孤兒核受體TR4在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的表達(dá)變化及浙八味煎劑的干預(yù)作用

溫晉鋒 戴澤 鄧凱莉 楊冬雪 楊萍 唐春蘭 周玉平*

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為全球主要的慢性肝?。?］。NAFLD 為一組疾病，具體包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。目前對(duì)于NAFLD 還沒(méi)有批準(zhǔn)的治療藥物［3］，而對(duì)于NASF、HCC 的治療更是缺乏有效手段［4］。本課題組前期研究證實(shí)，基于浙江道地藥材為主的驗(yàn)方“浙八味煎劑”對(duì)NAFLD 及相關(guān)的肝纖維化具有明顯的干預(yù)效應(yīng)［5-6］，并獲得了國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)［7］，但其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。孤兒核受體TR4（Testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關(guān)［8］，基因敲除小鼠模型研究證實(shí)TR4 與肝臟脂肪代謝有關(guān)［9］，但尚未進(jìn)一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機(jī)制。本研究擬通過(guò)小鼠模型，探究TR4 蛋白在非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型中的表達(dá)變化及“浙八味煎劑”的干預(yù)作用，旨在進(jìn)一步探尋NAFLD 的干預(yù)靶標(biāo)，并探究中藥驗(yàn)方“浙八味煎劑”對(duì)NAFLD的療效和機(jī)制，為研發(fā)安全有效的中藥新藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J ♂小鼠，體重（24±3）g，共32 只，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0008。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2019-0005，本研究經(jīng)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（MCD，批號(hào)TP3005G）及對(duì)照飼料（MCS，批號(hào)TP3005Gs）購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司；甘油三酯（TG，批號(hào)A110-1-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)C009-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)C010-2-1）、總膽紅素（TBIL，批號(hào)C019-1-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TNF-α（F2163-A）、IL-1β（F2040-A）、IL-6（F2132-A）購(gòu)自上?？婆d。BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit，批號(hào)E-BC-K318-M，Elabscience）；油紅O 染色液（批號(hào)G1261）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Rabbit Anti TR4（PP-H0107B-00）購(gòu)自美國(guó)RnD Systems 公司；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批號(hào)HC301-01）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（批號(hào)HS201-01）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)HS101-01），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 （1）動(dòng)物分組和造模：適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4 組即正常組（N）、模型組（M）、浙八味煎劑高劑量組（H）、低劑量組（L），每組8 只。除正常組外的小鼠均進(jìn)行造模，采用蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)+每周一次腹腔注射10% CCl4-橄欖油溶液，劑量為2 mL/kg，共6 周。正常組小鼠僅給予MCS 飼料常規(guī)喂養(yǎng)。（2）浙八味煎劑制備及給藥方法：按本課題組建立的方法［7］，浙八味煎劑成人一日劑量：浙貝母12 g、溫郁金12 g、白術(shù)15 g、杭白菊12 g、白芍12 g、杭麥冬12 g、玄參12 g、延胡索9 g，生藥量共96 g。取兩劑生藥，常規(guī)水煎兩次混合，旋蒸發(fā)至濃度為0.7、0.35 g/mL 兩種濃度。按70 kg 成人與小鼠體表面積換算法，小鼠每日每千克體重的高、低劑量分別為14 g 和7 g 生藥量，每日灌胃兩種濃度的藥液為20 mL/kg，自造模第3 周首日開(kāi)始，每日灌胃一次，共4 周。（3）標(biāo)本留取方法：6 周末各組動(dòng)物禁食12 h，麻醉后打開(kāi)腹腔，下腔靜脈采血，切取肝臟，選1 塊置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于石蠟包埋；另取一葉切成方形，OTC 包埋后液氮速凍用于制備冰凍切片；其余液氮速凍后-70℃保存。（4）生化指標(biāo)和炎癥因子檢測(cè)：炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 均采用ELISA 試劑盒，操作步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清、TG 含量檢測(cè)及ALT、AST、TBil 活性檢測(cè)均采用生化試劑盒進(jìn)行。（5）組織病理學(xué)觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE 染色、Masson 染色觀察組織炎癥和膠原增生情況。制作肝組織冰凍切片，油紅O 染色觀察肝組織脂肪沉積情況。（6）Western blott：提取組織蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行凝膠電泳2 h，后轉(zhuǎn)PVDF 膜2 h，孵育TR4 一抗，4℃過(guò)夜；孵育二抗溶液，室溫放置60 min，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶。軟件分析抗體條帶灰度值，再進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)。（7）免疫組化：石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、通透預(yù)處理后，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗TR4（1 ∶100），放入濕盒中，4℃孵育過(guò)夜，取出4℃孵育過(guò)夜?jié)窈?，室溫靜置45 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次5 min，滴加HRP（m）（1 ∶100），37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS 或自來(lái)水沖洗1 min 后蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán)，自來(lái)水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浙八味煎劑對(duì)肝組織病理的影響 HE 染色顯示，模型組肝組織可見(jiàn)大量脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿脂滴空泡，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，浙八味煎劑干預(yù)后脂肪變性和炎癥反應(yīng)程度都明顯減輕，其中高劑量組效果更好，見(jiàn)圖1。Masson 染色顯示，模型組肝組織膠原沉積明顯增加，竇周可見(jiàn)膠原纖維形成細(xì)絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，局部可見(jiàn)纖維組織增生；浙八味煎劑高劑量組干預(yù)后膠原沉積明顯減少，見(jiàn)圖2。

圖1 浙八味煎劑對(duì)模型小鼠肝臟纖維化的影響。A. Masson染色（×100倍）膠原纖維呈藍(lán)色；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。B. 膠原容積分?jǐn)?shù)，與正常組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

圖2 浙八味煎劑對(duì)模型小鼠肝功能和總膽固醇水平的影響。高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與正常組的血清TG含量（A）、肝組織TG含量（B）、血清AST（C），血清ALT（D）以及Tbil（E）的比較；N：正常組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：TG，甘油三酯；ALT谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST谷草轉(zhuǎn)氨酶；TBil總膽紅素。與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 浙八味煎劑對(duì)肝組織脂質(zhì)代謝和肝功能的影響 與正常組相比，模型組肝臟中TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量顯著升高（P＜0.01），表明模型小鼠出現(xiàn)了脂代謝紊亂和肝臟脂質(zhì)蓄積，并造成了肝臟損傷；小鼠經(jīng)浙八味煎劑連續(xù)灌胃給藥4 周后，肝組織TG 含量、ALT 與AST 活性和TBil 含量降低，與模型組相比具有差異（P＜0.05 或P＜0.01），提示了浙八味煎劑可以逆轉(zhuǎn)模型小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性與損傷，見(jiàn)圖3。

圖3 浙八味煎劑對(duì)小鼠肝臟炎癥因子的影響。高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠、藥物處理后的脂肪肝小鼠與對(duì)照組的IL-1β表達(dá)（A）、IL-6 表達(dá)（B）、TNF-α表達(dá)（C）的比較；N：對(duì)照組，M：模型組，H：浙八味煎劑高劑量組，L：浙八味煎劑低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 浙八味煎劑對(duì)肝組織炎癥反應(yīng)的影響 通過(guò)ELISA 檢測(cè)模型小鼠肝組織炎癥因子的表達(dá)水平，與正常組相比，模型小鼠肝組織中內(nèi)IL-1β 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），浙八味煎劑高劑量組降低模型組IL-1β 的表達(dá)（P＜0.05）。IL-6 和TNF-α 的表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)正常組和模型組有差異，但與模型組相比，浙八味煎劑高劑量組能降低兩個(gè)炎癥因子的表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 免疫組化檢測(cè)浙八味煎劑對(duì)肝組織TR4蛋白表達(dá)的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組

2.4 浙八味煎劑對(duì)肝組織TR4 蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)Western blot 和免疫組化觀察了模型小鼠肝組織TR4 蛋白表達(dá)變化及浙八味煎劑的干預(yù)作用，與正常組相比，模型組肝組織中TR4 蛋白的表達(dá)明顯增多，陽(yáng)性表達(dá)主要分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿（P＜0.01）。浙八味煎劑干預(yù)能降低TR4 蛋白的表達(dá)，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白免疫印跡檢測(cè)浙八味煎劑對(duì)肝組織TR4蛋白表達(dá)的影響。N：正常組，M：模型組，H：浙八味高劑量組，L：浙八味低劑量組。注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

近年研究顯示，孤兒核受體TR4 與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關(guān)，但尚未進(jìn)一步深入研究其在脂肪肝中的作用及機(jī)制。KIM 等［10］通過(guò)TR4 基因敲除小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及原代肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TR4 介導(dǎo)肝臟硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD1）基因表達(dá)，降低胰島素的敏感度，而敲除TR4 可以抑制SCD1 表達(dá)，并可以減少脂肪沉積及增加胰島素的敏感度。LIU 等［11］研究還發(fā)現(xiàn)，空腹和胰高血糖素介導(dǎo)的信號(hào)cAMP/PKA 和C/EBP 信號(hào)通路可以激活TR4 導(dǎo)致糖異生。此外，TR4在促進(jìn)脂質(zhì)代謝中也發(fā)揮了重要作用。YOSHIZAWA 研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組蛋白去乙?；窼IRT7 基因敲除小鼠，由于TR4 表達(dá)水平的降低，表現(xiàn)出對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變、肥胖、糖耐量受損的抵抗作用［12］。KIM等［13］通過(guò)基因敲除小鼠研究證實(shí)，TR4 調(diào)節(jié)ApoE 基因表達(dá)，TR4 的缺失下調(diào)肝細(xì)胞中載脂蛋白E/C-I 和C-II 基因表達(dá)。

綜上所述，TR4 能導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，增加胰島素抵抗，促進(jìn)甘油三酯在肝臟堆積，但既往的研究主要集中在代謝綜合征領(lǐng)域。由于胰島素抵抗及脂代謝紊亂在NASH 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵作用，筆者推測(cè)TR4 蛋白可能是NAFLD 的發(fā)病機(jī)制之一。本研究通過(guò)建立NAFLD 疾病模型，研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD 動(dòng)物模型中，肝組織TR4 蛋白的表達(dá)較正常組明顯升高。浙八味煎劑能明顯減少脂肪在肝內(nèi)沉積，逆轉(zhuǎn)TR4 蛋白的升高，減輕肝組織的炎癥反應(yīng)。提示TR4 可能作為浙八味煎劑的效應(yīng)靶點(diǎn)，從而緩解了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展。本研究不足之處為此次研究?jī)H是對(duì)TR4 在NASF 模型中表達(dá)變化及中藥復(fù)方干預(yù)作用的一個(gè)初步觀察，推測(cè)TR4 可能的一個(gè)有效的干預(yù)靶標(biāo)，如果需要更明確這一論點(diǎn)，還需要使用TR4-/-小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證。