動物園梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及耐藥性

王煒強(qiáng) 孫浩云 楊志松*

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充，637000；2.山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，淄博，255000)

梅花鹿(Cervusnippon)是鹿科(Cervidae)鹿屬動物，具有14個亞種，是亞洲東部的特產(chǎn)種類之一，也分布于俄羅斯東部、日本和朝鮮，曾廣布中國各地，現(xiàn)僅殘存于吉林、內(nèi)蒙古中部、安徽南部、江西北部、浙江西部、四川、廣西等幾個有限的區(qū)域內(nèi)，因其夏毛棕黃色、遍布鮮明的白色梅花斑點(diǎn)，故稱“梅花鹿”[1-4]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)屬于條件致病菌，該菌主要包括3個亞種，主要存在于動物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，可引起禽類、哺乳動物、魚類等多種動物發(fā)病，為臨床中重要的人畜共患病之一[5-7]。近年來，關(guān)于野生動物感染肺炎克雷伯氏菌的報(bào)道逐漸增多，已從多種患病的動物體內(nèi)分離得到高致病性、高耐藥性肺炎克雷伯氏菌[8-9]。肺炎克雷伯氏菌主要引起梅花鹿的敗血性肺炎，2009年首次被報(bào)道。梅花鹿感染肺炎克雷伯氏菌后主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、逐漸消瘦，嚴(yán)重的可引起死亡，剖檢可見肺臟淤血、出血、水腫等，肝臟表面有小白色的壞死點(diǎn)[10-11]。肺炎克雷伯氏菌的治療臨床中主要以抗生素防治為主，由于不合理使用導(dǎo)致多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，不僅為養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)威脅公共衛(wèi)生安全[12]。本研究采集動物園患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織76份，進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌分離鑒定，對其致病性和耐藥性檢測，旨在為梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌防控及臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

2018—2020年，從南充西山動物園采集患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織76份。

1.1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂平板、肺炎克雷伯氏菌鑒別培養(yǎng)基——麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂(MIAC)，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Raid ID 32 E陰性菌鑒定試條購自bio-Merieuxsa公司；藥敏紙片購自廣東環(huán)凱生物有限公司；DL2000 marker，2×TaqMarker Mix，均購北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物

25 g左右昆明系小鼠，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織處理后，直接接種于MIAC平板，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑MIAC平板的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)鑒定。

1.2.2 生化試驗(yàn)

將分離菌株純化培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)整為0.5個麥?zhǔn)蠞岫?，按照Raid ID 32 E腸桿科陰性菌鑒定試條說明書對分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌的PCR鑒定

按照韓坤[6]的方法，設(shè)計(jì)肺炎克雷伯氏菌保守區(qū)16S rRNA引物：P1，5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；P2，5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′。該引物由華大基因合成。用水煮法提取分離菌株的DNA，用16S rRNA引物對疑似肺炎克雷伯氏菌的分離菌株進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行基因測序，其測序結(jié)果采用 NCBI-BLAST比對，同源性≥99.0%，可以定義到種的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定義到屬的水平；若同源性<97.0%，則定義為科水平，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97.0%判定。

1.2.4 致病試驗(yàn)

按照張文舉等[13]的方法，對培養(yǎng)至對數(shù)期的分離菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)，每株分離菌株采取腹腔注射方式注射5只小白鼠，劑量為0.25 mL(108cfu/mL)，對照組注射等量無菌的生理鹽水，攻毒12 h后，試驗(yàn)期為6 d，試驗(yàn)期間觀察小白鼠發(fā)病情況，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2019推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)，以及結(jié)果判斷、統(tǒng)計(jì)結(jié)果并分析分離菌株的耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似肺炎克雷伯氏菌分離菌株在鑒別培養(yǎng)基MIAC上長出了邊緣整齊、大小一致、半透明的桃紅色菌落。革蘭染色鏡檢觀察到，分離菌株為陰性的兩端鈍圓的粗短桿菌狀，與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)學(xué)基本一致。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

由表1可見，梅花鹿源肺炎分離菌株初步被鑒定為肺炎克雷伯氏菌，符合率在95%以上。

表1 梅花鹿源肺炎分離菌株的生化檢測結(jié)果

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定

對初步鑒定為肺炎克雷伯氏菌的52株分離菌株，用16S rRNA引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，52株肺炎克雷伯菌分離株均擴(kuò)增出大約為1 500 bp的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，從患病梅花鹿體內(nèi)分離的52株肺炎克雷伯氏菌與GenBank中登錄的12株肺炎克雷伯氏菌參考菌株的同源性為97.0%～99.0%，從而在分子生物學(xué)水平證實(shí)了從患病梅花鹿體內(nèi)分離的菌株為肺炎克雷伯氏菌。

圖1 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

2.4 致病性檢測

試驗(yàn)組攻毒的小白鼠在攻毒后2～6 d出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為采食量減少、精神沉郁、呼吸困難、慢慢出現(xiàn)死亡，個別的小鼠出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小白鼠，采集肺部、肝臟中分離得到的肺炎克雷伯菌，對照組的小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，40株肺炎克雷伯氏菌對小白鼠具有不同程度的致病性。

2.5 耐藥性分析

用K-B藥敏紙片法檢測致病性肺炎克雷伯氏菌耐藥性，由其耐藥性(表2)可知，40株致病性肺炎克雷伯氏菌對阿莫西林、氨芐西林、恩諾沙星、慶大霉素、新霉素、多西環(huán)素、大觀霉素、林可霉素、磺胺二甲氧嘧啶9種藥物耐藥性較高，耐藥率在70.0%～100.0%，對頭孢噻呋、頭孢喹肟、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考5種藥物耐藥率較低，耐藥率在7.5%～27.5%。這表明，分離的40株致病性肺炎克雷伯菌對臨床中常用抗生素產(chǎn)生了不同的耐藥性。

表2 分離菌株的耐藥性結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯氏菌可以引起多種動物和人發(fā)病，該菌主要存在不同宿主的呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，并引起感染，該菌也是人外科手術(shù)中常見的耐藥性菌之一，對人的危害也很大，是臨床中重要的人畜共患病之一[7-8]。在正常情況下，肺炎克雷伯氏菌不會引起動物發(fā)病，但當(dāng)外界環(huán)境條件改變，出現(xiàn)冷熱交替、換料及運(yùn)輸?shù)纫蛩貙?dǎo)致其機(jī)體抵抗力低下時(shí)，該菌在宿主的體內(nèi)大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性感染，其感染率和病死率均較高[14-15]。

相關(guān)研究表明，水貂(Neovisonvison)、狐貍(Vulpexlagopus)、梅花鹿等多種動物感染肺炎克雷伯菌后，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難，急性感染可以造成鼻孔、嘴角出血，嚴(yán)重可以導(dǎo)致其死亡，同時(shí)還可以繼發(fā)大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)或巴氏桿菌(Pasteurella)等多種病原感染，呈現(xiàn)混合感染的狀態(tài)，對動物的危害較大，尤其對水貂、狐貍、貉(Nyctereutesprocyonoides)等動物養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-11]。本試驗(yàn)從76份采集自動物園患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織中分離得到了40株致病性肺炎克雷伯菌，證明該菌是引起梅花鹿肺炎的主要病原菌，其可能存在潛在威脅，應(yīng)該引起重視，并注意做好防控。

肺炎克雷伯氏菌對臨床中常用的抗生素藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，個別的分離菌株對β-內(nèi)酰胺類及碳青霉烯類抗生素也產(chǎn)生耐藥性，給治療帶來了很大的困難，應(yīng)該引起重視[12-15]。國內(nèi)對狐貍、水貂、豬、牛等動物源肺炎克雷伯氏菌的耐藥性報(bào)道比較多，關(guān)于梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的耐藥性報(bào)道較少。本研究表明，分離的40株致病性肺炎克雷伯菌對阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素等9種藥物耐藥率在70.0%以上，對其他藥物的耐藥率在7.5%～27.5%。說明從動物園梅花鹿體內(nèi)分離的肺炎克雷伯氏菌耐藥性嚴(yán)重。當(dāng)發(fā)生本病時(shí)，應(yīng)該合理用藥，提高治療效果。由于該菌是通過呼吸道進(jìn)入肺部，引起肺部實(shí)變和肺炎，在防治過程中應(yīng)進(jìn)行環(huán)境消毒，綜合防控，減少該病的發(fā)生與流行。