大豆PP2C家族基因鑒定與響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

楊昕霞，唐滿生，張 斌，*

(湖南科技學(xué)院，a.后勤處；b.化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199)

植物在生長過程中經(jīng)常會受到一些不利的環(huán)境因素影響，如干旱、鹽、極端溫度等。隨著全球氣候變暖，環(huán)境脅迫出現(xiàn)的更加頻繁且持續(xù)時間更長，這將對植物的生長、發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量產(chǎn)生重大不利影響。為了適應(yīng)不利環(huán)境，植物進化出多種分子和生理機制，如ABA信號途徑、SOS信號途徑、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、蛋白質(zhì)修飾等。其中，植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中蛋白激酶(protein kinases，PKs)和蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PPs)可通過蛋白去磷酸化調(diào)節(jié)蛋白功能，因此其可參與許多生物過程，如植物發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫響應(yīng)等。而蛋白磷酸酶主要包括3類：STP(Ser/Thr phosphatases)、PTP(protein Tyr phosphatases)和DSPTP(dual-specificity phosphatases)。蛋白磷酸酶2C(Type 2C protein phosphatase，PP2C)屬于PTP類，已有報道表明，植物PP2C家族蛋白能夠通過影響植物體內(nèi)的代謝過程、激素水平、生長因子等在環(huán)境脅迫(干旱、鹽、堿、病原菌等)響應(yīng)中發(fā)揮作用。

多個植物物種中已鑒定出PP2C家族成員，如擬南芥()、水稻()、短柄草()、辣椒()、香蕉()、馬鈴薯()、棉花()、玉米()、小麥()、野生大豆()等。在擬南芥中，PP2C家族成員的功能研究較多。最早在擬南芥中鑒定出80個PP2C家族基因，其中，73個PP2C家族基因被分為13個亞族(A～E、F1、F2、G～L)，另外有7個未被分組。亞族A的PP2C蛋白在ABA信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)生理過程和脅迫響應(yīng)，例如干旱、極端溫度和鹽脅迫等。正常條件下，擬南芥亞族A中的PP2C蛋白能夠與SnRK2s蛋白激酶結(jié)合抑制其活性；而在植物響應(yīng)非生物脅迫時，PYR/PYL蛋白能夠耦合脫落酸(abscisic acid，ABA)，進而結(jié)合亞族A中的PP2C蛋白，使其釋放SnRK2s蛋白激酶，進而激活下游轉(zhuǎn)錄因子以適應(yīng)逆境脅迫。Yu等研究表明，小麥PP2C亞家族A的成員能夠與TaSnRK2.1和TaSnRK2.2蛋白激酶互作，并且來源于A亞族的2135基因在擬南芥中過表達可降低其ABA敏感性。Chen等研究表明，擬南芥PP2C家族基因25、26、27和29對堿脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。擬南芥AtPP2C1蛋白可以與CIPK9相互作用，以調(diào)節(jié)低K條件下植物根的生長和種子發(fā)育，并且還能夠與MPK4或MPK6激酶協(xié)同作用，在擬南芥受到損傷時緩解病原脅迫。棉花PP2C家族基因的表達能夠響應(yīng)低溫、高溫、干旱和鹽脅迫，說明其在非生物脅迫中起重要作用。

以上研究初步探究了PP2C家族基因在植物發(fā)育和環(huán)境脅迫中的作用，但是其在大豆中的作用卻鮮見報道。Bai等研究表明，大豆GmPP2C1(GLYMA.13G106800，即本研究中的GmPP2C79)以ABA依賴的方式與ABA受體GmPYL1相互作用，參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。Lu等證明了大豆2-1(Glyma.17G221100，即本研究中的2104)參與種子發(fā)育過程，該基因過表達能夠提高種子產(chǎn)量。Chen等對野生大豆PP2C家族D亞族中的13個成員進行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。而基于鹽脅迫下栽培大豆()PP2C家族基因的全基因組學(xué)鑒定與分析的研究尚未見報道。大豆是我國重要的經(jīng)濟作物，也是食用油的主要來源，但是土壤鹽漬化導(dǎo)致的大豆減產(chǎn)問題尤為嚴重。因此，大豆PP2C基因家族成員的鑒定和耐鹽性功能探究是非常必要的。本研究對栽培大豆全基因組數(shù)據(jù)中的PP2C家族成員進行了鑒定和分析，同時對鹽處理前后的大豆地上部(莖和葉)進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，重點對差異表達基因中的PP2C家族基因進行分析，包括GO富集分析、響應(yīng)鹽脅迫的表達模式、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測和酵母雙雜交驗證，這將為闡明大豆PP2C家族基因在響應(yīng)鹽脅迫時的生理功能和分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列檢索與理化性質(zhì)分析

利用已報道的80個擬南芥AtPP2C家族成員(AtPP2C1-80)的保守蛋白序列在Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info？alias=Org_Gmax)進行比對，初步篩選AtPP2C在栽培大豆中的同源基因。然后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的在線工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進一步鑒定這些蛋白序列是否含有PP2C蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域(PF00481)，剔除不含該保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，得到大豆PP2C家族成員。通過在線工具ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測大豆PP2C家族成員的蛋白分子量(ku)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)與理論等電點(pI)。

1.2 染色體定位與進化樹構(gòu)建

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info？alias=Org_Gmax)檢索得到栽培大豆PP2C家族成員在不同染色體上的定位信息，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Glycine+max)下載大豆20條染色體全長信息，根據(jù)PP2Cs基因的染色體定位與染色體全長，利用Map Chart 2.2軟件繪制染色體定位示意圖。利用Clustal X軟件將擬南芥80個PP2C成員與大豆126個PP2C成員的氨基酸序列進行多重比對，利用MAGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)設(shè)置：NJ(Neighbor-joining)法，校驗參數(shù)Bootstrap為1 000，泊松模型。

1.3 基因與蛋白結(jié)構(gòu)分析

栽培大豆PP2C的基因、CDS和蛋白序列分別從Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得。利用大豆PP2C的基因和CDS序列在GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)圖；利用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測大豆PP2C蛋白的保守基序(Motif)，參數(shù)設(shè)置：保守基序最小長度為6，最大長度為50，最大數(shù)量設(shè)置為10。

1.4 大豆幼苗培養(yǎng)與鹽處理

實驗所用栽培大豆材料為天隆1號，將大豆種子浸泡在蒸餾水中6 h后平鋪在潤濕的濾紙上萌發(fā)2 d，待根長1.0～1.5 cm時移至石英砂中，用Hoagland營養(yǎng)液進行水培。約10 d后大豆幼苗的第一、三出復(fù)葉展開，以Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)的材料為對照，同時以含有150 mmol·LNaCl的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)的大豆材料為處理組，6 h后取地上部(莖和葉)于50 mL離心管中，液氮速凍后放于超低溫冰箱保存。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

大豆樣品(對照組和處理組分別3組生物重復(fù))送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司利用Illumina HiSeqTM 2500測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序并進行初步分析。將|log2 fold change|≥1且Q<0.05(Q值是值校正值)的基因定義為差異表達基因(DEGs)。使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PP2C家族基因的FPKM(fragments per kilobase million)值，利用Heml 1.0軟件繪制基因表達熱圖。使用在線數(shù)據(jù)庫PlantRegMap(http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/)對大豆PP2C家族基因進行GO富集分析。利用在線工具STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測大豆PP2C家族蛋白間的互作關(guān)系。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

用含有150 mmol·LNaCl的Hoagland營養(yǎng)液處理生長10 d的大豆幼苗，分別在0、3、6、12 h時取地上部(莖和葉)用于總RNA提取。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher scientific)合成cDNA，使用Bio-Rad CFX96定量PCR儀(USA，Bio-Rad)進行PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×SYBR Green Mix(康為世紀)，上下游引物各0.5 μL，9 μL稀釋后的cDNA。程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性3 min，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。利用2法計算基因的相對表達量。qRT-PCR分析所用引物通過NCBI網(wǎng)站的Primer Blast工具設(shè)計，如表1所示。

表1 qRT-PCR引物

1.7 酵母雙雜交(Y2H)

酵母雙雜交分析參照Zhao等的方法進行。根據(jù)蛋白互作預(yù)測結(jié)果，克隆289和2113基因的CDS序列，分別連接到pGBKT7載體上，構(gòu)建重組bait載體BD-289和BD-2113?？寺?47、253、258、2122基因的CDS序列，連接到pGADT7載體上，獲得重組prey載體AD-247、AD-253、AD-258和AD-2122。將bait載體和prey載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H，在SD-Leu-Trp和SD-Leu-Trp/-His培養(yǎng)基上培養(yǎng)。以pGADT7空載體與BD-289或BD-2113共轉(zhuǎn)化的Y2H菌株作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆PP2C家族基因鑒定及其染色體定位

利用80個擬南芥PP2C成員(AtPP2C1～80)在Phytozome數(shù)據(jù)庫檢索，并通過CDD工具檢測其蛋白保守結(jié)構(gòu)域，最終鑒定出126個大豆PP2C基因，根據(jù)這些基因所在的染色體順序及其基因編號，將其命名為21～2126(表2)。不同PP2C蛋白含有的氨基酸殘基數(shù)量有差異，為208～1 073 aa，其中，氨基酸殘基數(shù)量最多的是GmPP2C9(1 073 aa)，其分子量也最大；而最少的是GmPP2C64(208 aa)，相應(yīng)地其具有最小的分子量。大多數(shù)大豆PP2C蛋白(93個)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；其余33個則為穩(wěn)定蛋白。此外，GmPP2C蛋白的等電點和總平均親水性分別在4.62～9.57和-0.695～-0.014。

表2 大豆PP2C家族成員的理化性質(zhì)

利用Mapchart 2.2 軟件繪制大豆PP2C家族基因的染色體定位圖，發(fā)現(xiàn)126個2基因不均勻地分布在大豆20條染色體上(圖1)。其中，Chr10染色體上2基因數(shù)量最多，有12個；僅有1個基因(295)定位在16號染色體上。最短的染色體Chr11上共有8個2基因，而最長的Chr18染色體上只有6個。

圖1 大豆PP2C家族基因的染色體定位

2.2 基因結(jié)構(gòu)與氨基酸保守基序分析

在基因結(jié)構(gòu)方面，2基因的內(nèi)含子數(shù)量介于3～20，亞族I/J中僅有的一個成員29基因序列最長，其外顯子數(shù)量(22個)也最多；L亞族中的233次之，有11個外顯子；除了亞族L和I/J之外，其他亞族成員的外顯子數(shù)量均少于10，并且每個亞家族的基因成員都具有相似的基因結(jié)構(gòu)，如亞族B、亞族C和亞族D，幾乎所有的基因都含有4個外顯子，亞族F基因的外顯子數(shù)量介于5～8(圖3-a)。利用MEME數(shù)據(jù)庫對GmPP2C家族成員的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)保守基序Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 5在GmPP2C家族中非常保守，所有成員都具有這4種保守基序。有些Motif僅在某一亞族或是某幾個亞族中存在，如Motif 6僅出現(xiàn)在亞族E中，而Motif 8僅在亞族D中存在，Motif 9僅在亞族C中出現(xiàn)，除C、D、E、K的所有亞家族中均含有Motif 10(圖3-b)。

進化樹中包含126個大豆PP2C家族成員，80個擬南芥PP2C家族成員，共分為11個亞家族。

圖3 大豆PP2C家族成員的基因結(jié)構(gòu)(a)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(b)

2.3 系統(tǒng)進化分析

為了研究栽培大豆PP2C家族與其他物種的關(guān)系，利用已有報道獲得的擬南芥PP2C序列和本文鑒定的栽培大豆PP2C蛋白序列進行多重比對，在MEGA7軟件中對兩個物種的PP2C蛋白進行聚類。參考擬南芥PP2C家族的分組方式，大豆PP2C家族被分為11個亞族(A-H、I/J、K-L)(圖2)。其中，亞族E中GmPP2C數(shù)量最多，有22個；亞族F次之，有21個；而亞族I/J、K和L中GmPP2C數(shù)量最少，分別都只有1個。

2.4 PP2C家族基因?qū)}脅迫的響應(yīng)

對正常條件和鹽脅迫處理的大豆幼苗進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果顯示，在鹽處理后共有1 235個差異基因(logFC>1，Q value<0.05)，其中466個上調(diào)，769個下調(diào)。這些差異基因中包含9個PP2C家族基因，其中有7個上調(diào)，2個下調(diào)(圖4-b)。根據(jù)所有2基因在鹽脅迫下的FPKM值繪制基因表達熱圖(圖4-c)，241、248、272、284、289、2107和2113在鹽處理后表達水平顯著上調(diào)，227和2114在鹽處理后表達水平顯著下調(diào)。利用qRT-PCR檢測這9個基因在鹽處理不同時間的表達水平，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，證明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠。上述7個上調(diào)基因中，241和2107在鹽處理后表達量持續(xù)上升，而248、272、289和2113在鹽處理6 h表達量最高。227和2114在鹽處理后表達量下調(diào)，227隨著鹽處理時間的延長表達量逐步趨于穩(wěn)定，2114則在鹽處理6 h時表達量最低。

a，對照和鹽處理樣品的相關(guān)分析；b，差異基因數(shù)量統(tǒng)計；c，大豆PP2C基因在鹽處理前后的表達模式；d，9個差異基因的qRT-PCR結(jié)果。

2.5 PP2C家族差異基因的GO富集與蛋白互作預(yù)測

為了更好地探究大豆PP2C家族成員潛在的功能，對大豆PP2C家族中9個差異基因進行GO富集分析。發(fā)現(xiàn)這些基因均顯著富集在分子功能一類中，其中，顯著富集的GO term主要包括離子結(jié)合(ion binding)、陽離子結(jié)合(cation binding)、金屬離子結(jié)合(metal ion binding)、磷酸蛋白磷酸酶活性(phosphoprotein phosphatase activity)、磷酸酶活性(phosphatase activity)、磷酸酯水解酶活性(phosphoric ester hydrolase activity)和水解酶活性(hydrolase activity)等(圖5)。對PP2C家族成員進行蛋白互作預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)有一部分GmPP2C蛋白之間存在蛋白互作現(xiàn)象(圖6-a)，其中差異表達基因編碼蛋白GmPP2C89可能與GmPP2C53、GmPP2C58和GmPP2C122存在互作關(guān)系；而GmPP2C113蛋白可能與GmPP2C47、GmPP2C58和GmPP2C122互作。

MF，分子功能；CC，細胞組分；右邊的數(shù)值為Q值。

2.6 酵母雙雜交(Y2H)分析

根據(jù)大豆PP2C家族成員的蛋白互作預(yù)測結(jié)果(圖6-a)，構(gòu)建了289和2113基因重組bait載體BD-289和BD-2113，以及對應(yīng)的重組prey載體AD-247、AD-253、AD-258和AD-2122。bait載體和prey載體共轉(zhuǎn)化Y2H菌株，在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示，BD-289分別與pGADT7載體、AD-253、AD-258和AD-2122共轉(zhuǎn)化的Y2H菌株在SD-Leu-Trp培養(yǎng)基上均能長出菌斑，而在SD-Leu-Trp/-His培養(yǎng)基上均無法生長(圖6-b)；BD-2113分別與pGADT7載體、AD-247、AD-258和AD-2122共轉(zhuǎn)化的Y2H菌株在SD-Leu-Trp培養(yǎng)基上均能正常生長，而在SD-Leu-Trp/-His培養(yǎng)基上僅BD-2113和AD-247共轉(zhuǎn)化的菌株能夠長出菌斑(圖6-c)，表明GmPP2C113蛋白能夠和GmPP2C47互作，可能在植物生長或響應(yīng)脅迫過程中協(xié)同發(fā)揮功能。

a，蛋白互作預(yù)測網(wǎng)絡(luò)圖；b、c，酵母雙雜交驗證蛋白互作，SD/-L/-T為缺失亮氨酸和色氨酸的酵母培養(yǎng)基，SD/-L/-T/-H為缺失亮氨酸、色氨酸和組氨酸的酵母培養(yǎng)基。

3 討論

不同物種的PP2C家族成員數(shù)量存在一定的差異，擬南芥中有80個，水稻中有78個，馬鈴薯中有78個，二倍體亞洲棉()和中棉()中則分別包含87個、99個PP2C成員。126個大豆PP2C成員在基因外顯子數(shù)量、氨基酸殘基數(shù)量、分子量、等電點等方面存在較大差異。染色體定位分析表明，大豆126個2基因不均勻地分布在栽培大豆的20條染色體上(圖1)。參考擬南芥中2基因的分組方式可將大豆中的126個成員分為11個亞族(A～H、I/J、K～L)，總體上與之前有關(guān)植物PP2C家族的報道分組一致，僅在亞家族數(shù)量上存在差異。如在擬南芥和小麥中可以分為13個亞族，棉花和馬鈴薯中均可以分為12個亞族，而在水稻中僅可分為11個亞家族。大豆PP2C基因相同亞族的成員總體上具有類似或相同的基因結(jié)構(gòu)和保守基序，說明相同亞族內(nèi)的基因可能發(fā)揮類似的功能。

鹽處理后栽培大豆共有1 235個差異基因，其中466個上調(diào)，769個下調(diào)。而在這些差異基因中共包含9個PP2C家族基因(7個上調(diào)，2個下調(diào))，即241、248、272、284、289、2107和2113在鹽處理后表達水平上調(diào)，227和2114在鹽處理后表達水平下調(diào)，qRT-PCR結(jié)果也與此一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這9個差異基因中，有7個基因(241、248、272、284、289、2107和2113)屬于A亞族。研究表明，擬南芥、小麥、馬鈴薯、大豆等物種中PP2C家族A亞族中的蛋白能夠通過調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而調(diào)節(jié)植物多種生理過程和脅迫響應(yīng)，例如干旱、極端溫度和鹽脅迫等，說明栽培大豆A亞族的這7個基因可能在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。對這9個差異基因進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)主要富集的GO term為離子結(jié)合、磷酸蛋白磷酸酶活性、磷酸酶活性、磷酸酯水解酶活性和水解酶活性等，說明大豆PP2C可能主要通過其磷酸酶活性使目標(biāo)蛋白去磷酸化進而參與到脅迫響應(yīng)過程中。通過STRING預(yù)測大豆PP2C家族126個成員蛋白互作，發(fā)現(xiàn)有部分成員間可能存在互作關(guān)系，包括兩個差異基因編碼蛋白GmPP2C89和GmPP2C113。STRING數(shù)據(jù)庫是基于已公開的基因組數(shù)據(jù)進行蛋白互作預(yù)測的工具，但是預(yù)測結(jié)果需要進行實驗驗證，因為同源蛋白在不同物種中可能表現(xiàn)出不同的功能。通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，預(yù)測的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中僅GmPP2C113和GmPP2C47存在互作關(guān)系。

本研究對栽培大豆PP2C家族成員進行了全基因組學(xué)鑒定與生物信息學(xué)分析，同時通過轉(zhuǎn)錄組測序與qRT-PCR驗證，最終篩選到9個差異表達的2基因，其中，屬于亞家族A的7個成員可能在大豆鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，后續(xù)研究中將會針對這7個基因進行深入研究。