囊胚形態(tài)與整倍體率及單整倍體囊胚移植妊娠結(jié)局的關(guān)系

師贊，孫婷，劉茜桐，師娟子，柏海燕

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003)

如何選擇發(fā)育潛能更高的單胚胎移植是輔助生殖技術(shù)(ART)中最主要的挑戰(zhàn)之一[1]。形態(tài)學(xué)評(píng)分是目前應(yīng)用最廣泛的胚胎質(zhì)量評(píng)估方法，但由于存在觀察者的主觀誤差，導(dǎo)致該方法并不十分準(zhǔn)確全面[2]。即使使用形態(tài)學(xué)達(dá)標(biāo)的單囊胚移植，妊娠率也僅有42.6%～65.4%[3-4]。非整倍體現(xiàn)象普遍存在于體外受精胚胎中，這是導(dǎo)致妊娠失敗的主要遺傳因素，臨床表現(xiàn)為胚胎植入失敗或流產(chǎn)，降低了輔助生殖效率，增加了醫(yī)療資源浪費(fèi)及患者經(jīng)濟(jì)壓力[5]。胚胎植入前非整倍體檢測(cè)技術(shù)(PGT-A)是在卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的基礎(chǔ)上，對(duì)經(jīng)形態(tài)學(xué)選擇的囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢，篩選出整倍體囊胚進(jìn)行移植，有效縮短了至活產(chǎn)時(shí)間，提高了ART效率[6]。本研究通過探討胚胎形態(tài)學(xué)分級(jí)與染色體倍性之間的關(guān)系，及胚胎形態(tài)學(xué)分級(jí)在預(yù)測(cè)單整倍體囊胚移植后妊娠結(jié)局中的價(jià)值，以期為移植時(shí)的胚胎選擇提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析2016年9月至2019年4月于西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心完成囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢的PGT-A周期的臨床資料，活產(chǎn)數(shù)據(jù)隨訪至2021年3月?；顧z囊胚采用Gardner囊胚分級(jí)法，對(duì)于擴(kuò)張度3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分均≥C級(jí)的囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢。根據(jù)囊胚活檢時(shí)Gardner形態(tài)學(xué)評(píng)分分為2組，優(yōu)質(zhì)囊胚組：擴(kuò)張度3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞評(píng)分均≥B級(jí)，共納入囊胚394枚；非優(yōu)質(zhì)囊胚組：達(dá)活檢標(biāo)準(zhǔn)的非優(yōu)質(zhì)囊胚，共納入囊胚1 191枚。本研究經(jīng)西北婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào)：2021002)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：入組夫婦均符合PGT-A指征[7]：(1)夫妻一方染色體異常(平衡易位或羅氏異位、Y染色體微缺失等)；(2)不明原因反復(fù)妊娠丟失(RPL)；(3)不明原因反復(fù)種植失敗(RIF)；(4)既往曾有染色體非整倍體胚胎流產(chǎn)或染色體非整倍體胎兒出生；(5)女方高齡(≥38歲)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因細(xì)胞量不足或擴(kuò)增失敗導(dǎo)致無法檢測(cè)或檢測(cè)失敗的胚胎；(2)夫妻一方患有單基因病；(3)女方卵巢儲(chǔ)備功能明顯下降；(4)女方合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病無法耐受妊娠等。

二、研究方法

1.體外受精、胚胎培養(yǎng)：所有患者均采用常規(guī)卵巢刺激方案，成熟卵母細(xì)胞行ICSI授精，ICSI后16～18 h評(píng)估受精結(jié)果。出現(xiàn)2個(gè)原核(2PN)的受精卵為正常受精胚胎，對(duì)D3可用胚胎繼續(xù)序貫培養(yǎng)至囊胚期。囊胚評(píng)分采用Gardner囊胚分級(jí)法[8]：擴(kuò)張度3期以上、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分均≥C級(jí)的囊胚為可活檢囊胚。

2.胚胎活檢及PGT-A檢測(cè)：(1)囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢。在3點(diǎn)處遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處激光打孔，使用活檢針從透明帶開口處負(fù)壓抽吸5～10個(gè)細(xì)胞送檢，將活檢后的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存；(2)采集滋養(yǎng)層細(xì)胞后，應(yīng)用全基因組擴(kuò)增技術(shù)(whole genome amplification，WGA)，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，可得到堿基序列讀段(reads)，通過與人類基因組參考序列對(duì)比，從而判斷染色體正常、重復(fù)與缺失。對(duì)4 Mb及以上拷貝數(shù)變異囊胚判定為非整倍體胚胎。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，整倍體囊胚判定為可用胚胎，擇期進(jìn)行單囊胚解凍移植。非整倍體及高比例嵌合囊胚判定為不可用胚胎。

3.解凍移植及隨訪：人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，待內(nèi)膜厚度超過8 mm后，給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，當(dāng)黃體酮補(bǔ)充至第6天時(shí)復(fù)蘇冷凍胚胎進(jìn)行移植。移植低比例嵌合胚胎須跟患者溝通，充分知情同意并告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，患者夫妻書面同意后方可進(jìn)行。移植后繼續(xù)黃體支持，第12天檢測(cè)血人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)判斷是否妊娠，移植后28～35 d行超聲檢查明確臨床妊娠情況。所有妊娠病例均隨訪至子代出生。

4.結(jié)局指標(biāo)：(1)主要研究指標(biāo)：整倍體率=整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(2)次要研究指標(biāo)：非整倍體囊胚率=非整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%；質(zhì)控不合格率=質(zhì)控不合格囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%；嵌合體囊胚率=嵌合體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%；自然流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基線資料及活檢囊胚情況

PGT-A共完成380個(gè)周期，共活檢囊胚1 585枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚394枚(優(yōu)質(zhì)囊胚組)，非優(yōu)質(zhì)囊胚1 191枚(非優(yōu)質(zhì)囊胚組)，兩組PGT-A具體指征見表1。兩組間女方年齡、女方體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、獲卵數(shù)、Gn天數(shù)、基礎(chǔ)FSH(bFSH)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 PGT-A指征及活檢囊胚數(shù)(n)

表2 兩組患者基線資料比較

二、囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與PGT-A檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系

PGT-A檢測(cè)結(jié)果分為整倍體、非整倍體、嵌合體(30%≤染色體數(shù)目異常細(xì)胞占活檢細(xì)胞比例≤80%)及質(zhì)控不合格(N/A)。優(yōu)質(zhì)囊胚組的整倍體率顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，非整倍體率、嵌合體率、質(zhì)控不合格率顯著低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)(表3)。

表3 兩組間囊胚活檢及PGT-A結(jié)果分析(%)

三、囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與單整倍體囊胚移植妊娠結(jié)局的關(guān)系

經(jīng)PGT-A檢測(cè)出的整倍體囊胚共622枚，擇期進(jìn)行單整倍體囊胚移植共329個(gè)周期，其中優(yōu)質(zhì)囊胚組移植119個(gè)周期，非優(yōu)質(zhì)囊胚組移植210個(gè)周期，活產(chǎn)情況隨訪至2021年3月。比較兩組間的妊娠結(jié)局，優(yōu)質(zhì)囊胚組的HCG陽性率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率略高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，流產(chǎn)率略低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，但兩組間差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 兩組整倍體囊胚移植的妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是治療不孕癥的有效方法，成功妊娠是IVF的主要目標(biāo)。胚胎倍性是預(yù)測(cè)種植和妊娠能否成功的重要因素，因此篩選出具有發(fā)育潛能的整倍體胚胎進(jìn)行移植尤為重要[9]。目前大部分輔助生殖中心嘗試通過更有效的形態(tài)學(xué)評(píng)分方法挑選出更優(yōu)質(zhì)的胚胎來提高妊娠率，包括制定嚴(yán)格的胚胎評(píng)分流程[8，10]、借助動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)(time-lapse imaging)等[11]，但妊娠率仍不盡滿意，徘徊在40%～60%之間，其主要原因在于無論是靜態(tài)或動(dòng)態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)估方法都無法確定胚胎的整倍體性[11-12]。染色體異常對(duì)胚胎常具有致死性效應(yīng)，PGT-A采用基于高通量二代測(cè)序方法，可進(jìn)一步提高囊胚整倍體性評(píng)估的靈敏度和分辨率，從而改善妊娠結(jié)局[6]。但PGT-A有嚴(yán)格的臨床應(yīng)用指征[7]，且因技術(shù)要求高，國(guó)家僅批準(zhǔn)少數(shù)生殖中心開展，故大部分生殖中心的多數(shù)IVF周期只能根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)分篩選胚胎。因此，總結(jié)PGT-A相關(guān)數(shù)據(jù)，探討胚胎形態(tài)學(xué)與染色體倍性之間的關(guān)系，對(duì)于胚胎選擇具有重要參考意義。

目前囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分多采用Gardner系統(tǒng)，分別對(duì)囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)外胚層進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，將囊胚分為高、一般及低質(zhì)量等級(jí)[8]。囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與整倍體檢測(cè)結(jié)果具有相關(guān)性，評(píng)分更高的囊胚整倍體率更高[13]，這一相關(guān)性解釋了優(yōu)質(zhì)囊胚具有更高的種植潛能的原因，也提供了臨床實(shí)踐中優(yōu)先移植優(yōu)質(zhì)囊胚的依據(jù)。但過分倚重形態(tài)學(xué)評(píng)分往往誘導(dǎo)患者輕視非優(yōu)質(zhì)囊胚的價(jià)值，尤其當(dāng)沒有優(yōu)質(zhì)囊胚或優(yōu)質(zhì)囊胚移植失敗、僅剩余非優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí)，患者往往對(duì)移植結(jié)局沒有信心，甚至要求廢棄剩余囊胚重新取卵。本研究結(jié)果表明，非優(yōu)質(zhì)囊胚中仍有37.28%為整倍體囊胚。進(jìn)一步對(duì)非優(yōu)質(zhì)整倍體囊胚的妊娠結(jié)局進(jìn)行追蹤，并與優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解凍移植后仍有67.62%獲得了臨床妊娠，其HCG陽性率、臨床妊娠率、自然流產(chǎn)率及活產(chǎn)率與優(yōu)質(zhì)整倍體囊胚組相比均無顯著性差異(P>0.05)。這也進(jìn)一步證明胚胎發(fā)育潛能主要與染色體倍性相關(guān)[5]。胚胎具有自我糾正的能力，其可能機(jī)制包括染色體異常的卵裂球凋亡、染色體異常細(xì)胞定向發(fā)育，以及非整倍體細(xì)胞自我糾正等[14]。2014年Fragouli等[15]的研究結(jié)果表明，在胚胎卵裂階段胚胎的倍性與其形態(tài)學(xué)無關(guān)，但良好形態(tài)評(píng)分的囊胚和更快進(jìn)入囊胚階段的胚胎整倍體率更高。因此，繼續(xù)培養(yǎng)可將存在潛在遺傳異常的胚胎淘汰，通過囊胚的形成進(jìn)一步選擇有發(fā)育潛能的胚胎。

囊胚的非整倍體性廣泛存在，本研究中優(yōu)質(zhì)囊胚的整倍體率僅45.18%，而非優(yōu)質(zhì)囊胚的整倍體率也有37.28%。非優(yōu)質(zhì)囊胚組的非整倍體率及嵌合體率更高(P<0.05)，意味著非優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床移植具有更高的生殖風(fēng)險(xiǎn)，因此非優(yōu)質(zhì)囊胚更需要進(jìn)行PGT-A來避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。2019年Cimadomo等[16]經(jīng)研究認(rèn)為非優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行囊胚活檢及PGT-A檢測(cè)更具臨床價(jià)值及可操作性。因此在臨床操作中不能矯枉過正，放棄非優(yōu)質(zhì)囊胚的活檢機(jī)會(huì)或移植機(jī)會(huì)。繼續(xù)培養(yǎng)過程本身是對(duì)胚胎發(fā)育潛能的一種選擇，形態(tài)學(xué)可用囊胚已經(jīng)經(jīng)歷了優(yōu)勝劣汰，故應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待非優(yōu)質(zhì)囊胚，尤其對(duì)于高齡女性，獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的可能性下降，因此經(jīng)歷過繼續(xù)培養(yǎng)后獲得的可用囊胚更顯珍貴，同樣具有應(yīng)用價(jià)值。

本研究中所有移植周期均為單整倍體囊胚移植，妊娠結(jié)局顯示優(yōu)質(zhì)囊胚組妊娠結(jié)局傾向于更優(yōu)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。整倍體囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分并不影響其妊娠結(jié)局，并且即使是非優(yōu)質(zhì)囊胚中的整倍體胚胎，活產(chǎn)率仍達(dá)57.14%。因此對(duì)于整倍體囊胚，移植時(shí)無需過于關(guān)注其囊胚分級(jí)，更無需因整倍體囊胚的評(píng)分較差而放棄移植[17-18]。

綜上所述，形態(tài)學(xué)評(píng)分為優(yōu)質(zhì)的囊胚更傾向?yàn)檎扼w囊胚，但是囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分并不影響整倍體囊胚的妊娠結(jié)局。對(duì)于整倍體囊胚而言，囊胚形態(tài)可能不是需要考慮的關(guān)鍵因素。