多環(huán)芳烴共代謝對(duì)苯并[a]蒽微生物降解的影響及機(jī)制

朱清禾,曾 軍,吳宇澄,楊 潔,林先貴*

多環(huán)芳烴共代謝對(duì)苯并[a]蒽微生物降解的影響及機(jī)制

朱清禾1,2,曾 軍1,吳宇澄1,楊 潔2,林先貴1*

(1.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所,土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210008；2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院,國(guó)家環(huán)境保護(hù)城市土壤污染控制與修復(fù)工程技術(shù)中心,上海 200233)

利用14C同位素示蹤技術(shù),研究土壤中菲、蒽、芘3種底物對(duì)苯并[a]蒽(BaA)環(huán)境歸趨的影響,高通量測(cè)序解析細(xì)菌群落響應(yīng).結(jié)果表明,3種底物均可以促進(jìn)BaA的降解,添加蒽作為共代謝底物后,BaA礦化率比對(duì)照提高了2.5%,而添加菲、芘時(shí),14C在土壤的結(jié)合態(tài)比對(duì)照升高4%,達(dá)總添加量的31%.共代謝底物改變了細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):添加底物蒽后,網(wǎng)絡(luò)中的正連接比例顯著升高,物種間以共生關(guān)系為主;菲、芘作為共代謝底物時(shí),細(xì)菌物種間的負(fù)連接比例升高,暗示微生物種群競(jìng)爭(zhēng)變激烈.推測(cè)蒽與BaA化合物結(jié)構(gòu)相似并有相近的代謝途徑,細(xì)菌共生性增強(qiáng)并直接促進(jìn)了BaA的礦化.

苯并[a]蒽；環(huán)境歸趨；共代謝；細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類主要由人類生產(chǎn)生活產(chǎn)生的稠苯類化合物,一般具有致癌、致畸、致突變的三致效應(yīng),是土壤及地下水環(huán)境中重點(diǎn)管控污染物[1].高分子量PAHs(四環(huán)及以上),生物利用性低,在土壤中更易于持久殘留,成為PAHs污染土壤修復(fù)的重點(diǎn)與難點(diǎn).

共代謝是指添加另一種化合物作為碳源促進(jìn)微生物降解有機(jī)物的過(guò)程,是提高PAHs生物降解的常用手段之一.已知的PAHs共代謝底物包括:簡(jiǎn)單的有機(jī)酸(如水楊酸、鄰苯二甲酸、香草酸)[2-3]、低分子量PAHs(如萘、芴、菲)[4]、石油烴等.李政等[4]發(fā)現(xiàn),芴、菲可以將芘的降解效率提高35%左右,并且芴和菲還能加速芘中間產(chǎn)物的去除,減少環(huán)境的二次污染.對(duì)比不同類型的共代謝底物,小分子PAHs的共代謝效果甚至可能優(yōu)于有機(jī)酸[5],菲可以將紅壤中的苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化率提高至70%,顯著高于對(duì)照(50%),而鄰苯二甲酸對(duì)紅壤苯并[a]芘降解率影響不明顯.有研究者認(rèn)為共代謝底物結(jié)構(gòu)是影響PAHs效率的重要因素:底物與污染物結(jié)構(gòu)相似性越高,共代謝發(fā)生的概率越大[6].底物在降解過(guò)程刺激相關(guān)功能菌的生長(zhǎng),進(jìn)而影響相關(guān)功能酶活性,例如萘、菲能夠提高多酚氧化酶活性[7]、木質(zhì)素則增強(qiáng)原兒茶酸-4,5-雙加氧酶[3]等,這些非特異性酶類增強(qiáng)表達(dá)可轉(zhuǎn)化高環(huán)PAHs,從而促進(jìn)微生物共代謝降解.

污染物進(jìn)入土壤除了被微生物降解礦化形成CO2外,還會(huì)與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合生成結(jié)合態(tài)殘留[8],這兩種去向都可以促進(jìn)土壤中污染物的解毒,但背后的機(jī)理及對(duì)環(huán)境的影響存在差異,其中礦化是污染物最徹底的解毒方式.目前,PAHs共代謝降解作用機(jī)制多在模擬體系下進(jìn)行,而在真實(shí)土壤介質(zhì)中開(kāi)展的研究相對(duì)較少.Sun等[3]研究發(fā)現(xiàn),盡管香草酸是木質(zhì)素的單體,兩者有類似的結(jié)構(gòu)單元,對(duì)微生物的影響有相似之處,但兩者對(duì)BaA的環(huán)境歸趨影響存在差異:木質(zhì)素主要促進(jìn)BaA土壤結(jié)合態(tài)的生成,而香草酸可以提高BaA的礦化率,這種差異可能來(lái)自于微生物群落及代謝途徑.微生物是污染物降解的主要驅(qū)動(dòng)力,也是影響污染物環(huán)境歸趨的重要因素[9],共代謝底物對(duì)微生物的影響會(huì)改變污染物降解過(guò)程及環(huán)境去向.盡管有研究者認(rèn)為共代謝底物與污染物結(jié)構(gòu)類似時(shí),更易促進(jìn)污染物的降解,但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索.本研究選擇菲、蒽、芘3種PAHs作為共代謝底物,以BaA為土壤中代表性的難降解PAHs污染物,分析共代謝底物結(jié)構(gòu)對(duì)BaA在各處理土壤組分間分配及土壤細(xì)菌群落響應(yīng),為發(fā)展高分子量PAHs污染土壤共代謝修復(fù)技術(shù)提供支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

采集南京梅山寶鋼周邊的農(nóng)田表層土壤(31.90°N, 118.61°E),土壤性質(zhì)如表1所示,挑出植物根系,風(fēng)干、磨碎,過(guò)2mm篩備用.菲、蒽、芘、BaA購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,[7, 12-14C]BaA(購(gòu)自于American Radiolabeled Chemicals, Inc. Missouri, USA),污染物提取過(guò)程中所用到的試劑(如二氯甲烷、正己烷等)均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.FastDNA?SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)用于提取土壤中微生物的DNA.

表1 供試土壤理化性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

人工污染土壤的配制:稱取適量的帶標(biāo)記和未標(biāo)記的BaA,混合后溶于丙酮,配制成5mg/mL、33kBq/mL BaA溶液,將上述溶液以10%的比例,少量多次分別加入供試土樣中并攪拌均勻,得到500mg/kg、3.3kBq/g的BaA污染土壤.用相似的方法分別配制未標(biāo)記的菲(50mg/kg)、蒽(50mg/kg)、芘(50mg/kg)污染土壤,將以上人工污染土壤置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)丙酮過(guò)夜.稱取BaA污染土壤1g、菲污染土壤1g及未污染的土樣3g于礦化管中并混合均勻,得到BaA(終濃度100mg/kg)、菲(終濃度10mg/kg)混合污染土壤.用相同的方法配制蒽-BaA及芘-BaA混合污染土壤.調(diào)節(jié)含水量至土壤最大持水量的60%,28℃暗室恒溫培養(yǎng)2個(gè)月.礦化管用橡膠塞封口,并在橡膠塞下懸掛一個(gè)塑料小管,其中裝入1mL 1mol/L NaOH溶液,用于吸收釋放的CO2.培養(yǎng)結(jié)束后,用液體閃爍分析儀(LSC, Beckman-Coulter, USA)測(cè)定NaOH中14CO2的含量,收集培養(yǎng)的土壤,一部分風(fēng)干后分析污染物在不同組分間的分配,另一部分土壤于-40℃分析微生物群落.

1.3 PAHs可提取態(tài)和結(jié)合態(tài)的測(cè)定

污染物土壤可提取態(tài):將風(fēng)干后的土壤研磨過(guò)20目篩,取2.0g過(guò)篩土壤,置于索氏提取儀中,二氯甲烷提取24h.旋轉(zhuǎn)蒸干二氯甲烷后加入2mL環(huán)己烷溶解PAHs,C-18柱(3mL:0.5g)固相萃取法純化浸提液,洗脫液(體積比正己烷:二氯甲烷=1:1).得到可提取態(tài)的污染物,取1mL洗脫液測(cè)定標(biāo)記量.

胡敏素結(jié)合態(tài):將二氯甲烷提取后的土樣風(fēng)干,取1.5g該土樣于10mL的離心管中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)的狀態(tài)下加入6mL 0.1mol/L NaOH溶液.250r/min速度振蕩24h后,16000離心30min(Eppendorf 5804R,德國(guó)),沉淀為胡敏素,上清液為腐殖酸與富里酸的混合溶液.盡量倒盡剩余提取液,將沉淀(胡敏素)冷凍干燥后(完全去水),取約0.5g(計(jì)量)碾磨樣品燃燒法測(cè)定標(biāo)記量

腐殖酸與富里酸結(jié)合態(tài):取出上述富里酸+腐殖酸提取液(約4mL),吸取0.5mL(計(jì)量)測(cè)定標(biāo)記,得到混合溶液的標(biāo)記量.另取2mL(計(jì)量)上述腐殖酸與富里酸混合溶液,加入6mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH=1.0,4℃沉淀24h.5100g離心10min,吸取上清測(cè)定即為富里酸結(jié)合態(tài)的標(biāo)記物.

NaOH溶液、富里酸溶液、混合溶液(富里酸、腐殖酸)中的標(biāo)記物含量,用LSC直接測(cè)定得到,將混合溶液的標(biāo)記量減去富里酸溶液的標(biāo)記量得到腐殖酸中的標(biāo)記物含量;胡敏素中的標(biāo)記量用生物氧化燃燒儀(OX-500; Zinsser Analytic,德國(guó))在900℃下完全氧化4min,用15mL的堿性放射性測(cè)定閃爍液(Oxysolve C-400; Zinsser Analytic,德國(guó))收集氧化后的氣體,LSC測(cè)定標(biāo)記量,得到胡敏素中的標(biāo)記物含量.

1.4 土壤DNA的提取及高通量測(cè)序

用FastDNA? SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA),提取土壤中總DNA,具體操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書,用80μL無(wú)菌水洗脫并用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)測(cè)定DNA的濃度,提取完成后-20 ℃保存.

Illumina Miseq高通量測(cè)序分析細(xì)菌群落:細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物為519F/907R(CAGCMGCCG- CGGTAATWC/CCGTCAATTCMTTTRAGTTT),每個(gè)樣品的上游引物序列中包含有5bp的特異標(biāo)簽序列(Barcode)用于區(qū)分不同樣品.PCR擴(kuò)增條件為:① 95℃ 5min,② 95℃ 45s,③ 57℃ 45s,④ 72℃ 1min(第2步到第4步35個(gè)循環(huán)),⑤72℃ 7min.擴(kuò)增完成后,以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物用Cycle Pure Kit (Omega, Georgia, USA)進(jìn)行純化并測(cè)定濃度,純化步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書.取相同質(zhì)量各樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合,使混合樣品的DNA的總濃度達(dá)100ng.TruSeqTMDNA Sample Prep LT Kit和MiSeq Reagent Kit進(jìn)行Illumina上機(jī)測(cè)序前的預(yù)處理.

1.5 高通量測(cè)序結(jié)果分析

高通量測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用Quantitative Insights into Microbial Ecology 1.9.0(QIIME 1.9.0)進(jìn)行序列比對(duì)及聚類.將序列按barcode進(jìn)行分組,根據(jù)序列質(zhì)量(質(zhì)量評(píng)分>25,長(zhǎng)度>200bp)篩選樣品生成聚類單元(OTU).相似度高于97%的序列歸為相同的OTU,并從每個(gè)OTU中挑選代表序列與SILVA119數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)歸類,得到OTU的分類信息.為減少細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度,僅將相對(duì)豐度大于0.1%的OTU用于網(wǎng)絡(luò)分析,選擇相關(guān)性||>97%且顯著性<0.05的數(shù)值進(jìn)行共生網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建.

1.6 數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌群落非度量多維尺度分析(NMDS)用R軟件中的vegan包進(jìn)行計(jì)算,使用Bray-Curtis距離.用Gephi軟件繪制細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)并計(jì)算特征參數(shù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 20.0進(jìn)行計(jì)算,并使用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較(<0.05),OriginPro 2016畫圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 14C可提取態(tài)的變化

用LSC法測(cè)定土壤可提取態(tài)、結(jié)合態(tài)、CO2等不同組分中14C標(biāo)記物的含量,在微宇宙培養(yǎng)及提取過(guò)程中14C的回收率為86.5%～106.3%.經(jīng)過(guò)3個(gè)月的培養(yǎng),在各處理中,BaA中的14C主要以可提取態(tài)的形式殘留在土壤中(53.8%～60.5%)(圖1).對(duì)照中BaA的可提殘留率最高,為60.5%,加入菲、蒽及芘作為共代謝底物時(shí),土壤中可提取態(tài)BaA較對(duì)照降低,分別降低了6.7%、4.1%、5.7%,說(shuō)明菲、蒽、芘均可以提高BaA的去除效率.

圖1 二氯甲烷可提取態(tài)14C含量

小寫字母表示各組間的差異顯著性;菲表示BaA的共代謝底物為菲,蒽表示BaA的共代謝底物為蒽,芘表示BaA共代謝底物為芘,下同

2.2 BaA礦化率及在土壤有機(jī)質(zhì)組分間的分配

除了可提取態(tài)之外,污染物在土壤中的去向還包括礦化生成CO2及有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)(胡敏酸、富里酸、胡敏素).結(jié)果顯示,減少的BaA大部分結(jié)合進(jìn)入了土壤有機(jī)質(zhì),具體分布為:胡敏酸中的結(jié)合量為3.8%～5.1%,富里酸中的結(jié)合量為2.3%～2.7%,胡敏素中的14C結(jié)合量最高,達(dá)27.1%～31.7%,而礦化生成CO2的比例只占14C總量的5.4%～7.9%,遠(yuǎn)低于土壤有機(jī)質(zhì)中的結(jié)合量,說(shuō)明在共代謝作用下土壤結(jié)合態(tài)降低污染物生物有效性仍是BaA主要的解毒機(jī)制,共代謝作用對(duì)污染物土壤分配過(guò)程的影響有限.由于污染物結(jié)合量與有機(jī)質(zhì)正相關(guān),而胡敏素是有機(jī)質(zhì)中含量最高的組分[10],因此胡敏素成為PAHs土壤結(jié)合態(tài)的主要去向.

圖2 BaA的礦化率及在土壤有機(jī)質(zhì)中的分配

小寫字母表示各組間的差異顯著性

加入菲、蒽、芘底物后均可以促進(jìn)BaA礦化生成CO2(圖2),其中蒽作為共代謝底物時(shí),BaA礦化率最高(7.9 % ± 0.3%),比對(duì)照(5.4% ± 0.3%)提高了2.5%,蒽能夠提高微生物對(duì)BaA及其中間產(chǎn)物的分解及代謝能力;菲、芘作為共代謝底物時(shí),BaA的礦化率無(wú)顯著差異,分別為5.9% ± 0.1%及6.7% ± 0.5%,高于對(duì)照但不及添加蒽作底物后BaA的礦化率.

在土壤有機(jī)質(zhì)分配中,共代謝能夠促進(jìn)BaA轉(zhuǎn)化進(jìn)入胡敏酸,菲、蒽、芘作為共代謝底物時(shí),14C在胡敏酸中的結(jié)合量分別為5.1% ± 0.5%、4.6% ± 0.05%、4.0% ± 0.7%,比對(duì)照(3.8% ± 0.5%)有所升高;共代謝底物對(duì)BaA富里酸結(jié)合態(tài)的影響不大,各處理之間無(wú)顯著差異;而3種共代謝底物對(duì)污染物在胡敏素結(jié)合態(tài)的影響存在顯著差異:與對(duì)照(27.1%)相比,蒽對(duì)14C在胡敏素結(jié)合態(tài)影響不大(27.7%);菲與芘則促進(jìn)14C在胡敏素中的結(jié)合,污染物的結(jié)合量均升高至31%,比對(duì)照提高了約4%.菲與芘對(duì)14C結(jié)合量相當(dāng).由此可見(jiàn),蒽對(duì)BaA的共代謝作用主要是促進(jìn)其礦化,菲、芘共代謝作用則主要增強(qiáng)BaA在土壤胡敏素組分中的結(jié)合,不同PAHs共代謝對(duì)BaA環(huán)境分配存在差異.

2.3 土壤細(xì)菌群落的變化

高通量測(cè)序結(jié)果用Silva 119數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn),細(xì)菌群落主要由酸桿菌門(Acidobacteria, 22%)、放線菌門(Actinobacteria, 9%),α-變形菌門(Alphaproteobacteria, 15%)、β-變形菌門(Betaproteobacteria, 12%)組成.各處理之間群落組成與分異不明顯(圖3a, 3b),多樣性也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3c),說(shuō)明少量共代謝PAHs對(duì)土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較小.

圖3 土壤中細(xì)菌群落組成及多樣性

a:細(xì)菌群落組成; b:非度量多尺度分析; c:香農(nóng)指數(shù); 圖c中小寫字母a表示各組間無(wú)顯著差異

2.4 細(xì)菌群落共生網(wǎng)絡(luò)

表2 細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)

通過(guò)分析細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步研究細(xì)菌物種之間的相互聯(lián)系.結(jié)果顯示盡管菲、蒽等共代謝底物對(duì)土壤細(xì)菌組成及群落影響較小,卻能改變土壤細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(表2).相較于對(duì)照組,蒽作為共代謝底物時(shí),物種間的正相關(guān)連接比例顯著升高(73%),并占主導(dǎo)地位,而網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)(112)、連接數(shù)(325)、網(wǎng)絡(luò)密度(0.052)及負(fù)相關(guān)連接比例(27%)則明顯下降,提示在蒽共代謝作用下,土壤中微生物之間的共生關(guān)系增強(qiáng)[15],共生網(wǎng)絡(luò)變得簡(jiǎn)單;相反地,添加菲與芘參與代謝時(shí),網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)(136～139)、連接數(shù)(737～731)、網(wǎng)絡(luò)密度(0.077～ 0.08)等參數(shù)均比對(duì)照有所增加,共生網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜,而負(fù)連接比例有所升高,說(shuō)明微生物的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系可能變得激烈.

2.5 關(guān)鍵物種分析

在細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)中,通常以度(Degree)及中心性(Betweenness centrality)來(lái)指示關(guān)鍵物種[20],在對(duì)照中,網(wǎng)絡(luò)中主要的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)包括放線菌門(Actinobacteria),變形菌門(Proteobacteria),添加共代謝底物后,網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)以變形菌門細(xì)菌為主(圖4).具體到物種而言,Variibactersp.(變形菌門)在共代謝作用中與其他物種的聯(lián)系最密切,提示其在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要的作用. Burkholderiales, Xanthobacteraceae等分類下的部分細(xì)菌在蒽/菲等共代謝作用下成為關(guān)鍵物種(表3),常見(jiàn)的PAHs降解菌株許多屬于這些菌屬中,推測(cè)這些細(xì)菌可能與PAHs降解相關(guān).當(dāng)然,目前的結(jié)論都是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的推理,對(duì)于實(shí)際參與PAHs降解的微生物,還需要結(jié)合其它手段進(jìn)行深入研究,如穩(wěn)定性同位素示蹤DNA-SIP、PLFA-SIP等方法.

圖4 細(xì)菌關(guān)鍵物種分析

a: 對(duì)照; b: BaA共代謝底物為菲; c: BaA共代謝底物為蒽; d:BaA共代謝底物為芘

表3 關(guān)鍵微生物信息

3 討論

3.1 PAHs共代謝底物結(jié)構(gòu)影響B(tài)aA環(huán)境歸趨

共代謝主要是通過(guò)底物刺激微生物中相關(guān)酶或輔助因子,提高對(duì)污染物的轉(zhuǎn)化能力.盡管一般利用低分子量PAHs作為共代謝底物促進(jìn)高分子量PAHs降解[7],但是芘作為一種高分子量的PAHs,同樣可以增強(qiáng)BaA的去除.除此之外,木質(zhì)素作為一種生物大分子聚合物,也是PAHs降解的共代謝底物之一[3],底物結(jié)構(gòu)或是影響共代謝作用的主要因素.

不同共代謝底物對(duì)BaA環(huán)境歸趨的影響存在差異:蒽主要促進(jìn)了BaA的礦化,而菲、芘提高污染物在土壤有機(jī)質(zhì)中的結(jié)合.PAHs在土壤中的代謝途徑及相關(guān)的功能酶類多樣[11],然而BaA與蒽可能存在相似的代謝途徑:BaA的代謝產(chǎn)物包括1,2-二羥基蒽、1-羥基-2-羧基蒽等[12],而蒽降解也可能產(chǎn)生1,2-二羥基蒽等中間產(chǎn)物[13],因此蒽降解過(guò)程中產(chǎn)生酶類,無(wú)論是特異性的還是非特異性的,或都可以直接代謝BaA中間產(chǎn)物,從而增強(qiáng)了BaA的礦化;菲、芘的代謝過(guò)程則與BaA差異較大[14],降解菲、芘過(guò)程中產(chǎn)生的功能酶或細(xì)菌對(duì)BaA及其相關(guān)中間產(chǎn)物的特異性可能不足,因此BaA轉(zhuǎn)化為極性產(chǎn)物后難以繼續(xù)分解,而生成結(jié)合態(tài)殘留在土壤中.推測(cè)當(dāng)?shù)孜锱c污染物結(jié)構(gòu)相似性高時(shí)可能更易促進(jìn)污染物的礦化;而結(jié)構(gòu)相似性低時(shí)則主要促進(jìn)污染物的土壤結(jié)合.

3.2 PAHs共代謝改變土壤細(xì)菌的共生網(wǎng)絡(luò)

添加少量PAHs共代謝底物對(duì)土壤中微生物群落的影響較小,各處理中細(xì)菌群落組成、結(jié)構(gòu)以及多樣性均無(wú)顯著差異.可能一方面由于實(shí)驗(yàn)中的共代謝底物菲、蒽、芘在土壤中的含量(10mg/kg)遠(yuǎn)低于BaA(100mg/kg),另一方面菲、蒽、芘降解速度比BaA快,經(jīng)90d的培養(yǎng)后,底物已完全降解,只有BaA仍殘留在土壤中,因此微生物群落主要受BaA影響,各處理之間細(xì)菌群落組成及多樣性的差異較小.

盡管底物對(duì)土壤中細(xì)菌群落組成的影響較小,但共代謝底物顯著改變了細(xì)菌的共生網(wǎng)絡(luò).在共生網(wǎng)絡(luò)中,模塊性(modularity)是網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的一個(gè)重要指標(biāo),一組緊密聯(lián)系的功能基因或微生物形成一個(gè)模塊,modularity與功能相關(guān)[16].當(dāng)modularity> 0.4時(shí),網(wǎng)絡(luò)呈模塊結(jié)構(gòu)(modular structure);而modularity<0.4時(shí),則屬于隨機(jī)性網(wǎng)絡(luò).在本研究中,添加蒽為底物時(shí)modularity為0.66顯著高于對(duì)照(0.51),提示細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的功能性增強(qiáng),而菲與芘作為底物時(shí),兩者modularity類似,分別為0.56與0.58,比對(duì)照中也所升高,但細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度不及添加蒽的處理.代謝過(guò)程及產(chǎn)物是影響網(wǎng)絡(luò)modularity的重要因子[17-18],蒽與BaA可能有相同的代謝產(chǎn)物及相似的代謝途徑,因此微生物物種間的協(xié)作、共生關(guān)系增加,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的modularity顯著升高;而菲、芘雖能促進(jìn)雙加氧酶等功能基因的富集[19],但菲、芘與BaA代謝途徑的不同或使得網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度升高,菌群之間對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)變強(qiáng),而對(duì)BaA及其中間產(chǎn)物降解能力不足,或?qū)е路啤④糯龠M(jìn)了14C-BaA在土壤結(jié)合態(tài)的生成.添加共代謝底物后,細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)的變化與污染物環(huán)境歸趨具有一致性,從結(jié)果推測(cè)底物結(jié)構(gòu)的差異改變了微生物的協(xié)作關(guān)系并最終影響污染物在土壤中的分配,底物與污染物結(jié)構(gòu)相似性越高,可能直接促進(jìn)污染物的礦化.

4 結(jié)論

4.1 共代謝底物菲、蒽、芘均可促進(jìn)BaA的去除,其中蒽主要促進(jìn)BaA的礦化,菲、芘則增強(qiáng)BaA在土壤有機(jī)質(zhì)中的結(jié)合.

4.2 添加蒽作為共代謝底物時(shí),細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)的模塊性顯著增強(qiáng)、細(xì)菌物種間以共生關(guān)系為主;而菲、芘作為共代謝底物時(shí),共生網(wǎng)絡(luò)的模塊性比對(duì)照升高但不及蒽的作用,細(xì)菌物種間競(jìng)爭(zhēng)變得激烈.

4.3 共代謝底物與PAHs結(jié)構(gòu)相似時(shí)可促進(jìn)污染物的礦化,而底物與PAHs結(jié)構(gòu)不同時(shí)降解途徑存在差異,共代謝則促進(jìn)BaA的土壤結(jié)合.

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致謝：本研究中涉及14C同位素示蹤的試驗(yàn)在南京大學(xué)季榮教授實(shí)驗(yàn)室完成,在此感謝季老師及課題組成員的大力支持.

Effect of co-metabolism by polycyclic aromatic hydrocarbon on the microbial degradation of benzo[a]anthracene and its mechanism.

ZHU Qing-he1,2, ZENG Jun1, WU Yu-cheng1, YANG-Jie2, LIN Xian-gui1*

(1.Key Laboratory of Soil Environmental and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；2.State Environmental Protection Engineering Center for Urban Soil Contamination Control and Remediation, Shanghai Academy of Environmental Sciences, Shanghai 200233, China)., 2022,42(2)：808～814

In this study, the effect of three co-metabolic substrates (phenanthrene, anthracene, pyrene) on environmental distribution of benzo[a]anthracene (BaA) was studied by using14C isotope tracer. High-throughput sequencing and co-occurrence network analysis were used to evaluate bacterial community responses. The results demonstrated that all the three co-metabolic substrates promoted degradation of BaA. The mineralization of BaA increased by 2.5% in the anthracene treatment compared to the control. In the treatments of phenanthrene and pyrene, the bound residue of14C was 4% higher than in the control, amounting to 31% of the total addition. The topological characteristics of bacterial co-occurrence network changed with the supplementation of co-metabolic substrates. Anthracene significantly raised the proportion of positive links, which indicated mutualistic interactions. In contrast, the competition between bacterial taxa was strengthened in the treatments of phenanthrene and pyrene, as evidenced by increased negative links after incubation. It was likely that anthracene and BaA degraded through common metabolic pathways, which caused mutualistic interactions and higher mineralization rate of BaA in the soil microcosms. Overall, co-metabolism could be an important factor influencing the fate of BaA in soil and changing the interaction among bacterial species.

benzo[a]anthracene；environmental fate；cometabolism；bacterial co-occurrence network

X53

A

1000-6923(2022)02-0808-07

朱清禾(1986-),女,江蘇鎮(zhèn)江人,博士,主要從事多環(huán)芳烴微生物降解相關(guān)研究.發(fā)表論文4篇.

2021-06-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2019YFC1803700);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41977132);上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目(19XD1434900)

*責(zé)任作者, 研究員, xglin@issas.ac.cn