大腦類器官在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用研究及展望

郝路 王之敏

摘要：膠質(zhì)瘤是一種常見原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高度異質(zhì)性和很強(qiáng)的侵襲性，臨床治療存在很大挑戰(zhàn)。當(dāng)以往研究多以二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型為研究對象，但存在很大缺陷。近年來，科學(xué)研究人員構(gòu)建出一種與人體組織和器官的結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)，類器官，包胞分布和組織、生理結(jié)構(gòu)、電活動(dòng)和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，可模擬出腫瘤微環(huán)境，與實(shí)體腫瘤具有極高的形式度，有望成為膠質(zhì)瘤研究的重要平臺(tái)。本文對大腦類器官及其構(gòu)建方法進(jìn)行了簡要介紹，并對其在膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)行了歸納。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤、大腦類器官、藥物篩選、個(gè)性化治療、腫瘤微環(huán)境

【中圖分類號(hào)】R73 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）02-03

膠質(zhì)瘤是較為常見的原發(fā)性腦腫瘤，其預(yù)后較差[1]。目前主要的治療方法是手術(shù)切除及放化療，但效果有限，因其在腦組織中生長迅速，對化療有耐藥性，并且具有高度的侵襲性，為臨床治療造成了極大困擾，且膠質(zhì)瘤容易復(fù)發(fā)。因此，迫切需要一個(gè)研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的平臺(tái)，以發(fā)現(xiàn)疾病的特點(diǎn)，開發(fā)更有效的治療方法。雖然以往研究中的2D細(xì)胞模型和動(dòng)物模型為我們的研究提供了很大的幫助，但它們也存在一定缺陷：缺少腫瘤微環(huán)境[2-3];長期培養(yǎng)遺傳特征發(fā)生變異[4-6]，周期長、成本高等。近年來，科學(xué)研究人員構(gòu)建出一種與人體組織和器官的結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)，類器官，可以概括人類器官一些關(guān)鍵特征，包括細(xì)胞分布和組織、生理結(jié)構(gòu)、電活動(dòng)和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[7]，這一模型的出現(xiàn)彌補(bǔ)了二維細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型之間的缺陷，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了獨(dú)特視角[8]。

當(dāng)前的研究中，膠質(zhì)瘤大腦類器官的形成主要有3種形式：（1）基因編輯大腦類器官誘導(dǎo)腦腫瘤形成，已有研究[9]表明可通過基因編輯技術(shù)，使抑癌基因功能喪失，在大腦類器官中誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。（2）膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與大腦類器官共培養(yǎng)，患者來源的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是腫瘤在體內(nèi)生成、增殖和侵襲不可缺少的關(guān)鍵性因素[10-11]。（3）從膠質(zhì)瘤組織或膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中獲得膠質(zhì)瘤類器官，這種保留了母體腫瘤的異質(zhì)性、相對的三維空間組織。這些方法產(chǎn)生的腦類器官已成為探索膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的獨(dú)特模式，為膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究提供了良好的平臺(tái)[12]。

應(yīng)用于藥物篩選

膠質(zhì)瘤診斷后生存期較短，急需建立有效的疾病模型和藥物篩選平臺(tái)。常規(guī)的細(xì)胞平臺(tái)是2D模式，不能形成正常組織以及腫瘤組織所處的微環(huán)境，無法模擬細(xì)胞間的相互作用，因此大腦類器官有望成為極具價(jià)值的藥物篩選工具[13-14]。動(dòng)物模型方面，建立人小鼠膠質(zhì)瘤移植模型耗時(shí)較長，且費(fèi)用昂貴，一些人類治療靶點(diǎn)與小鼠存在一定差異，因此，動(dòng)物模型評價(jià)膠質(zhì)瘤藥物敏感性的實(shí)用性往往較低。膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤類器官，特別是患者源性細(xì)胞產(chǎn)生的類器官，很好地克服了上述兩大問題，為藥物篩選提供了有效的平臺(tái)。稱為藥篩平臺(tái)主要得以于膠質(zhì)瘤類器官具有三大突出優(yōu)勢：（1）首先是其快速生成性，在患者確診后可在短時(shí)間內(nèi)為臨床治療前提供檢測藥物反應(yīng);（2）對于培養(yǎng)的單一膠質(zhì)瘤類器官中，更能表現(xiàn)出膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性，往往比傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤模型更能表現(xiàn)出真實(shí)的藥物反應(yīng);（3）具有更多的分子機(jī)制，包括基因表達(dá)類型、轉(zhuǎn)錄方式、不同活躍度的信號(hào)通路[15];（4）膠質(zhì)瘤類器官具有多樣性，并容易擴(kuò)展，可為膠質(zhì)瘤表型、基因型及細(xì)胞狀態(tài)對藥物反應(yīng)的研究提供基礎(chǔ)[16]。Amanda[17]等使用患者來源的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）和人類胚胎干細(xì)胞（hESC）構(gòu)建大腦類器官，這一模型形成迅速，并由腫瘤微管網(wǎng)絡(luò)相支持，有助于侵襲正常宿主組織;并用化療藥物和輻射對該模型進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力顯著下降，與2D細(xì)胞模型相比，其藥物和輻射誘導(dǎo)所致的基因毒性應(yīng)激具有更高的抵抗性，更能貼近體內(nèi)檢測結(jié)果，表明大腦類器官膠質(zhì)瘤在體外藥物篩選預(yù)測方面具有更高的潛能。Zhang等 [18]于2020年，報(bào)道了一個(gè)基于膠質(zhì)瘤患者來源的組織和細(xì)胞的實(shí)時(shí)集成系統(tǒng)，通過生成三維體外大腦類器官和體內(nèi)異種移植腫瘤，該系統(tǒng)有效地反應(yīng)除了腫瘤的組織學(xué)特征，對化療藥物的反應(yīng)，以及相應(yīng)的母體腫瘤的臨床進(jìn)展;并運(yùn)用該模型成功地識(shí)別了一例II級星形細(xì)胞瘤患者，在類器官和異種移植模型中均具有典型的IV級膠質(zhì)瘤特征，模擬了該患者的疾病進(jìn)展，我們開發(fā)了一個(gè)完整的平行模型系統(tǒng)，從患者來源的膠質(zhì)瘤大腦類器官和異種移植來理解膠質(zhì)瘤生物學(xué)和預(yù)測化療藥物的反應(yīng)，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

用于個(gè)性化治療

膠質(zhì)瘤大腦類器官還可用于患者的個(gè)性化治療。因?yàn)殡S著用于的基因組測序技術(shù)的發(fā)展以及在科研、臨床診斷中的應(yīng)用，使得來源于患者的器官樣培養(yǎng)物可進(jìn)行實(shí)時(shí)基因測序，以揭示細(xì)胞對不同藥物的反應(yīng)[19]，因此有助于為患者提供針對性更強(qiáng)的個(gè)性化治療方案。

Loong [20]等于2020年將靶向測序技術(shù)及患者源類器官培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，為患者提供一套個(gè)性化治療，為膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)治療方式提供了新的方向。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞從第一次手術(shù)患者的術(shù)中組織中提取，培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤類器官，然后對患者的器官進(jìn)行靶向捕獲測序技術(shù)，為后續(xù)的候選藥物提供準(zhǔn)確的信息。通過基因測序作者發(fā)現(xiàn)：在所有樣本中均有兩個(gè)NF1的移碼突變，還有一份高度一致的拷貝數(shù)改變。在初級腫瘤中，雜合子PTEN拷貝丟失以及PTENW?III+ 無義突變，提示PTEN功能雙等位基因缺失，可能誘導(dǎo)mTOR信號(hào)通路。同時(shí)，在最初的臨床表現(xiàn)中PIK3CAH1047Q突變的頻率相對較低，但在復(fù)發(fā)時(shí)其突變頻率變高，這表明了腫瘤自身的異質(zhì)性。遺傳異常表明了PI3K/ AKT/mTOR通路的激活。接下來，作者在培養(yǎng)的病人源性器官上測試了一組基因組介導(dǎo)的候選藥物，以預(yù)測藥物敏感性：作者發(fā)現(xiàn)病人的TMZ耐藥性在膠質(zhì)瘤大腦類器官中再次顯示，因此他們對FDA批準(zhǔn)的相關(guān)抗癌藥物，如PTEN損失/PTENW?III+藥物mTOR抑制劑依維莫司和NF1移碼突變的絲裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制劑考比替尼。與其他藥物相比，膠質(zhì)瘤類器官對依維莫司的細(xì)胞毒性敏感性更高，因此選擇依維莫司作為候選藥物?；颊咦畛趺刻旆靡谰S莫司5mg，后來逐漸增加到每天10mg。治療四周后復(fù)查影像學(xué)顯示位于右側(cè)腦室和第三腦室的殘余腫瘤體積減小，腫塊部分得到一定緩解，文章說明該腫瘤對PTEN通路的生長有很強(qiáng)的依賴性，因此可通過對這種依賴性的識(shí)別，為患者提供個(gè)性化治療方案。研究揭示通過對膠質(zhì)瘤患者類器官進(jìn)行基因組測序以觀察其基因突變情況，從而針對特定的基因突變進(jìn)行相應(yīng)的藥敏實(shí)驗(yàn)，繼而實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療，這一操作在臨床診治中具有可行性。

上述個(gè)體化精準(zhǔn)腫瘤數(shù)據(jù)的實(shí)質(zhì)是通過基于測序，分析體患者腫瘤的基因組和識(shí)別出突變基因及突變位點(diǎn)，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。與傳統(tǒng)的長期培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系模型相比，膠質(zhì)瘤類器官的優(yōu)勢在于能夠更準(zhǔn)確地總結(jié)疾病的分子特征和生物學(xué)特性。與PDX模型相比，膠質(zhì)瘤類器官縮短了建模實(shí)驗(yàn)，也降低了模型成本[21-22]。更重要的是，使用膠質(zhì)瘤類器官進(jìn)行化學(xué)篩選具有顯著的優(yōu)勢，因?yàn)樗子谂囵B(yǎng)，研究材料豐富，這對產(chǎn)生可靠的藥物反應(yīng)參數(shù)是必要的。膠質(zhì)瘤類器官代表了每個(gè)相應(yīng)腫瘤的獨(dú)特生物學(xué)特性，并為評價(jià)藥物反應(yīng)提供了更準(zhǔn)確的模型系統(tǒng)。Jacob[23]等曾對膠質(zhì)瘤類器官進(jìn)行不同處理，藥物處理包括替莫唑胺 、吉非替尼、曲米替尼、埃弗雷莫斯，以及輻射處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同來源的膠質(zhì)瘤類器官對不同方式治療的反應(yīng)存在很大的差異，其治療效果與腫瘤的突變方式、類型以及通路富集具有很高的一致性，作者認(rèn)為這一成果可揭示膠質(zhì)瘤類器官在對個(gè)性化藥物治療的快速選擇、功能測試具有重要意義。

免疫治療模型

近年來，免疫治療在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了較好的臨床效果，在腫瘤的治療中表現(xiàn)出良好的潛力，已有部分研究發(fā)現(xiàn)了患者來源的膠質(zhì)瘤大腦類器官可以用于模擬免疫治療的效果。Jacob[23]等通過對GBO突變譜與對特定藥物的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，并通過建模嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療來測試治療效果，具體方法是將與EGFRvⅢ+腫瘤細(xì)胞有特意反應(yīng)的CAR-T細(xì)胞與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官共培養(yǎng)，結(jié)果揭示該膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官模型表現(xiàn)出了特有的細(xì)胞效應(yīng)，即當(dāng)CAR-T細(xì)胞增殖時(shí)，對表達(dá)EGFRvⅢ的細(xì)胞殺傷作用顯著，使其數(shù)量減少，但不殺傷表達(dá)EGFR+EGFRvⅢ-的腫瘤細(xì)胞，反應(yīng)出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官在利用內(nèi)源性靶點(diǎn)快速檢測抗原特異性CAR-T細(xì)胞治療效果方面的可用性。Neal等[24]將患者源的腫瘤類器官與含有內(nèi)源性、同基因型的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)淋巴拎包細(xì)胞保留了原有腫瘤T細(xì)胞受體譜，并保留了程序性細(xì)胞死亡因子1（PD-1）依賴的免疫檢測點(diǎn)，阻斷PD-1激活的抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞引發(fā)的腫瘤細(xì)胞毒性。PD-1是腫瘤細(xì)胞逃離機(jī)體免疫殺傷的重要免疫抑制靶點(diǎn)，與膠質(zhì)瘤關(guān)系密切，該發(fā)現(xiàn)有望針對膠質(zhì)瘤患者的康PD-1治療得以進(jìn)行體外測試，但作者并未進(jìn)行該方向的深入研究。

構(gòu)建患者來源的原位異種移植

患者來源的異種移植（PDXs）是一種成熟的臨床前癌癥模型，即在在免疫缺陷小鼠中植入患者腫瘤，進(jìn)行研究。PDXs模型通常通過皮下或原位植入患者腫瘤組織碎片獲得，但對于膠質(zhì)瘤，建模成功率較低，僅為50%[25]。且將腫瘤碎片直接植入大腦在技術(shù)上難度極高，不易成功?；颊邅碓吹脑划惙N移植（PDOXs）建立在大腦植入神經(jīng)膠質(zhì)瘤技術(shù)的可行性和標(biāo)準(zhǔn)化，可避免神經(jīng)膠質(zhì)瘤的選擇和適應(yīng)，對于研究腫瘤的組織病理學(xué)特點(diǎn)和時(shí)間特異性意義重大。不同的膠質(zhì)瘤類器官培養(yǎng)模式在異種腦移植時(shí)產(chǎn)生的腫瘤存在差異，有利于研究膠質(zhì)瘤患者的組織病理學(xué)特征，如侵襲性、血管生成等。此外，研究人員已經(jīng)證明DOXs可以在小鼠體內(nèi)保持穩(wěn)定幾代。PDOXs的應(yīng)用范圍從體內(nèi)藥物驗(yàn)證研究、磁共振成像方案優(yōu)化、利用同位素示蹤劑動(dòng)態(tài)分析體內(nèi)腫瘤代謝、遺傳和表型分析，到識(shí)別新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。因此，這種PDOXs模式為下游的研究提供豐富材料。

研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展

膠質(zhì)瘤細(xì)胞的擴(kuò)散侵襲性是其臨床治療的一大難點(diǎn)，其侵襲的作用機(jī)制尚不明確。膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的過程會(huì)表現(xiàn)出不同干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，可依據(jù)這一特點(diǎn)預(yù)測患者的治療。建立一個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲正常組織的體外模型可為這一研究提供良好的平臺(tái)。Linkus 等將類器官與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示形成的膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤腦組織的模式與膠質(zhì)瘤患者手術(shù)發(fā)現(xiàn)的情況相似，不同患者來源的膠質(zhì)瘤類器官增殖、遷移、侵襲模式不同。動(dòng)物模型方面，da Silvia等[26]將取自患者的膠質(zhì)瘤球體與小鼠胚胎干細(xì)胞來源的大腦類器官共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤球體可自行附著于類器官，并逐漸與其融合，最后侵襲腦組織中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲能力。Ogawa 等[27]將腫瘤類器官注入了免疫缺陷小鼠的海馬單側(cè)位，通過HE染色發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞會(huì)沿著血管開始擴(kuò)散，顯示出了廣泛的侵襲性和細(xì)胞核多形性，與患者膠質(zhì)瘤具有相似的生物學(xué)特性;在腫瘤冰罩周圍發(fā)現(xiàn)了大量Ki-67，CD31，預(yù)示著腫瘤組織高度血管生成過程，并且發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，證實(shí)了類器官來源的腫瘤細(xì)胞具有患者腫瘤的生物學(xué)特征，可作為膠質(zhì)瘤研究的良好材料。這些研究也表明，類器官模擬膠質(zhì)母細(xì)胞侵襲培養(yǎng)時(shí)間短、移植成功率高、侵襲性強(qiáng)，且保留腫瘤關(guān)鍵生物學(xué)特征，為研究膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。未經(jīng)治療的神經(jīng)膠質(zhì)瘤類器官可以在模型中引起腫瘤，治療的神經(jīng)膠質(zhì)瘤類器官也可引起腫瘤。這類模型可用于研究治療前后腫瘤的變化。從同一患者不同時(shí)間點(diǎn)采集的腫瘤樣本也可以生成成對的縱向模型，從而再現(xiàn)疾病隨時(shí)間的進(jìn)展【28】。

腫瘤微環(huán)境

膠質(zhì)瘤不是一種細(xì)胞自主的疾病，而是一種癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞生物學(xué)密切相關(guān)的疾病，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可擴(kuò)散、侵襲周邊的正常腦組織繼而造成患者死亡。腫瘤微環(huán)境的研究對分析膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性、可塑性和進(jìn)化過程中發(fā)具有重要意義【29】。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不僅可以更新、增殖[30-31]、分化成不同的腫瘤細(xì)胞，還可以通過與細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞外間質(zhì)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、分化神經(jīng)細(xì)胞等不同腫瘤成分相互作用，造成腫瘤的進(jìn)一步惡性轉(zhuǎn)化，也可增加腫瘤治療時(shí)的耐藥性[32]。Oberheim等[33]曾建立一種患者來源膠質(zhì)瘤類器官的小鼠移植模式，該模型并不理想，雖解決了宿主-腫瘤細(xì)胞相互作用的問題，但在解剖學(xué)上存在物種差異，且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平，星形細(xì)胞樹突狀復(fù)雜性、鈣瞬態(tài)傳輸速度等也存在明顯差異，因此腫瘤微環(huán)境的研究并未深入。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)不斷提升，已有可培育出成熟的膠質(zhì)瘤類器官，用于研究腫瘤微環(huán)境。

膠質(zhì)瘤類器官模型解決了傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)無法模擬的許多局限性，打破了保存親代腫瘤的細(xì)胞和突變多樣性方面的局限性，它允許人們在類似于原始人類大腦的微環(huán)境中體外研究患者特異性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。腦器官生長患者的膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和組織病理學(xué)特征與手術(shù)和尸檢標(biāo)本密切相關(guān)，證明了該模型的臨床相關(guān)性。膠質(zhì)瘤類器官維持患者特異性EGFR擴(kuò)增和磷酸化RTK信號(hào)，以及膠質(zhì)瘤樣器官微管的自發(fā)形成，原位的微結(jié)構(gòu)特征也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。膠質(zhì)瘤類器官模型允許體內(nèi)腫瘤物質(zhì)在足夠的腦微環(huán)境中增殖，包括結(jié)構(gòu)（血管系統(tǒng)、血腦屏障）、細(xì)胞（神經(jīng)元、膠質(zhì)、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）和代謝成分（腦脊液、間質(zhì)液）。該方法還可避免因體外長期培養(yǎng)和類器官擴(kuò)增而導(dǎo)致微環(huán)境丟失、變化和細(xì)胞異常。

總結(jié)

雖然膠質(zhì)瘤類器官的使用為膠質(zhì)瘤的診斷和治療帶來了新的機(jī)遇，但也有幾個(gè)主要的問題：首先是，大腦類器官成熟度爭議，有研究認(rèn)為腦類器官成熟過低，相當(dāng)于孕期胎兒成熟度，而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞更善于侵入成熟的大腦[34-35]，但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，逐漸培養(yǎng)出更接近成熟的人類大腦類器官。其次，缺乏完整的腫瘤微環(huán)境，膠質(zhì)瘤是一種晚發(fā)性疾病，理想的模型需要具有成熟細(xì)胞類型的星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞免疫防御細(xì)胞類型的腦器官[36-37]，目前技術(shù)水平尚不能完全實(shí)現(xiàn)。再次，缺乏內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管網(wǎng)絡(luò)，血管的形成對類器官中氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸尤為重要[38]，最近發(fā)展了幾種體外誘導(dǎo)大腦器官血管形成的方法[39-40]，但仍需進(jìn)一步研究。雖然大腦類器官在膠質(zhì)瘤的研究中有許多方面需要改進(jìn)，但其在基因水平和形態(tài)學(xué)能很好的再現(xiàn)腫瘤特征，在臨床研究和治療仍是一個(gè)重要研究方向，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，必將為膠質(zhì)瘤的研究提供更好前景。

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