柚皮素通過(guò)調(diào)控TGF-β1/smad通路抑制肝纖維化

岳杉杉，彭安康，馬澤江，祁 榮

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191)

肝纖維化是肝臟在受到多種因素?fù)p傷之后的一種病理過(guò)程[1]。纖維化早期階段具有一定的可逆性，但如果不加以藥物控制和治療，纖維化程度將進(jìn)一步加重，發(fā)展為肝硬化、肝衰竭，甚至肝癌。目前臨床上尚缺乏特異性治療肝臟纖維化的藥物。

柚皮素(naringenin，NGN)是一種富含于柑橘類水果中的黃酮類化合物，其中在葡萄柚中含量最為豐富。目前已有研究表明NGN具有多種生物活性，如：能夠明顯減少巨噬細(xì)胞激活后炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等的分泌，起到抗炎作用[2]；可以激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2),使得血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)上調(diào)，起到抗氧化作用[3-4]；可以明顯促進(jìn)肝細(xì)胞代謝，起到抑制ApoE-/-小鼠高脂血癥所致的脂肪肝的作用[5]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，NGN對(duì)四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)誘導(dǎo)的肝纖維化具有保護(hù)作用[6-7]。但CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化為化學(xué)性損傷所導(dǎo)致，而化學(xué)損傷導(dǎo)致的肝臟纖維化并不是臨床病人中常見(jiàn)的發(fā)病原因。與此同時(shí)，社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展促使人們的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，代謝性肝纖維化的發(fā)病率與日俱增。蛋氨酸-膽堿缺乏飼料(methionine-and choline-deficient diet，MCD diet)是研究者公認(rèn)的可用于研究小鼠代謝性肝纖維化的模型，MCD飼料誘導(dǎo)的肝纖維化可以很好的模擬代謝性肝纖維化病人的病理特征，即小鼠肝臟可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪樣變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝竇周圍纖維化。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)NGN可劑量依賴性地抑制MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積和肝臟核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、NLRP3炎癥小體的表達(dá)量[8-9]。但是NGN對(duì)MCD飼料誘導(dǎo)的肝纖維化的作用尚不清楚，也無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究在體外轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)激活的LX2細(xì)胞纖維化模型及MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化體內(nèi)模型上，研究NGN對(duì)肝臟纖維化的抑制作用及機(jī)制，研究結(jié)果將為臨床治療肝纖維化提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑及儀器NGN(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：445AD-m7，純度>98%)。ProteinExtTMMammalian Total Protein Extraction Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：001021)，甘氨酸(上海阿拉丁有限公司，批號(hào)：L1928057)，Tris base(美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：913056784)，TransZol Up(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0327)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：K622)，TransStart Top Green qPCR Supermix(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AQ131)，高糖DMEM培養(yǎng)基(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P10413)，胎牛血清(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FS201)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(美國(guó)peprotech公司，批號(hào)：0918AF354)，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)賽默飛公司，批號(hào)：UE284356)，ECL試劑盒(南京諾唯贊生物科技技術(shù)有限公司，批號(hào)：7E4321KO)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19060315)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：196790315)，鼠抗GAPDH多克隆抗體(中國(guó)康城技術(shù)有限公司，批號(hào)：KG5G4)，兔抗人血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)多克隆抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：14395-1-AP)，兔抗人TGF-β1多克隆抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：218981-1-AP)，兔抗人p-smad2 /p-smad3多克隆抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：5675063)，45%高脂蛋氨酸，膽堿缺乏飼料(南通特羅菲飼料科技有限公司購(gòu)買，批號(hào)：TP20190825)。

1.2 儀器普通PCR儀(美國(guó)MJ Research公司，型號(hào)：960)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent公司，型號(hào)：Agilent M×3005P)，臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司，型號(hào)：Legend micro 21R)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司，型號(hào)：ELX808)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Heracell)，熒光顯微鏡(日本Olympus 公司，型號(hào)：Th4-200)。

1.3 方法

1.3.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率[10]人肝星狀細(xì)胞LX2用含10%胎牛血清和1%雙抗(鏈霉素-青霉素)的DMEM培養(yǎng)，放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。待LX2細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，按每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。當(dāng)細(xì)胞貼壁之后，用不含F(xiàn)BS只含1%雙抗的DMEM饑餓細(xì)胞。24 h后，棄掉培養(yǎng)基，分別用含25、50、100、200、400、800、1 000 μmol·L-1NGN的10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM處理細(xì)胞。24 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入100 μL含有MTT的10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM。4 h之后，棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入150 μL二甲基亞砜。振板10 min，在490 nm處檢測(cè)每孔的吸光值。

1.3.2細(xì)胞及分組 LX2細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，按40×107個(gè)·L-1密度接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞貼壁之后，用不含胎牛血清只含1%雙抗的DMEM饑餓細(xì)胞24 h。細(xì)胞分組為：對(duì)照組，模型組(TGF-β1)，NGN低劑量組(100 μmol·L-1)和NGN高劑量組(200 μmol·L-1)。對(duì)照組用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)，模型組用含10 μg·L-1TGF-β1的10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)，NGN組用含10 μg·L-1TGF-β1和100/200 μmol·L-1NGN的10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)，24 h后收細(xì)胞，用于相關(guān)蛋白和基因的檢測(cè)。

1.3.3動(dòng)物分組及干預(yù) 8～10周齡的雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20～25)g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度維持在(25±2)℃，環(huán)境濕度維持在50%，光照和黑暗12 h更換交替，小鼠可自由獲取水和食物。本實(shí)驗(yàn)獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LA2016035)。

小鼠用普通飼料喂飼3 d后，隨機(jī)分為3組，即：對(duì)照組、模型組、NGN處理組，對(duì)照組給予正常飼料，模型組和NGN組給予MCD 飼料，對(duì)照組和模型組每天給予0.5%羧甲基纖維素納灌胃，給藥組每天給予NGN(0.5% 羧甲基纖維素納混懸配制)灌胃，劑量為100 mg·kg-1，6周后，犧牲小鼠，取材，制備石蠟切片進(jìn)行天狼猩紅染色，HE染色以及提取RNA和蛋白質(zhì)用于檢測(cè)纖維化相關(guān)基因(α-SMA，col1和col3)，纖維化相關(guān)蛋白(α-SMA和col1)和TGF-β/smad通路蛋白(TGF-β1，p-smad2和p-smad3)的表達(dá)水平。

1.3.4蘇木精-伊紅染色方法檢測(cè)肝臟形態(tài)[8]石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘30 min；二甲苯脫蠟10 min，共3次；100%酒精洗2次，每次3 min，95%酒精洗2次，每次3 min，80%酒精洗3 min，70%酒精洗3 min；自來(lái)水下清洗切片；將切片放置在蘇木精染液中1～3 min，自來(lái)水下清洗片子；將切片依次放置在85%酒精、95%酒精中進(jìn)行脫水處理各5 min。將切片放置在伊紅染液中3～5 min。自來(lái)水下清洗切片；切片依次放置在100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精、二甲苯中各處理5 min；用樹脂封片，干燥后，在顯微鏡下拍照。

1.3.5天狼猩紅染色方法檢測(cè)肝臟纖維化程度 石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘30 min；二甲苯脫蠟10 min，共3次；100%酒精洗2次，每次3 min，95%酒精洗2次，每次3 min，80%酒精洗3 min，70%酒精洗3 min；自來(lái)水下清洗切片；天狼猩紅染液染色1 h。自來(lái)水下清洗切片；切片依次放置在100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精、二甲苯中各處理5 min；用樹脂封片，干燥后，在顯微鏡下拍照，照片使用ImageJ軟件分析其纖維化區(qū)域占整個(gè)區(qū)域的比例，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)纖維化相關(guān)基因的表達(dá) 用TransZol Up提取細(xì)胞和肝臟中總RNA；按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照TransStart Top Green qPCR Supermix說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primers involved in qPCR

1.3.7Western blot方法檢測(cè)蛋白的表達(dá)[8]使用TPEB裂解細(xì)胞和肝臟組織，液氮反復(fù)凍融3次，離心，使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。取一定量的蛋白上清液中加入SDS上樣緩沖液，在95 ℃煮10 min。處理好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(根據(jù)說(shuō)明書配置相應(yīng)濃度)在4 ℃冰箱中過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，條帶上滴加ECL，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 NGN對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX2存活率的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 1)顯示，用25～200 μmol·L-1NGN處理人肝星狀細(xì)胞后，檢測(cè)到細(xì)胞存活率在80%以上。

Fig 1 Effect of naringenin on LX2 cells

2.2 NGN對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞LX2細(xì)胞纖維化相關(guān)基因的影響qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組col3和col1 mRNA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，NGN低劑量組col1和col3 mRNA表達(dá)未出現(xiàn)明顯差異，NGN高劑量組col3和col1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Fig 2。所以，在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中選用200 μmol·L-1NGN研究其抗纖維化的作用及機(jī)制。

2.3 NGN對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，NGN處理組α-SMA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 Effects of naringenin on mRNA expression of genes related to fibrosis in LX2 cells induced by A:mRNA levels of Col3;B:mRNA levels of Col1;1:Control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NGN 100 μmol·L-1;4:TGF-β1+NGN 200 μmol·L-1；*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs TGF-β1 group

Fig 3 Effects of naringenin on protein expression of α-SMA in LX2 cells induced by 1:Control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NGN 200 μmol·L-1;*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs TGF-β1 group

2.4 NGN對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞LX2細(xì)胞TGF-β1/smad通路蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組TGF-β1和p-smad2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，NGN處理組TGF-β1和p-smad2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Effects of naringenin on protein expression of TGF-β1 and p-smad2 in LX2 cells induced by 1:Control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NGN 200 μmol·L-1;*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs TGF-β1 group

2.5 NGN對(duì)MCD飼料誘導(dǎo)的小鼠體重、肝重的影響與對(duì)照組相比，MCD飼料喂飼6周之后小鼠的體質(zhì)量和肝質(zhì)量明顯降低，肝/體質(zhì)量比明顯升高；與模型組相比，NGN處理組小鼠肝質(zhì)量、體質(zhì)量以及肝/體質(zhì)量比與模型組相比，沒(méi)有明顯改變，見(jiàn)Fig 5。

Fig 5 Effects of naringenin on liver and body weight of mice induced by MCD diet A,B:Body weight；C：Liver weight；D：The ratio of liver weight to body weight;1:Control;2:MCD;3:MCD+NGN 100 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 6 Effects of naringenin on liver fibrosis and mRNA levels of genes related to fibrosis in mice induced by MCD A：HE staining (×100)；B，C：Sirius red staining (×100,×500)；D：mRNA levels α-SMA,col3,col1;1:Control;2:MCD;3:MCD+NGN 100 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs MCD group

2.6 NGN對(duì)MCD飼料誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化及相關(guān)基因的影響HE染色和天狼猩紅染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MCD飼料喂飼6周后，小鼠肝臟細(xì)胞排列不規(guī)則，且有空泡形成，纖維化程度明顯增加；與模型組相比，NGN處理組細(xì)胞排列規(guī)則，空泡減少，且肝臟纖維化程度明顯降低(Fig 6A-C)。肝臟組織mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，模型組α-SMA，col1和col3 mRNA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，NGN處理組α-SMA，col1和col3 mRNA明顯降低(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，見(jiàn)Fig 6D。

2.7 NGN對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟α-SMA和col1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，NGN處理組小鼠肝臟α-SMA和col1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Fig 7。

2.8 NGN對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟TGF-β1/smad通路蛋白的影響Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組p-smad2，p-smad3 和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，NGN處理組小鼠肝臟p-smad2，p-smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Fig 8。

Fig 7 Effects of naringenin on protein expression of col1 and α-SMA in mice induced by MCD *P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs MCD group

Fig 8 Effects of naringenin on activation of TGF-β1/smad pathway in mice induced by MCD *P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs MCD group

3 討論

肝纖維化是肝臟受到多種肝損傷因素刺激后的一種病理改變，其特征主要是細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積[1]。若肝損傷是急性、暫時(shí)的，纖維化可逐漸被吸收而恢復(fù)成為正常的肝臟結(jié)構(gòu)；但若損傷是慢性、持續(xù)的，細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)持續(xù)積累，部分纖維化會(huì)形成瘢痕組織代替肝實(shí)質(zhì)，造成不可逆的肝纖維化，最終可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭甚至肝癌[11]。在應(yīng)激條件下，肝星狀細(xì)胞可由靜息狀態(tài)激活為活化狀態(tài)，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，具有增殖的特性同時(shí)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白、纖維連接蛋白等)和細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)[12]。

肝纖維化造模方法包括：化學(xué)性損傷[13]、代謝障礙[14]等導(dǎo)致的肝纖維化?；瘜W(xué)性損傷如CCL4所致的肝纖維化具有周期短、易操作的特點(diǎn)，但是死亡率高，且化學(xué)性損傷所導(dǎo)致的肝纖維化不是臨床肝纖維化病人常見(jiàn)的誘發(fā)因素[15]。目前代謝障礙導(dǎo)致的肝纖維化在臨床中的發(fā)病率逐年升高[16]，MCD飼料誘導(dǎo)的肝纖維化是代謝性肝纖維化常見(jiàn)的模型。本研究采用MCD飼料喂飼小鼠6周誘導(dǎo)肝纖維化[17]，研究NGN抑制肝纖維化的作用與機(jī)制，為臨床上治療代謝性肝纖維化提供新的思路。

在本研究中，HE染色和天狼猩紅染色結(jié)果顯示，NGN明顯降低了MCD飼料誘導(dǎo)的肝臟纖維化的程度；與MCD飼料造模組相比，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示NGN明顯降低纖維化相關(guān)基因(a-SMA，col1，col3)的mRNA表達(dá)；Western blot對(duì)a-SMA和col1的蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與造模組相相比，NGN明顯下調(diào)該兩種蛋白的表達(dá)。同樣，在人肝星狀細(xì)胞LX2中，與TGF-β1誘導(dǎo)的模型組相比，NGN低劑量處理組col1和col3 mRNA表達(dá)未出現(xiàn)明顯差異，NGN高劑量處理組col3和col1 mRNA表達(dá)明顯降低。此外，200 μmol·L-1NGN明顯下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)LX2細(xì)胞a-SMA蛋白的表達(dá)。以上的結(jié)果顯示，NGN可以劑量依賴性的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞纖維化和蛋氨酸、膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。

有研究表明TGF-β1/smad3通路參與了纖維化發(fā)生、發(fā)展。TGF-β1與膜受體結(jié)合后，激活smad2和smad3，促使smad2/smad3/smad4復(fù)合體形成，隨后該復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，促使col1、col3等基因的轉(zhuǎn)錄[18]。在本研究中，與MCD飼料造模組相比，NGN處理明顯抑制了小鼠肝臟組織中TGF-β1、p-smad2、p-smad3蛋白的表達(dá)；此外，在LX2細(xì)胞中，NGN處理也同樣明顯抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的TGF-β1、p-smad3蛋白的表達(dá)。以上的結(jié)果顯示,NGN明顯抑制了TGF-β/smad通路的激活。

綜上所述，NGN對(duì)肝臟纖維化具有抑制作用，機(jī)制與其抑制TGF-β/smad通路激活有關(guān)。