氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”非特異性免疫的影響

趙 斌，周紅學(xué)，李成林，趙洪友，胡 煒，程曉艷，韓 莎

(1 山東省海洋科學(xué)研究院，山東 青島 266104;2 山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，山東 濟(jì)南 250013;3 萊陽(yáng)市海洋漁業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 265200;4 萊陽(yáng)市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東 煙臺(tái) 265200)

刺參(Apostichopusjaponicas)是具有獨(dú)特養(yǎng)生保健和生態(tài)環(huán)保作用的高價(jià)值海水養(yǎng)殖品種。我國(guó)的刺參養(yǎng)殖區(qū)域主要集中在山東、遼寧等省份的沿海地區(qū)[1]。為解決刺參養(yǎng)殖群體長(zhǎng)期累代自繁、性狀退化、成活率低、抗逆性差、生長(zhǎng)緩慢等問題，基于當(dāng)前經(jīng)濟(jì)棘皮動(dòng)物育種方向，在以產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快為目標(biāo)的基礎(chǔ)上，將品質(zhì)、抗逆性狀逐步納入選育目標(biāo)[2]。山東省海洋生物研究院采用群體內(nèi)累代選育技術(shù)，以生長(zhǎng)速度快、成活率高為主要目標(biāo)性狀，經(jīng)過連續(xù)4代選育，獲得速生特征明顯、成活率高、抗逆性強(qiáng)、性狀穩(wěn)定的刺參新品種“魯海1號(hào)”(GS-01-011-2018)[3]，為刺參良種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了種質(zhì)基礎(chǔ)。

氨氮是養(yǎng)殖水體中常見的污染脅迫因子之一，研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫會(huì)導(dǎo)致水生生物攝食率降低、生長(zhǎng)緩慢、組織器官病變、免疫系統(tǒng)功能受抑，最終致水生生物死亡[4-7]。目前，池塘養(yǎng)殖是刺參主要養(yǎng)殖模式之一[8]，在池塘養(yǎng)殖中，水中殘餌、排泄物積累和氨化分解，以及長(zhǎng)期不清塘、池塘老化等問題會(huì)提高水體中的氨氮濃度，導(dǎo)致刺參長(zhǎng)期處于氨氮脅迫的生長(zhǎng)環(huán)境中[9-10]。良種性狀評(píng)估是科學(xué)、客觀評(píng)價(jià)選育優(yōu)勢(shì)性狀的基礎(chǔ)手段[11]，探明良種適宜的培育條件對(duì)其大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，充分發(fā)揮良種貢獻(xiàn)率有重要意義。本研究以刺參“魯海1號(hào)”為材料，對(duì)其在氨氮脅迫下的存活率、特定生長(zhǎng)率及非特異性免疫指標(biāo)進(jìn)行了分析，探明其對(duì)環(huán)境中氨氮因子變動(dòng)的適應(yīng)性，進(jìn)而確定其對(duì)氨氮脅迫的耐受上限，旨在為該新品種在不同養(yǎng)殖水環(huán)境條件下的推廣及探明其健康養(yǎng)殖免疫機(jī)制提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)刺參為好當(dāng)家集團(tuán)有限公司刺參“魯海1號(hào)”新品種培育車間培育的大規(guī)格苗種，按體質(zhì)量大小分為A組((30.2±0.2) g/頭)和B組((59.2±0.8) g/頭)，分別暫養(yǎng)于0.5 m3的圓形玻璃鋼水槽中，暫養(yǎng)密度A組為240～320 頭/m3，B組為120～200 頭/m3，養(yǎng)殖用水為經(jīng)沉淀沙濾的自然海水，鹽度31±0.2，水溫(15±1.5) ℃，pH 8.1±0.2，氨氮質(zhì)量濃度低于0.05 mg/L。暫養(yǎng)期間每日換水1次，連續(xù)充氣，每天投喂配合飼料1次。暫養(yǎng)適應(yīng)7 d后，選取表觀、攝食正常的健康個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)暫養(yǎng)的不同規(guī)格刺參進(jìn)行急性氨氮脅迫預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)質(zhì)量濃度與死亡率關(guān)系得出急性氨氮脅迫96 h的半致死質(zhì)量濃度平均值為104.3 mg/L。以半致死質(zhì)量濃度的10%作為本試驗(yàn)慢性脅迫氨氮濃度設(shè)置的依據(jù)[12]，設(shè)計(jì)不同處理進(jìn)行試驗(yàn)。向自然海水中分別添加2，4，6，8和10 mg/L的NH4Cl，設(shè)置5個(gè)氨氮質(zhì)量濃度組(A、B組分別記為A2、A4、A6、A8、A10和B2、B4、B6、B8、B10組)，參照Bower等[13]的方法計(jì)算可得各試驗(yàn)組非離子氨質(zhì)量濃度分別為0.066，0.131，0.197，0.263和0.328 mg/L。同時(shí)，以氨氮質(zhì)量濃度低于0.05 mg/L的自然海水為對(duì)照組，氨氮質(zhì)量濃度記為0 mg/L(A、B組分別記為A0、B0組)。各試驗(yàn)組與對(duì)照組刺參均為20 頭，于整理箱(80 cm×60 cm×48 cm)中培養(yǎng)，每試驗(yàn)組設(shè)3組平行。養(yǎng)殖條件和日常管理同暫養(yǎng)期，每天換水后用奈氏試劑法測(cè)定水中氨氮質(zhì)量濃度并及時(shí)校正，氨氮質(zhì)量濃度波動(dòng)<0.1 mg/L，試驗(yàn)共進(jìn)行15 d。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 刺參存活率、生長(zhǎng)指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)開始時(shí)刺參數(shù)量、取樣數(shù)量及結(jié)束時(shí)存活數(shù)量，計(jì)算刺參存活率。試驗(yàn)開始時(shí)，將每個(gè)試驗(yàn)組內(nèi)刺參取出稱濕體質(zhì)量(初始體質(zhì)量(W0)；試驗(yàn)結(jié)束后，取刺參稱濕體質(zhì)量(終末體質(zhì)量(Wt)。稱量時(shí)，待刺參吐水后用吸水紙吸干體表水分，盡量避免體表水分所引起的稱量誤差。按以下公式計(jì)算刺參特定生長(zhǎng)率(spectific growth rate，SGR)[14]：SGR =100×(lnWt-lnW0)/t。式中：t為試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間(d)。

1.3.2 刺參免疫指標(biāo) 在試驗(yàn)第0(試驗(yàn)開始當(dāng)天)，5，10和15 天分別對(duì)各組刺參進(jìn)行取樣，將樣本置于滅菌玻璃培養(yǎng)皿中，在刺參腹部切1 cm長(zhǎng)的切口，用滅菌槍頭收集刺參體腔液，同組內(nèi)刺參體腔液混勻后，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后保存在-80 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定體腔液中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，以1 mL體腔上清液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位；采用鉬酸銨法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性，以1 mL體腔上清液每秒分解1 μmol H2O2的量為1個(gè)活力單位；采用磷酸苯二鈉法測(cè)定酸性磷酸酶(ACP)活性，以100 mL體腔上清液在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位；采用磷酸苯二鈉法測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)活性，以100 mL體腔上清液在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位(king unit)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”存活、生長(zhǎng)的影響

由表1可知，A0、A2、A4、A6 和B0、B2、B4、B6 組刺參存活率均為100.0%，A8、A10和B8、B10組刺參存活率均下降，其中A10組刺參存活率最低，為87.2%。A0、A2、A4和B0、B2、B4組刺參均可正?；顒?dòng)、攝食、生長(zhǎng)，未表現(xiàn)出異常狀況；A6和B6組刺參活動(dòng)與攝食未見異常，生長(zhǎng)不明顯；A8和B8組刺參在10 d后出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減弱、攝食量下降、生長(zhǎng)停滯，其中B8組刺參在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)出現(xiàn)體質(zhì)量負(fù)增長(zhǎng)；A10和B10組刺參均出現(xiàn)排臟、化皮和死亡個(gè)體。隨著氨氮質(zhì)量濃度的增大，試驗(yàn)組刺參的終末體質(zhì)量和特定生長(zhǎng)率均下降。A2、A4和B2組刺參終末體質(zhì)量與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，其余試驗(yàn)組終末體質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；2種規(guī)格刺參終末體質(zhì)量最低值均出現(xiàn)在10 mg/L氨氮處理組，分別為25.83和54.71 g/頭。A2組刺參特定生長(zhǎng)率為0.708%/d，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，其余試驗(yàn)組特定生長(zhǎng)率隨氨氮質(zhì)量濃度增大而顯著下降(P<0.05)；特定生長(zhǎng)率最低值出現(xiàn)在A10試驗(yàn)組，為-1.165%/d。

表1 氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”存活和生長(zhǎng)的影響Table 1 Survival rate and growth of sea cucumber Luhai No.1 at different ammonia nitrogen concentrations

2.2 氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”酶活性的影響

2.2.1 SOD活性 由圖1可知，氨氮脅迫5 d時(shí)，A2、A4、A6、A8和A10組刺參體腔液SOD活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05) ，SOD活性峰值出現(xiàn)在A4試驗(yàn)組，為58.6 U/mL；B組SOD活性均升高，其中B6和B10組顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)。氨氮脅迫10 d時(shí)，A2、A4、A6組刺參體腔液SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，A8和A10組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；B組SOD活性隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加呈先增高后降低的趨勢(shì)，其中B4和B6組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫15 d時(shí)，與10 d相比各試驗(yàn)組SOD活性均下降，其中A8、A10和B10組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中以A10組SOD活性最低，為23.1 U/mL。

2.2.2 CAT活性 由圖2可知，氨氮脅迫5 d時(shí)， A4、A6、A8和B2、B4、B6組的CAT活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，A4組的最高為4.86 U/mL，顯著高于其他組(P<0.05)。氨氮脅迫10 d時(shí)，A4、A8和B2、B4組的CAT活性均顯著高于對(duì)照組，而A10和B10組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫15 d時(shí)，各試驗(yàn)組CAT活性均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高總體呈降低趨勢(shì)，A6、A8、A10和B6、B8、B10組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中以A10組CAT活性最低，為0.97 U/mL。

2.2.3 ACP活性 由圖3可知，氨氮脅迫5 d時(shí)，A4、B4組刺參ACP活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫10 d時(shí)，A2、A4和B4組的ACP活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，A10、B10組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫15 d時(shí)，A8、A10和B10組的ACP活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，B2組顯著高于對(duì)照，其余各組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 AKP活性 由圖4可知，氨氮脅迫5 d時(shí)，各試驗(yàn)組刺參AKP活性均有所上升，其中A8、A10和B2、B4、B6、B8組的AKP活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫10 d時(shí)，A2、B2組AKP活性均顯著高于對(duì)照組，其他各組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。氨氮脅迫15 d時(shí)，與10 d相比各組AKP活性總體上均呈明顯下降趨勢(shì)，其中A10和B6、B8、B10組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，以B10組AKP活性最低。

3 討 論

3.1 刺參在氨氮脅迫下的存活與生長(zhǎng)情況

研究發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格刺參對(duì)氨氮的耐受能力不同[21]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度為6，8和10 mg/L時(shí)，脅迫作用較為明顯，2種規(guī)格刺參“魯海1號(hào)”的存活率與特定生長(zhǎng)率存在一定差異。在存活率方面，相同氨氮質(zhì)量濃度下2種規(guī)格刺參存活率差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)，表明在氨氮脅迫對(duì)刺參造成的生存壓力上，沒有體質(zhì)量規(guī)格上的差別。在特定生長(zhǎng)率方面，當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度為6 mg/L時(shí)，經(jīng)15 d慢性脅迫，小規(guī)格刺參體質(zhì)量SGR為正值，大規(guī)格刺參SGR為負(fù)值，試驗(yàn)刺參處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)；當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，大規(guī)格刺參的負(fù)生長(zhǎng)程度顯著低于小規(guī)格刺參，表明當(dāng)氨氮脅迫超過極限時(shí)，體質(zhì)量規(guī)格較大的選育刺參可表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受能力與抗逆性。

3.2 氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”免疫指標(biāo)的影響

以往研究認(rèn)為，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物氨氮中毒致死可能與機(jī)體氧化損傷和免疫抑制有關(guān)[22-23]。水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)分為特異性免疫和非特異性免疫兩類，魚類、蝦類、貝類和棘皮類動(dòng)物的非特異性免疫在應(yīng)對(duì)逆環(huán)境應(yīng)激中起主導(dǎo)作用，非特異性免疫主要由細(xì)胞免疫和體液免疫組成，其中包括SOD、CAT、ACP等各種免疫酶類[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫對(duì)刺參“魯海1號(hào)”非特異性免疫指標(biāo)影響顯著，且與其生理活動(dòng)、存活與生長(zhǎng)存在一定關(guān)聯(lián)性，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同氨氮質(zhì)量濃度下刺參SOD、CAT、ACP和AKP活性均發(fā)生了明顯變化。在非特異性免疫酶中，SOD和CAT是機(jī)體發(fā)生氧化代謝的酶類，二者協(xié)同作用，使自由基的產(chǎn)生和清除達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，減少機(jī)體氧化損傷，是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)酶系統(tǒng)[25-27]。在本研究中，試驗(yàn)第5天時(shí)，所有試驗(yàn)組SOD活性均上升，其中大規(guī)格刺參的2，4和8 mg/L氨氮處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，其余各組SOD活性均顯著提高(P<0.05)。所有試驗(yàn)組SOD和CAT活性峰值基本均出現(xiàn)在第5天，其原因可能是適宜質(zhì)量濃度的氨氮可減輕活性氧對(duì)刺參機(jī)體造成的損傷，促進(jìn)刺參的免疫水平，這與劉洪展等[24]的研究結(jié)論相似。ACP和AKP能夠殺死外來(lái)入侵的病原體，并能通過修改病原表面分子來(lái)加速吞噬細(xì)胞的吞噬以及異物的降解速度[28]。本研究中，試驗(yàn)組刺參ACP和AKP活性的消長(zhǎng)不如SOD和CAT變化劇烈，整體也呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，說明ACP和AKP的應(yīng)答隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而變化。研究指出，長(zhǎng)時(shí)間的氨氮脅迫會(huì)使動(dòng)物機(jī)體免疫功能降低甚至低于正常水平[29-30]。在本研究結(jié)束時(shí)，氨氮脅迫較強(qiáng)的各試驗(yàn)組ACP和AKP活性均降到了較低水平，推測(cè)其非特異免疫調(diào)節(jié)已達(dá)到極限，降低了受其關(guān)聯(lián)的各項(xiàng)生理功能，導(dǎo)致機(jī)體不能維持正常的生理狀態(tài)。

朱江艷等[31]研究得出，氨氮脅迫對(duì)不同規(guī)格刺參非特異性免疫酶活性影響存在差異，但差異未達(dá)顯著水平。本試驗(yàn)中，在相同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下，不同規(guī)格刺參體腔液中不同非特異性免疫酶活性的變化趨勢(shì)隨著脅迫時(shí)間的推移存在一定差異。整體上，體質(zhì)量規(guī)格較小的刺參個(gè)體酶活性變化幅度相對(duì)大規(guī)格刺參更大，其原因可能是在自然環(huán)境中，規(guī)格較小的個(gè)體與大規(guī)格個(gè)體相比通常面臨更大的生存壓力，在面對(duì)脅迫環(huán)境時(shí)的響應(yīng)速度更為迅捷，從而在氨氮脅迫時(shí)的非特異性免疫酶活性調(diào)節(jié)更為敏感。

近年來(lái)，因異常氣候和極端天氣增多，外界環(huán)境條件對(duì)刺參池塘養(yǎng)殖的影響加大，復(fù)雜的水環(huán)境往往導(dǎo)致氨氮含量處在較高水平，擾亂刺參正常生理狀態(tài)，最終導(dǎo)致養(yǎng)殖刺參發(fā)生應(yīng)激進(jìn)而出現(xiàn)病害甚至死亡。根據(jù)本研究結(jié)果，在刺參“魯海1號(hào)”養(yǎng)殖過程中，為有效提升新品種的良種貢獻(xiàn)率，尤其應(yīng)注意保持環(huán)境理化因子指標(biāo)的適宜[32]。綜合比較試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為養(yǎng)殖過程中應(yīng)通過水質(zhì)調(diào)控、底質(zhì)改良等手段盡量降低水環(huán)境中的氨氮質(zhì)量濃度，如遇突發(fā)情況應(yīng)嚴(yán)格控制氨氮質(zhì)量濃度在6 mg/L以下，而對(duì)于氨氮質(zhì)量濃度高于8 mg/L的時(shí)間最好控制在不超過5 d，以降低過度應(yīng)激對(duì)刺參造成的不良影響及患病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)。