一缺點。很多區(qū)段與其過渡區(qū)段之間的PV值差異不顯著（圖16），除傳統(tǒng)鹿茸分區(qū)方法的人為操作誤差因素外，還說明鹿茸4個區(qū)段之間存在一定的緩沖區(qū)，將鹿茸劃分為4個區(qū)段是合理的，如果再進行細化（如劃分為7個區(qū)段），會出現(xiàn)難以區(qū)分相鄰區(qū)段的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究設(shè)立的PV值對鹿茸進行分區(qū)的方法具備了客觀鹿茸分區(qū)方法的必備條件。但是由于PV值測定較為繁瑣，因此應(yīng)同時結(jié)合感官指標對鹿茸進行分區(qū)。對于難以確定區(qū)段歸屬的部分再進行PV值的測定，能夠得到較為精確的結(jié)果。

合理公認的鹿茸質(zhì)量鑒定方法的缺乏，是鹿茸質(zhì)量標準缺失的主要因素。本研究建立的客觀鹿茸分區(qū)方法，為建立現(xiàn)代化的鹿茸質(zhì)量鑒定方法邁出了第一步，有助于鹿茸產(chǎn)業(yè)的深加工和走向標準化，同時還為建立動物藥甚至整個中藥的質(zhì)量鑒定方法提供了示范。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of classification method for dividing velvet antler portions based on tissue structures and ratio of protein to calcium content

ZHAO Hai-ping1,3, YAO Meng-jie1, XU Yuan1, LIU Jia1, YUE Zhi-gang1, QI Xiao-yan1, LI Chun-yi2

1.Deer Antler Engineering Research Center, Institute of Special Animal and Plant Sciences of CAAS, Changchun 130112, China 2.Institute of Antler Science and Product Technology, Changchun Sci-Tech University, Changchun 130600, China 3.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China

To establish an objective classification method for dividing velvet antler (VA) portions.Three types of VA, including three-branched VA of wapiti, three-branched and two-branched VA of sika deer, were collected.To identify visual indicators of different portions, the VA internal tissue structure, morphological characteristics and tissue types of the longitudinal cut, crosscut and histological sections were analyzed.Differences in components of different VA portions were analyzed and partition index was set up.Morphological landmarks of blood vessels and ring of compact bone were found to be useful as two visual indicators for distinguishing the four VA portions.Wax-like (WL) slice: no visible blood vessel; Blood-color (BC) slice: fine-grained and uniformed blood vessels; Honeycomb-like (HL) slice: uniformed blood vessels and thicker in center, compact bone appeared at edge without connecting to a complete ring; Bone (B) slice: coarsened blood vessels and thicker in center, compact bone connecting to a complete ring.Portion value (PV), determined by using ratio of protein to calcium content, was applied to distinguish four VA portions: WL≥65.00; BC: 6.30—64.99; HL: 4.70—6.29; B≤4.69.The objective portion dividing method for VA was established based on the morphological landmarks and the PV in this study.It can accurately and objectively to distinguish four VA portions.They were not only suitable for different deer species, such as wapiti and sika deer VA; for different types of VA, such as two-branch and three-branch; but also for VA processed by different methods, such as traditionally cooking and modern freeze-drying.The established methods for dividing VA portions can be utilized for targeted use of VA to more specific symptoms in clinics, and for promoting development of deep-processing for deer industry.

velvet antlers; internal tissue structure; three-branched velvet antler of wapiti; three-branched velvet antler of sika deer; two-branched velvet antler; portion value

R286.2

A

0253 - 2670(2022)05 - 1518 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.028

2021-09-06

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20190304006YY）

趙海平，男，副研究員，博士，主要從事鹿茸生物學(xué)和藥效方面研究。E-mail: zhperic@163.com

通信作者：李春義，研究員，主要從事鹿茸生物學(xué)和干細胞方面研究。E-mail: lichunyi1959@163.com

[責任編輯 時圣明]