藤黃健骨片治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制*

陳天鑫，聶立聰，朱瑜琪

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院 北京 100040

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，＞65 歲的人群中發(fā)病率可達(dá)到50%，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹和活動(dòng)受限，并可導(dǎo)致肌肉萎縮和關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。OA在中醫(yī)屬于“痹證”范疇[2]，中國(guó)歷代醫(yī)家多認(rèn)為痹證的主要病因包括“風(fēng)、寒、濕”三邪，可侵犯體表，阻礙經(jīng)絡(luò)、氣血運(yùn)行[3]。藤黃健骨片（湖南方盛制藥股份有限公司）源于名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，臨床觀察數(shù)據(jù)[4]顯示其治療OA療效顯著，不僅對(duì)局部疼痛和功能障礙有明顯改善，而且能提高患者的生活質(zhì)量，幫助其恢復(fù)正常的工作和生活。研究[5]證實(shí)藤黃健骨片具有鎮(zhèn)痛、活血化瘀的作用。本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討藤黃健骨片治療OA的可能機(jī)制。

資料與方法

1 藤黃健骨片活性成分的收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）中分別以熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤及萊菔子為關(guān)鍵詞，獲得藤黃健骨片中所含藥物的化學(xué)成分。目前研究認(rèn)為，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%符合人體對(duì)藥物的利用程度[6]，類(lèi)藥性（drug-likeness， DL）＞0.18表明該成分具有成藥性的可能[7]，因此使用ADME參數(shù)篩選可能的活性小分子時(shí)，便通過(guò)設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18篩選獲得其最終活性成分。運(yùn)用TCMSP查找篩選所得活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，將所得靶點(diǎn)信息輸入U(xiǎn)niprot（https//www.uniprot.org/）獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因Symbol。

2 OA相關(guān)疾病靶標(biāo)的獲取

以“Osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[8]（https://www.Genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（https://omim.org）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)[10]（http://db.idrblab.net/ttd/）和 Drug Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)[11]（https://go.drugbank.com/）檢索與OA相關(guān)的靶標(biāo)基因，將得到的數(shù)據(jù)匯集并去重。

3 藥物-活性成分－OA疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為明確藤黃健骨片與OA潛在靶點(diǎn)間的相互作用，將藤黃健骨片活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與OA靶點(diǎn)基因?qū)隫enny網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），并繪制交集靶點(diǎn)的韋恩圖。借助 Cytoscape3.7.2 軟件把靶點(diǎn)蛋白構(gòu)筑“藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。

4 構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）和獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)

為進(jìn)一步了解靶點(diǎn)之間的相互作用，明確關(guān)鍵靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，設(shè)定物種為“Human”（人類(lèi)），在設(shè)置中設(shè)定“Highest confidence”0.9，其余設(shè)定不變， 獲取交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），并導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)的TSV格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理；通過(guò)Degree值得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html）進(jìn)行GO功能富集分析（包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、生 物 過(guò) 程（biological process，BP）和 KEGG通 路 富 集 分 析，并 運(yùn) 用GraphPad Prism軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，以體現(xiàn)藤黃健骨片治療OA的主要作用通路。

6 分子對(duì)接與最低結(jié)合能圖的構(gòu)建

使用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找藤黃健骨片關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入autodock軟件進(jìn)行能量最小化處理；并利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www1.rcsb.org/）查找關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)3D結(jié)構(gòu)，結(jié)果導(dǎo)入autodock軟件，通過(guò)去水、加氫、加電荷處理；將處理后的活性成分和靶點(diǎn)相關(guān)蛋白在AutoDock Vina軟件[12]進(jìn)行分子對(duì)接，并計(jì)算最低結(jié)合能，將最低結(jié)合能最低的一組通過(guò)Pymol 2.4.0軟件進(jìn)行可視化處理。

結(jié) 果

1 藥物活性化合物及篩選靶點(diǎn)結(jié)果

通過(guò)TCMSP平臺(tái)共收集到藤黃健骨片化合物478個(gè)，熟地黃96個(gè)，鹿銜草36個(gè)，骨碎補(bǔ)71個(gè)，肉蓯蓉25個(gè)，淫羊藿130個(gè)，雞血藤68個(gè)，萊菔子52個(gè)。以DL≥0.18、OB≥30%為篩選條件，共篩選出85個(gè)具有較高活性的化合物，分別是熟地黃2個(gè)，鹿銜草9個(gè)，骨碎補(bǔ)18個(gè)，肉蓯蓉6個(gè)，淫羊藿23個(gè)，雞血藤24個(gè)，萊菔子3個(gè)，去重后得到70個(gè)化合物的活性成分；利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋?zhuān)h去無(wú)法獲得基因symbol與重復(fù)的靶點(diǎn)，共得到251個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2 OA疾病靶點(diǎn)結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索OA疾病相關(guān)靶點(diǎn)共1305個(gè)，去重后共1015個(gè)疾病靶點(diǎn)。

3 繪制藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)圖

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藤黃健骨片治療OA的藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1，其中綠色菱形代表疾病靶點(diǎn)，紅色圓形代表藥物，六邊形代表各藥物活性成分，A1、A2、B1、B2、B3、B4、C1、C2代表藥物共有活性成分，見(jiàn)表1。根據(jù)藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖可得出Degree值前五的活性成分分別是quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和Stigmasterol（豆甾醇）。網(wǎng)絡(luò)圖說(shuō)明同一藥物活性成分對(duì)應(yīng)于不同的作用靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)于不同的藥物活性成分，顯示出藤黃健骨片治療OA多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

表1 各藥物共有活性成分表

圖1 藤黃健骨片治療OA的“藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)圖”

4 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）和關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果

將藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因?qū)隫enny網(wǎng)站，并繪制交集靶點(diǎn)的韋恩圖，見(jiàn)圖2，得到二者交集基因共117個(gè)。將交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，在設(shè)置中設(shè)定“Highest confidence”0.9，得到109個(gè)靶點(diǎn)，并導(dǎo)出TSV格式文件，用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖3，其中顏色越紅，面積越大代表degree值越大。根據(jù)degree值排名，取前十名為關(guān)鍵靶點(diǎn)見(jiàn)表2。

圖3 藤黃健骨片與OA共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藤黃健骨片治療OA關(guān)鍵靶點(diǎn)信息表

圖2 藤黃健骨片活性成分靶點(diǎn)與OA疾病相關(guān)靶點(diǎn)映射的韋恩圖

5 GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果

通過(guò)將117個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.01進(jìn)行篩選，一共得到2171條生物過(guò)程，包括對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance）、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（cellular response to organic cyclic compound）、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)（response to extracellular stimulus）等，其中前20條見(jiàn)圖4，KEGG分析共得到320條信號(hào)通路，包括癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信 號(hào) 通 路（IL-17 signaling pathway）、蛋白聚糖在癌癥中（Proteoglycans in cancer）等，其中前20條見(jiàn)圖5。為了直觀反映靶點(diǎn)和信號(hào)通路之間的聯(lián)系，對(duì)藤黃健骨片治療OA關(guān)鍵通路作了“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖，其中黃色代表信號(hào)通路；綠色代表靶點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖4 GO分析的Top20生物過(guò)程圖

圖5 KEGG分析的Top20信號(hào)通路圖

圖6 藤黃健骨片治療OA的“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”圖

6 分子對(duì)接結(jié)果與最低結(jié)合能圖

將關(guān)鍵活性成分quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、luteolin（木犀草素）與關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-6、TP53、TNF和PTGS2分別進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算最低結(jié)合能，結(jié)果見(jiàn)圖7，其中PTGS2與木犀草素、β-谷甾醇的最低結(jié)合能最低，均為-9.3kcal·mol-1，選取PTGS2與木犀草素的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 藤黃健骨片治療OA重要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接最低結(jié)合能圖

圖8 活性成分木犀草素與關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2分子對(duì)接圖

討 論

槲皮素、山奈酚、木犀草素和β-谷甾醇可能是藤黃健骨片中的關(guān)鍵成分。研究[13]表明：槲皮素通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞的炎癥和凋亡，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。其通過(guò)激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)[15-17]表明：槲皮素能通過(guò)干擾NF-κβ信號(hào)通路明顯降低IL-1β、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。山奈酚通過(guò)抑制NF-κB途徑，顯著降低白細(xì)胞介素1β刺激的大鼠OA軟骨細(xì)胞促炎介質(zhì)的表達(dá)，從而預(yù)防、停止或延遲OA的發(fā)展[18]，Huang等[19]研究顯示山奈酚的抗炎作用是通過(guò)抑制絲裂原激活蛋白激酶相關(guān)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和P38信號(hào)通路介導(dǎo)的，能顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)蛋白的表達(dá)。木犀草素能顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的NO、PGE2等的生成以及COX-2、iNOS等的表達(dá)，防止OA大鼠的軟骨破壞和增強(qiáng)II型膠原的表達(dá)[20]。木犀草素能有效減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)軟骨細(xì)胞，延緩軟骨變性[21]。β-谷甾醇等植物甾醇具有抗炎癥、抗氧化和調(diào)節(jié)人體相關(guān)激素等多種生理作用[22]。

IL-6、TP53、TNF和PTGS2可能是治療OA的潛在靶點(diǎn)。IL-6在OA關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生，并在OA的發(fā)病機(jī)制起重要作用[23]，IL-6主要通過(guò)Stat3信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分解代謝，系統(tǒng)性阻斷IL-6可減輕二甲基甲酰胺誘導(dǎo)的小鼠OA[24]，IL-6過(guò)量的產(chǎn)生已被證明與老年人膝關(guān)節(jié)軟骨丟失密切相關(guān)[25]；P53是一種腫瘤抑制基因，主要作用是在G1期或S期停止細(xì)胞周期，從而修復(fù)受損細(xì)胞[26]，zhu等[27]認(rèn)為P53上調(diào)可能促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡在KOA的進(jìn)展。TNF是觸發(fā)關(guān)節(jié)軟骨合成代謝和分解代謝失衡的介質(zhì)，能刺激MMP-1、MMP-3和MMP13的釋放，抑制OA中蛋白聚糖Ⅱ型膠原的合成[28-29]。PTGS2是炎癥性PG生物合成的關(guān)鍵酶之一，可能是潛在的炎癥性生物標(biāo)志物[30-31]，有研究也發(fā)現(xiàn)了在人類(lèi)OA軟骨細(xì)胞中高表達(dá)的PTGS2[32]，其過(guò)度表達(dá)損害蛋白聚糖的合成，增強(qiáng)軟骨中對(duì)Ⅱ型膠原和軟骨聚集蛋白聚糖的降解[33]。

IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路可能是治療OA的關(guān)鍵通路。IL-17是關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子，在自身免疫性疾病和組織炎癥中起著關(guān)鍵作用[34]，阻斷IL-17信號(hào)通路可以有效預(yù)防及治療OA[35]。HIF - 1α是低氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子之一，在骨建模、骨重塑和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。其通過(guò)激活JAK2/STAT3通路增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化[36]；了解參與HIF-1α信號(hào)通路的多態(tài)性之間的相互作用，可以為識(shí)別膝骨性關(guān)節(jié)炎高危人群提供新的診斷支持工具[37]。JAK/STAT信號(hào)的激活對(duì)于使OA發(fā)展為滑膜關(guān)節(jié)衰竭的慢性炎癥狀態(tài)持續(xù)存在至關(guān)重要[38]。Lim等[39]研究發(fā)現(xiàn)阻斷該信號(hào)通路可能在軟骨退變中具有軟骨保護(hù)作用。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討藤黃健骨片治療OA的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)藤黃健骨片中的槲皮素、木犀草素、山奈酚和β-谷甾醇等很可能通過(guò) IL-6、TP53、TNF和PTGS2等靶點(diǎn)作用于IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療OA的作用。但是由于數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完整、不同算法預(yù)測(cè)的結(jié)果不同等原因[40]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍然有很大的局限性，需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。