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    基于miR-370-3p與JAK2/STAT3通路相關(guān)性探討活血榮絡(luò)方促缺血性腦卒中后血管新生的機(jī)制

    2022-02-24 00:58:24龔翠蘭楊仁義周德生傅馨瑩李俊熙
    關(guān)鍵詞:丁苯腦組織批號(hào)

    龔翠蘭,楊仁義,周德生,凌 佳,傅馨瑩,李俊熙

    (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院,湖南 常德 415000;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007;4湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

    缺血性腦卒中又稱“腦梗死”,是臨床常見(jiàn)腦血管病,占急性腦血管病的70%左右,具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn),給社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。缺血性腦卒中后機(jī)體啟動(dòng)內(nèi)源性血管新生保護(hù)機(jī)制,改善缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)和腦微循環(huán),增加局部腦缺血區(qū)血流灌注,促進(jìn)機(jī)體神經(jīng)功能恢復(fù)。

    前期研究提出,“榮氣虛滯”是缺血性腦卒中的關(guān)鍵病機(jī),榮氣氣化的“精化氣-氣生變-變成形”過(guò)程是缺血性腦卒中后血管新生的中醫(yī)理論基礎(chǔ)[2],在活血榮絡(luò)法指導(dǎo)下創(chuàng)立活血榮絡(luò)方,納入湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床路徑13年,具有滋陰養(yǎng)血、活血通絡(luò)的功效,臨床治療缺血性腦卒中陰虛血瘀證頗有療效[3]。同時(shí),實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)活血榮絡(luò)方能增加腦缺血區(qū)微血管密度,促進(jìn)血管新生,改善缺血性腦卒中后神經(jīng)功能缺損癥狀[4]。因此,為進(jìn)一步研究活血榮絡(luò)方改善腦循環(huán)血管新生的作用機(jī)制,本研究以miR-370-3p介導(dǎo)JAK2/STAT3通路調(diào)控血管新生的機(jī)制為切入點(diǎn),探討活血榮絡(luò)方治療缺血性腦卒中的保護(hù)作用。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物10~12周SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量為(250~280)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)許可證號(hào):SYXK(湘)2015-0003,自由飲食,溫度(25±2)℃,濕度45%~60%,晝夜均勻交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):20201010-8)。

    1.2 藥物與試劑

    1.2.1藥物 活血榮絡(luò)方(湘藥制字20080472):雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、黃精15 g、玄參10 g、川芎10 g、乳香10 g、沒(méi)藥10 g。各藥混合于置圓底燒瓶中,加10倍量水浸泡12 h后用冷凝回流裝置加熱回流2 h,提取第一次液過(guò)濾,殘?jiān)?倍量水,繼續(xù)冷凝回流1 h,提取第二次液過(guò)濾,合并兩次過(guò)濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮,即得活血榮絡(luò)方浸膏,無(wú)菌玻璃瓶分裝,4 ℃貯存?zhèn)溆?。丁苯酞軟膠囊(中國(guó)石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司,批號(hào):H20050299)。STAT3抑制劑Stattic(美國(guó)Selleck公司,批號(hào):S7024)。

    1.2.2主要試劑 MACO大鼠栓線(北京西濃,批號(hào)2636A4、2638A4)。EDTA(PH8.0)抗原修復(fù)液、自發(fā)熒光淬滅劑(中國(guó)Servicebio,批號(hào)分別為:G1206、G1221-2);CD31、vWF熒光一抗(中國(guó)Servicebio,批號(hào)分別為:GB12063、GB11020);VEGF熒光一抗(武漢三鷹,批號(hào):19003-1-ap);熒光二抗:488山羊抗兔、CY3-山羊抗小鼠、CY3熒光TSA(中國(guó)Servicebio,批號(hào)分別為GB25303、GB21301、G1223);DAPI(中國(guó)Servicebio,批號(hào):G1012)。SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(中國(guó)康為世紀(jì)生物,批號(hào):CW0022S);Immobilon Western HRP底物(美國(guó)Millipore,批號(hào):WBKLS0100);JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體(英國(guó)Abcam,批號(hào)分別為ab108596、ab32101、ab68153、ab76315);β-Actin(美國(guó)Proteintech,批號(hào):20536-1-AP);Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(英國(guó)Abcam,批號(hào):ab150120)。RNA提取試劑盒,RT First Strand cDNA Synthesis Kit,2×SYBR Green qPCR Master Mix (中國(guó)Servicebio,批號(hào)分別為G3013、G3330、G3322);HyPure TMMolecular Biology Grade Water(美國(guó)HyClone,批號(hào)SH30538.02)。

    1.3 主要儀器石蠟切片機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific);顯微成像系統(tǒng)(中國(guó)Motic);Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽、PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(中國(guó)DragonLab);超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkinelmer);正置熒光顯微鏡(日本尼康)。

    2 方法

    2.1 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉滿意后,參考Longa等[5]報(bào)道的大腦中動(dòng)脈阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO),鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),從距ECA與ICA分叉部約4 mm處斜45°剪口進(jìn)拴線,插入拴線約18 mm梗阻右側(cè)大腦中動(dòng)脈;梗阻2 h后拔出拴線進(jìn)行再灌注,以建立局灶性腦缺血/再灌注大鼠(middle cerebral artery occlusion reperfusion,MCAO/R)模型。

    2.2 動(dòng)物分組與給藥將60只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組10只,造模組分別為模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組、Stattic組、活血榮絡(luò)方+ Stattic組(聯(lián)用組),每組各10只。假手術(shù)組分離CCA、ECA、ICA,不插入拴線,余操作與造模組相同,造模組予以MCAO/R法造模。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)死亡、取材時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦出血剔除,根據(jù)需要予以補(bǔ)充。

    手術(shù)6 h后對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃給藥,藥物劑量及時(shí)間參照前期實(shí)驗(yàn)研究及藥物說(shuō)明書。活血榮絡(luò)方組、聯(lián)合組予以活血榮絡(luò)方藥液(11.7 g·kg-1),丁苯酞組予以丁苯酞混懸液(6 mg·kg-1),假手術(shù)組、模型組、Stattic組予以等體積的生理鹽水,每日固定時(shí)間點(diǎn)灌胃給藥1次;Stattic組、聯(lián)合組予以Stattic工作液(3.75 mg·kg-1),假手術(shù)組、模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組予以等體積生理鹽水,每日固定時(shí)間點(diǎn)灌胃給藥1次,各組大鼠連續(xù)給藥7 d后,進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

    2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度各組大鼠分別于d 1、3、7按Zea-Longa′s評(píng)分法[5]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)如下:0 =無(wú)障礙;1=不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2=向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3=向?qū)?cè)傾倒,站立不穩(wěn);4=無(wú)自主活動(dòng)、意識(shí)障礙、不能自發(fā)行走。分值越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

    2.4 免疫熒光染色觀察腦組織皮質(zhì)區(qū)CD31、vWF、VEGF表達(dá)采用免疫熒光染色法檢測(cè)腦組織CD31、vWF、VEGF表達(dá),以CD31與vWF雙染陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)算微血管密度,同時(shí)檢測(cè)VEGF表達(dá),測(cè)定平均熒光強(qiáng)度。石蠟切片脫蠟至水后,置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液中,放置于微波爐內(nèi),中火8 min?;? min轉(zhuǎn)中低火7 min,進(jìn)行抗原修復(fù),自然冷卻后置于PBS中脫色。然后BSA孵育30 min封閉后,將切片與1 ∶200抗CD31、1 ∶200抗vWF和1 ∶3 000抗VEGF在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌后,加與一抗相應(yīng)種屬的二抗,避光室溫孵育50 min,洗滌后加DAPI染液,避光室溫孵育10 min,洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察并采集圖像,采用ImageJ隨機(jī)在鏡下取5個(gè)視野,對(duì)5個(gè)視野中CD31與vWF雙染陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),取5個(gè)視野均數(shù),計(jì)算微血管密度;同時(shí)采用ImageJ測(cè)定腦組織中VEGF平均熒光強(qiáng)度。

    2.5 Western blot法檢測(cè)腦組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)腦組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)。取梗死側(cè)腦組織于冰上,加入裂解液(組織裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)后,經(jīng)組織搗碎勻漿機(jī)充分研磨提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。蛋白上樣量為3 g·L-1,10 μL/孔。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,JAK2、STAT3用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,p-JAK2、p-STAT3用5%BSA封閉1.5 h,一抗JAK2(1 ∶2 000),p-JAK2(1 ∶2 000),STAT3(1 ∶2 000),p-STAT3(1 ∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜3次,10 min/次,二抗(山羊抗兔,1 ∶10 000)37 ℃恒溫水浴搖床孵育60 min,再次洗膜后顯色成像。使用ImageJ分析圖像灰度值,以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    2.6 Real-time PCR法檢測(cè)腦組織JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p的表達(dá)采用Real-time PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組大鼠腦組織中JAK2、STAT3 mRNA與miR-370-3p的表達(dá)。取液氮凍存后的腦組織100 mg,用1 mL的TRIzol Reagent提取腦組織總RNA,使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度。采用RT First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×qPCR Mix 7.5 μL,2.5 μmol·L-1基因引物1.5 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL,ddH2O 4.0 μL。預(yù)變性95 ℃,10 min,循環(huán)(40次)95 ℃,15 s→60 ℃,60 s,熔解曲線60 ℃→95 ℃,每15 s升溫0.3 ℃。mRNA以GAPDH為內(nèi)參;miRNA以U6為內(nèi)參,相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt對(duì)進(jìn)行分析,引物序列見(jiàn)Tab 1。

    Tab 1 PCR primer sequence

    2.7 Pearson相關(guān)性分析腦組織miR-370-3p與JAK2/STAT3通路的相關(guān)性根據(jù)模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組、Stattic組、聯(lián)用組大鼠的miR-370-3p與JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)值,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,并通過(guò)R語(yǔ)言繪制miR-370-3p與JAK2、STAT3的相關(guān)系數(shù)圖。當(dāng)P<0.05時(shí),則兩變量存在相關(guān)性;R>0時(shí)為正相關(guān),R<0為負(fù)相關(guān);0≤|R|<0.3為低度相關(guān),0.3≤|R|<0.5為中度相關(guān),0.5≤|R|<1為高度相關(guān);|R|越大,相關(guān)性越大。

    2.8 LncRNA-H19靶向miR-370-3p調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路培養(yǎng)大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞,對(duì)照組正常培養(yǎng),TNF-α組的細(xì)胞用100 μg·L-1TNF-α處理;將si-NC、si-H19、miR-NC、miR-370-3p mimics轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞,分別記為TNF-α+si-NC組、TNF-α+si-H19組、TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-370-3p組;將si-H19和anti-miR-NC、si-H19和miR-370-3p共轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞,記為TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組、TNF-α+si-H19+anti-miR-370-3p組。RT-qPCR檢測(cè)LncRNA-H19和miR-370-3p表達(dá)水平;熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-H19和miR-370-3p的靶向關(guān)系。

    3 結(jié)果

    3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分Zea-Longa′s評(píng)分越高,神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重,其結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,1 d、3 d、7 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分模型組明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,活血榮絡(luò)方組與丁苯酞組1 d評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05),3 d評(píng)分降低(P<0.05),7 d評(píng)分明顯下降(P<0.01);Stattic組1 d、3 d、7 d評(píng)分均無(wú)明顯變化(P>0.05);聯(lián)用組1 d、3 d評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05),7 d評(píng)分明顯降低(P<0.01)。與活血榮絡(luò)方組比較,丁苯酞組1 d、3 d、7 d評(píng)分均無(wú)明顯變化(P>0.05);Stattic組1 d評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05),3 d、7 d評(píng)分明顯升高(P<0.01);聯(lián)用組1 d、3 d評(píng)分均無(wú)明顯變化(P>0.05),7 d評(píng)分升高(P<0.01);與Stattic組比較,聯(lián)用組1 d評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05),3 d評(píng)分降低(P<0.05),7 d評(píng)分明顯降低(P<0.01),見(jiàn)Tab 2。

    Tab 2 The neurological deficit score of rats

    3.2 各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)CD31、vWF及VEGF表達(dá)大鼠腦組織免疫熒光結(jié)果顯示,以CD31和vWF共表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞作為新生血管,計(jì)算MVD,結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組MVD明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組、聯(lián)用組MVD明顯升高(P<0.01),Stattic組降低(P<0.05)。與活血榮絡(luò)方組比較,丁苯酞組無(wú)明顯變化(P>0.05),Stattic組與聯(lián)用組明顯降低(P<0.01)。與Stattic組比較,聯(lián)用組明顯升高(P<0.01)。VEGF免疫熒光平均熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組明顯升高。與模型組比較,活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組明顯升高(P<0.01),Stattic組明顯降低(P<0.01),聯(lián)用組無(wú)明顯變化(P>0.05)。與活血榮絡(luò)方組比較,丁苯酞組無(wú)明顯變化(P>0.05),Stattic組明顯降低(P<0.01),聯(lián)用組降低(P<0.05)。與Stattic組比較,聯(lián)用組明顯升高(P<0.01)。免疫熒光圖譜見(jiàn)Fig 1、Fig 2,MVD與VEGF平均熒光強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)Fig 3。

    3.3 各組大鼠腦組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,活血榮絡(luò)方組JAK2、p-JAK2、p-STAT3明顯升高(P<0.01),STAT3升高(P<0.05);丁苯酞組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3明顯升高(P<0.01);Stattic組p-JAK2、STAT3、p-STAT3明顯降低(P<0.01),JAK2降低(P<0.05);聯(lián)用組JAK2、p-JAK2、p-STAT3無(wú)明顯變化(P>0.05),STAT3明顯降低(P<0.01)。與活血榮絡(luò)方組比較,丁苯酞組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3無(wú)明顯變化(P>0.05);Stattic組與聯(lián)用組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3均明顯降低(P<0.01)。與Stattic組比較,聯(lián)用組p-JAK2、STAT3、p-STAT3明顯升高(P<0.01),JAK2升高(P<0.05),見(jiàn)Fig 4。

    Fig 1 Double immunofluorescence staining of CD31 and vWF in brain tissue of rats in each groupA:Sham operation;B:Model;C:Huoxue rongluo prescription;D:Butylphthalide;E:Stattic;F:Combination

    Fig 2 Immunofluorescence staining of VEGF in brain tissue of rats in each groupA:Sham operation;B:Model;C:Huoxue rongluo prescription;D:Butylphthalide;E:Stattic;F:Combination

    Fig 3 Mean fluorescence intensity of MVD and VEGF in cerebral cortex of A:Sham operation;B:Model;C:Huoxue rongluo prescription;D:Butylphthalide;E:Stattic;F:Combination.**P<0.01 vs Sham operation;#P<0.05,##P<0.01 vs Model;&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription;△△P<0.01 vs Stattic

    3.4 各組大鼠腦組織JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組JAK2、STAT3 mRNA及miR-370-3p均明顯升高。與模型組比較,活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組JAK2、STAT3 mRNA均明顯升高(P<0.01),miR-370-3p明顯降低(P<0.01);Stattic組JAK2 mRNA、miR-370-3p無(wú)明顯變化(P>0.05),STAT3 mRNA明顯降低(P<0.01);聯(lián)用組JAK2 mRNA均明顯升高(P<0.01),STAT3 mRNA與miR-370-3p明顯降低(P<0.01)。與活血榮絡(luò)方組比較,Stattic組JAK2、STAT3 mRNA明顯降低(P<0.01),miR-370-3p明顯升高(P<0.01);聯(lián)用組JAK2、STAT3 mRNA明顯降低(P<0.01),miR-370-3p無(wú)明顯變化(P>0.05)。與Stattic組比較,聯(lián)用組JAK2、STAT3 mRNA明顯升高(P<0.01),miR-370-3p明顯降低(P<0.01),見(jiàn)Fig 5。

    Fig 4 Relative expression values of JAK2,p-jak2,STAT3 and p-STAT3 proteins in brain tissue of rats in each groupA.Sham operation;B.Model;C.Huoxue rongluo prescription;D.Butylphthalide;E.Stattic;F.Combination.**P<0.01 vs Sham operation;##P<0.01,#P<0.05 vs Model;&P<0.05,&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription;△△P<0.01,△P<0.05 vs Stattic

    Fig 5 Expression of JAK2,STAT3 mRNA and mir-370-3p in brain tissue of rats in each groupA:Sham operation;B:Model;C:Huoxue rongluo prescription;D:Butylphthalide;E:Stattic;F:Combination.**P<0.01 vs Sham operation;##P<0.01 vs Model;&&P<0.01 vs Huoxue rongluo prescription;△△P<0.01 vs Stattic

    3.5 大鼠腦組織miR-370-3p與JAK2、STAT3的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-370-3p與JAK2、STAT3高度負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.92、-0.53;JAK2與STAT3高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.64,見(jiàn)Fig 6。

    Fig 6 Correlation coefficient of mir-370-3p with JAK2 and STAT3

    3.6 LncRNA-H19和miR-370-3p在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)與對(duì)照組比較,LncRNA-H19在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高,miR-370-3p在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見(jiàn)Tab 3。

    Tab 3 TNF-α of lncRNA-h19 and miR-370-3p expression level of brain vascular smooth muscle cells induced by TNF-α

    3.7 LncRNA-H19和miR-370-3p的靶向調(diào)控關(guān)系雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TNF-α+miR-370-3p組與TNF-α+miR-NC組比較,WT-H19熒光素酶活性差異具有明顯性(P<0.05),MUT-H19熒光素酶活性差異無(wú)明顯性(P>0.05),見(jiàn)Tab 4、Fig 7。

    Fig 7 The targeted regulatory relationship between lncRNA-H19 and miR-370-3p

    Tab 4 Double luciferase report

    4 討論

    缺血性腦卒中發(fā)生后,機(jī)體可啟動(dòng)內(nèi)源性血管新生系統(tǒng),改善腦側(cè)支循環(huán),增加腦血流灌注,為局部缺血區(qū)供氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以挽救腦組織缺血缺氧狀態(tài),加快神經(jīng)功能恢復(fù)。

    STAT/HIF-1α/VEGF通路是缺血性腦卒中后血管新生的關(guān)鍵通路,缺血性腦卒中發(fā)生后,IL-6、TNF等多種炎癥因子、細(xì)胞因子與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后,通過(guò)磷酸化的方式激活JAK2/STAT3通路,在細(xì)胞核內(nèi)形成同源或異源STAT3二聚體,易位入核,促進(jìn)核內(nèi)HIF-1α轉(zhuǎn)錄,使得HIF-1α下游VEGF轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步激活,介導(dǎo)下游PI3K-AKT通路、PLCγ1-PKC通路、MAPK通路[6],促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)增殖、遷移、分化成管,調(diào)控Rho家族蛋白促進(jìn)血管偽足形成,在多種疾病血管新生中發(fā)揮重要作用[7]。miRNA能特異性識(shí)別下游目的基因mRNA 3′UTR,抑制下游基因表達(dá),參與調(diào)控血管新生的進(jìn)程[8]。Stattic是非肽類STAT3 SH2結(jié)構(gòu)域抑制劑,能有效抑制STAT3激活和核易位,Xue等[9]研究發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT3通路抑制劑Stattic抑制ECs增殖,下調(diào)了VEGFA/B、VEGFR2的表達(dá),抑制血管新生。

    團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),“陰虛血瘀—榮氣虛滯”理論立方的活血榮絡(luò)方在缺血性腦卒中早期能調(diào)控JAK2/STAT3通路,降低IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達(dá),減輕腦缺血再灌注后炎癥損傷[10];在缺血性腦卒中后期能促進(jìn)Caveolin-1蛋白表達(dá),增加梗死區(qū)微血管密度,促進(jìn)腦梗死后血管新生;其有效成分可能通過(guò) STAT3/miRNA 反饋環(huán)路激活 STAT/HIF-1/VEGF 信號(hào)通路促腦梗死后血管新生[11],為中醫(yī)藥治療腦梗死疾病提出了深層次的分子機(jī)制及新的方向。前期檢索Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),STAT3的轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程受10位上游miRNA的調(diào)控,根據(jù)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)及權(quán)重分?jǐn)?shù)可知,排列前三位的是miR-370-3p、miR-290、miR-292-5p(預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)均達(dá)85),因此推測(cè)缺血性腦卒中的發(fā)生機(jī)制可能與miR-370-3p調(diào)控JAK2/STAT3通路有關(guān),且活血榮絡(luò)方可能參與此機(jī)制促進(jìn)缺血性腦卒中后期血管新生。

    CD31與vWF是ECs的特異性標(biāo)志蛋白,大鼠腦組織免疫熒光染色后CD31、vWF和DAPI分別呈現(xiàn)紅色、綠色和藍(lán)色,CD31與vWF共表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞作為新生血管,計(jì)算微血管密度,結(jié)果顯示活血榮絡(luò)方能明顯促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠血管新生及腦組織中VEGF的表達(dá),Stattic能明顯抑制缺血性腦卒中大鼠血管新生及腦組織中VEGF的表達(dá)。提示在大鼠缺血性腦卒中后,機(jī)體內(nèi)源性血管新生啟動(dòng),活血榮絡(luò)方可能有促進(jìn)作用,而Stattic作為特異性STAT3抑制劑,在一定程度上可能抑制了內(nèi)源性血管新生的啟動(dòng)。

    LncRNAH19為父系印記基因,位于人類染色體11p15.5的端粒區(qū)域附近的H19/IGF2基因簇上,該區(qū)域常涉及兒童和成人腫瘤。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA H19可作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DUSP5,并解除DUSP5對(duì)其靶基因Erk1/2的抑制,即通過(guò)lncRNA H19/DUSP5/Erk1/2調(diào)控軸激活自噬過(guò)程從而誘導(dǎo)腦IRI[12];miR-370-3p是一個(gè)腫瘤相關(guān)miRNA,可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等生理過(guò)程,抑制腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌細(xì)胞的侵襲。Cui等[13]研究表明,miR-370-3p參與下丘腦的慢性電針耐受過(guò)程,過(guò)表達(dá)miR-370-3p可降低電針耐受,提示miR-370-3p可能具有神經(jīng)生理調(diào)節(jié)能力,可能作為一種靶點(diǎn)干預(yù)抑郁癥。另外,經(jīng)過(guò)TargetScan3.1軟件預(yù)測(cè)miR-370-3p可能與lncRNA H19存在靶向關(guān)系,雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證lncRNA H19是miR-370-3p靶向調(diào)控分子。

    Western blot、RT-PCR及Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示JAK2與STAT3呈高度正相關(guān),二者與miR-370-3p呈高度負(fù)相關(guān);活血榮絡(luò)方能上調(diào)JAK2、STAT3 mRNA表達(dá),也能促進(jìn)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá);而Stattic能下調(diào)STAT3 mRNA表達(dá),且能抑制JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá),提示活血榮絡(luò)方與丁苯酞能下調(diào)miR-370-3p的表達(dá),激活JAK2/STAT3通路;Stattic在不影響miR-370-3p的表達(dá)的條件下,可能通過(guò)磷酸化途徑抑制JAK2/STAT3通路。Ruan等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-370在MCAO大鼠腦組織中過(guò)表達(dá),能靶向抑制SIRT6表達(dá),激活Nrf2/ARE通路,加重神經(jīng)功能缺損。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn),激活STAT3能上調(diào)VEGF的表達(dá),此過(guò)程能被Stattic逆轉(zhuǎn),與Carbajo等[16]報(bào)道的Stattic阻斷HIF-1α/STAT3通路,抑制VEGF表達(dá),抗血管新生的結(jié)果相互佐證。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn),丁苯酞能激活JAK2/STAT3通路,減輕海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,改善腦缺血損傷。

    同時(shí),TNF-α+si-H19組和TNF-α+si-H19+anti-miR-370-3p組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高。提示活血榮絡(luò)方可能下調(diào)miR-370-3p的表達(dá)及l(fā)ncRNA H19靶向激活JAK2/STAT3通路,從而促進(jìn)VEGF表達(dá)并刺激血管新生,改善大鼠缺血性腦卒中后神經(jīng)功能癥狀。

    綜上所述,活血榮絡(luò)方治療缺血性腦卒中的機(jī)制可能與其下調(diào)miR-370-3p的表達(dá),激活JAK2/STAT3通路,促進(jìn)下游VEGF的表達(dá),刺激缺血性腦卒中后血管新生,改善神經(jīng)功能缺損癥狀有關(guān),為進(jìn)一步中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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