高原鼠兔對極端低氧環(huán)境的生理、行為和分子生物學適應研究進展

齊麗紅 鄒登朗 祁得勝 劉忠浩 馬建濱 都玉蓉

(青海師范大學生命科學學院，青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧，810008)

在高原環(huán)境中，隨著海拔的升高，氧濃度隨之降低。當人類從平原進入高原環(huán)境時，高海拔迫使人體降低動脈血氧分壓和血氧飽和度，最終導致組織和器官缺氧。反過來，出現(xiàn)急性高海拔缺氧或輕度高原反應，都會影響體內(nèi)物質(zhì)的代謝并阻礙正常的身體功能，可能導致高海拔肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高海拔腦水腫(high altitude cerebraledema，HACE)，而慢性高海拔缺氧會導致紅細胞增多癥和心血管疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計，在海拔3 000～5 000 m時，氧氣體積分數(shù)僅為平原的60%，此時會使機體處于缺氧狀態(tài)。當處于缺氧狀態(tài)時，機體會產(chǎn)生一系列復雜的生理變化來適應缺氧[2]。低氧適應是機體應對極端環(huán)境的保護性機制，指生物體進入低氧環(huán)境后，通過自身調(diào)節(jié)，最終達到一種新的動態(tài)平衡的過程[3]。青藏高原具有十分獨特的氣候和地理環(huán)境，如缺氧、寒冷、強紫外線等，而低氧是高原最明顯的氣候特征，對動物的生存有著深遠的影響。經(jīng)過長期的進化適應，許多高原土著動物已經(jīng)形成了自己獨特的適應高原環(huán)境的機制[4]。

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)屬兔形目(Lagomorpha)，鼠兔科(Ochotonidae)，鼠兔屬，是生活在青藏高原海拔3 000～5 000 m的特有種[5]。高原缺氧是青藏高原明顯的非生物脅迫源，研究發(fā)現(xiàn)，青藏高原高海拔地區(qū)動物已經(jīng)發(fā)展出獨特的心血管、血液和呼吸系統(tǒng)，以確保適應惡劣的環(huán)境[6]。在許多高原哺乳動物中，通過增加微血管密度、增加紅細胞數(shù)目和減弱低氧性肺血管收縮反應來適應高原缺氧[7-8]。筆者在馬蘭等[9]對高原鼠兔低氧基因研究的基礎上，對高原鼠兔低氧適應的生理機制和分子機制進行了進一步闡述。

1 生理學適應

在長期的進化過程中，高原鼠兔的組織器官為適應低氧環(huán)境而產(chǎn)生了一系列的變化。鼠兔的肺組織中毛細血管豐富，血管壁薄，有利于氣體交換，保證機體的正常需氧量。在低氧環(huán)境中，鼠兔的心臟不會出現(xiàn)肥厚現(xiàn)象，避免了長期低氧對心臟的損傷。

1.1 血液學特征

高原鼠兔因長期在高原環(huán)境下生存，能夠很好地適應低氧環(huán)境。在血液學方面，表現(xiàn)為血液與血紅蛋白(hemoglobin，Hb)的結合、釋放氧的能力較高，這對低氧時體內(nèi)氧的傳遞是有利的。有研究表明，高原鼠兔在低氧條件下的適應表現(xiàn)為氧解離曲線(oxygen dissociation curve，ODC)左移，即血紅蛋白與氧結合能力增強，而氧解離曲線中段較陡的部分可以說明它有利于氧在肺部的運輸與釋放，便于組織臟器獲取更多的氧[10]。P50值變小、紅細胞氧解離能力增強。高原鼠兔紅細胞的共同特征是低血紅蛋白、低血細胞比容(hematocrit，HT)和低平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)，這一特征使得高原鼠兔血液在肺部進行氣體交換的紅細胞的表面積增大，利于紅細胞攜氧運輸。血液中的HT和MCV降低時，對血液黏度、血液循環(huán)阻力都有舒緩作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔的動脈血與靜脈血的血氧飽和度差顯著高于SD大鼠，表明高原鼠兔的血氧利用率更高[10]。

1.2 肺組織

高原鼠兔肺泡內(nèi)有大量的彈性纖維[14]，并有由內(nèi)皮細胞組成的豐富毛細血管，且管壁薄。鼠兔的肺小動脈壁缺少平滑肌層而變得非常薄，直徑100 μm以內(nèi)的肺小動脈壁僅由一層彈力纖維組成[15]。薄的肺小動脈壁有利于在低氧條件下進行氣體交換，使更多的氧進入肺部，從而保證其在低氧環(huán)境中處于正常氧狀態(tài)，更好地適應低氧環(huán)境。

1.3 心臟

人類和動物長期處在高海拔環(huán)境中會導致適應性的心肺變化，以維持缺氧條件下組織的氧氣輸送。人類在適應高原環(huán)境過程中，會通過心房起搏增加最大心率(maximal heart rate，HRmax)，這會使β-腎上腺素能受體脫敏，長期缺氧的大鼠心肌β-腎上腺素受體的密度會降低。因此，一種可能的低氧適應機制是β-腎上腺素能受體脫敏反應，以降低最大心率而對心臟缺氧進行保護[16]。高原鼠兔通過抑制腎上腺素基因的表達，來降低腎上腺素的濃度，從而降低心臟的工作速度，避免長期低氧對心臟的損傷，從而更好地適應低氧環(huán)境。且高原鼠兔長期適應低氧環(huán)境顯示出更高的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表達，表明其通過VEGF途徑促進心臟血管生成[17]。

2 行為學適應

高原鼠兔在不同的低氧環(huán)境下存在不同的繁殖對策，說明高原鼠兔在長期的低氧進化過程中產(chǎn)生了繁殖上的適應。有研究發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔在不同的海拔高度下的繁殖對策存在顯著差異。處于低海拔地區(qū)的高原鼠兔每年繁殖2～3次，胎仔數(shù)為(4.5±0.1)，在氣溫回升的暖季月平均存活率為23.4%～28.6%[18]；處于高海拔地區(qū)的高原鼠兔每年繁殖1～2次，胎仔數(shù)為(3.2±0.1)，暖季月平均存活率為33.5%～50.3%[19-20]。海拔越高，氧氣越稀薄，溫度越低，食物越少。為了減少自身消耗，更好地適應高海拔環(huán)境，高原鼠兔在高海拔地區(qū)的繁殖次數(shù)明顯減少。同時，為了提高種群密度，高原鼠兔通過增加胎仔數(shù)和存活率來更好地適應低氧、低溫、食物少的環(huán)境。

3 分子生物學適應

3.1 血管生成

VEGF廣泛存在于動物體的各個組織中，在血管生成、血管重塑、組織缺氧過程中發(fā)揮著重要作用。VEGF是內(nèi)皮細胞上的一種特異性結合蛋白，是調(diào)節(jié)細胞和血管的關鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是唯一能誘導血管特異性生成的蛋白[21]。VEGF具有降低動脈壓的作用，低氧刺激下可使體內(nèi)VEGF表達量增高，促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新血管的生成，同時使血管通透性增加，使更多的氧氣進入組織。VEGF還可以增加心率和心輸出量，但VEGF的表達不會對心肌力收縮產(chǎn)生影響，卻可以通過增加血管通透性來降低血管外周阻力[22-23]。VEGF165和VEGF189在高原鼠兔體內(nèi)顯示出組織和海拔的特異性表達模式。對高原鼠兔的VEGF165和VEGF189亞型克隆分析，發(fā)現(xiàn)VEGF165和VEGF189通過不同的機制參與了鼠兔腦和肌肉對缺氧的適應，且VEGF189在鼠兔腦和肌肉中的表達高于VEGF165。此外，鼠兔大腦、肌肉和肺中的VEGE189水平還與其棲息地的海拔高度相關[24]。VEGF在高原鼠兔中有不同的表達模式，進一步表明VEGF在高原鼠兔低氧適應中的重要作用。

一氧化氮(NO)是一種有效的血管舒張劑，在預防缺氧性肺動脈高壓中起重要作用。NO由L-精氨酸的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)合成[25-26]，可通過增加胞漿內(nèi)環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平，進而啟動細胞內(nèi)一系列蛋白的磷酸化反應，實現(xiàn)對肺循環(huán)基礎張力和血流量的調(diào)節(jié)。高海拔地區(qū)的動物誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。在高原鼠兔體內(nèi)iNOS的表達和NO的產(chǎn)生均受到抑制，高原鼠兔體內(nèi)NO濃度的降低可能對高原鼠兔在低氧環(huán)境中的生存起著重要作用。

3.2 能量代謝

缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是由HIF-1α和HIF-β組成的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞對缺氧反應的信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。HIF-1是一種在大多數(shù)細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，在氧感應和傳導中起關鍵作用。HIF-1的α亞基是一個功能部位。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在正常氧氣條件下被泛素化和蛋白酶體降解，而在缺氧條件下降解途徑被阻斷，使HIF-1α積聚并遷移到細胞核。謝惠春等[27]研究表明，在缺氧環(huán)境中，HIF-1α通過調(diào)節(jié)骨骼肌中VEGF的表達來調(diào)節(jié)血管功能和提高血流量。也有研究表明在缺氧環(huán)境下，細胞中HIF-1可誘導VEGF的表達，促進血管生成[28]。新生的血管增加缺氧部分的血液供應，以緩解組織細胞的缺氧情況[29]。研究表明，HIF-1α在高原鼠兔腦和腎中的表達較高，進一步表明HIF-1對高原鼠兔在缺氧條件下生存適應的重要作用[30]。

精子特異性乳酸脫氫酶-C4(sperm-specific lactate dehydrogenase，LDH-C4)基因，最早被發(fā)現(xiàn)在睪丸和精子中表達。LDH-C4是乳酸脫氫酶(LDH)同工酶之一。LDH-C4對丙酮酸的親和力高于乳酸，并催化人類和其他物種精液中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，促進糖酵解繼續(xù)產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosadenine，ATP)。利用精子特異性乳酸脫氫酶的特異性抑制劑(N-isopropyl oxamate)證明，LDH-C4具有增強鼠兔的短跑能力，對高原鼠兔適應高原缺氧環(huán)境具有重要作用[22]。研究表明，LDH-C在高原鼠兔骨骼肌中有利于丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，加速厭氧糖酵解生成ATP[26，31]。LDH-C在高原鼠兔骨骼肌中的表達增加了高原鼠兔的無氧糖酵解，減少對氧的消耗，增強了對高原缺氧環(huán)境的適應能力[28]。

細胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase，COX)是線粒體氧化能力的關鍵調(diào)節(jié)蛋白[32]。早期研究發(fā)現(xiàn)，呼吸鏈在真核生物的冷信號和缺氧信號中都有作用[33]。當哺乳動物細胞暴露在氧氣濃度降低的環(huán)境中時，會發(fā)生氧化應激反應，導致活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1，SOD 1)的表達增加。線粒體產(chǎn)生的ROS可以穩(wěn)定HIF-1α[34]。細胞色素c氧化酶通過蛋白質(zhì)硝基化途徑誘導核缺氧基因的表達[35]。通過比較高原鼠兔和北美鼠兔(Ochotonaprinceps)發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔在Cox1和Cox2中氨基酸序列發(fā)生變化，在Cox1跨膜區(qū)域Ⅻ的452號位點，高原鼠兔存在蘇氨酸殘基，而北美鼠兔為蛋氨酸殘基。在Cox2的N端的5號位點，高原鼠兔的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，這些氨基酸的替代可能是對低氧環(huán)境適應的重要因素。同時，這些變化可以解釋線粒體基因組介導的細胞色素c氧化酶亞基修飾，這種修飾可增強缺氧時的線粒體呼吸，并有助于HIF-1調(diào)節(jié)復雜的Ⅳ亞基交換[36]。

3.3 攜氧蛋白

血紅蛋白具有儲存運輸氧氣的功能，是組成遞氧系統(tǒng)的主要蛋白[37]。低氧是高原地區(qū)的主要特點，當生物處于低氧環(huán)境時，體內(nèi)紅細胞中血紅蛋白增加，同時血紅蛋白與氧結合形成氧合血紅蛋白，增加與氧的親和力[38]。研究表明，高原鼠兔在不降低血氧飽和度的情況下，通過消除缺氧血管收縮驅(qū)動力，適應低壓缺氧。高原鼠兔與人類血紅蛋白A的氨基酸序列比對，在高原鼠兔β氨基酸序列鏈中檢測到23種變異，α111和β115處最重要的氨基酸殘基(在人類血紅蛋白中形成α1β1接觸)發(fā)生了改變。這表明α1β1界面的氫鍵可能受到破壞，導致配體結合的構象接觸改變，從而影響血紅蛋白與氧結合的能力[39]。

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是主要在腦中表達的第3類攜氧珠蛋白，參與氧代謝、為細胞供氧供能，可以直接或間接促進氧擴散進入線粒體，在微氧環(huán)境下，NGB可作為NADH氧化酶，在糖酵解過程中加速ATP生成，維持細胞正常功能[40]。NGB作為一種感受器，可以感知環(huán)境中氧氣的濃度變化，當環(huán)境中氧氣濃度降低時，相關的信號傳導通路會上調(diào)NGB的表達來避免缺氧損傷，從而使機體可以在不同的氧氣濃度下生存。組織對低氧的耐受性可通過內(nèi)源性保護因子NGB儲氧供氧來實現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)鼠兔大腦皮層中NGB表達相對較高，在睪丸和腎上腺中也發(fā)現(xiàn)NGB具有較高的表達，由此可以推測NGB在其他組織也可以表達[41]。通過克隆高原鼠兔NGB基因，發(fā)現(xiàn)NGB mRNA定位于高原鼠兔的神經(jīng)元，神經(jīng)元突觸之間發(fā)現(xiàn)大量的NGB表達，毛細血管周圍也有較多的NGB表達，表明在高原缺氧條件下NGB基因可能通過介導神經(jīng)信號的傳導來適應缺氧環(huán)境。

4 結語與展望

高原低氧適應是高原醫(yī)學研究的核心內(nèi)容，高原鼠兔長年生活在高海拔、高寒地區(qū)，形成了一系列復雜的代償機制，具有很強的低氧適應能力。研究人員對高原鼠兔的肺組織、心臟組織和血液中的血紅蛋白有了一定程度的認識，并取得了一系列成果，但對高原鼠兔低氧適應的研究仍處于發(fā)展階段。高原鼠兔全基因組測序工作至關重要，這對研究高原鼠兔低氧適應相關基因具有重要意義。今后，希望可以獲得高原鼠兔的全基因組數(shù)據(jù)或通過三代測序得到較為準確的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過對高原鼠兔低氧適應功能基因和信號通路的研究，尋找誘發(fā)高原病的靶基因，為高原病的預防和治療提供依據(jù)。