小熊貓源大腸桿菌的藥敏特性及致病性

李運莉 張東升 侯 蓉 岳嬋娟 蘇小艷 燕 霞 李 林 楊奎興 彭 西 劉頌蕊*

(1.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學(xué)重點實驗室，成都，610081；2.成都大學(xué)藥學(xué)院，成都，610106)

小熊貓(Ailurusfulgens)，別稱紅熊貓、紅貓熊、九節(jié)狼、金狗，屬哺乳綱(Mammalia)食肉目(Carnivora)，分布在中國、尼泊爾、不丹以及緬甸北部等地，主要棲息在海拔2 000～3 800 m的針闊混交林或有竹叢分布的常綠闊葉林中[1]，是喜馬拉雅—橫斷山脈所特有的珍稀動物。在過去的半個世紀(jì)內(nèi)，由于森林采伐、棲息地喪失及片段化、捕獵和其他人類活動的影響，我國小熊貓分布區(qū)逐漸向高山峽谷退縮，面積也大幅縮減，整個種群數(shù)量下降比例高達40%[2]。目前，小熊貓已被列為國家二級保護動物，我國已建立多個自然保護區(qū)，為小熊貓種群以及棲息地的保護提供了有效保障。

在小熊貓飼養(yǎng)和保護工作中，疾病防治是影響種群數(shù)量及健康的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而細菌感染是危害小熊貓種群健康的重要因素。大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種常見的存在于動物消化道內(nèi)的條件致病菌，致病性大腸桿菌一旦感染宿主后，會在其體內(nèi)快速繁殖，并產(chǎn)生一定量的特殊毒力因子，引起各種病癥，包括胃腸道[3]、肺炎[4]、泌尿系統(tǒng)[5]、血液[6]以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病[7]，給畜禽業(yè)、特種經(jīng)濟養(yǎng)殖動物帶來巨大的經(jīng)濟損失，也對野生動物群體的生命健康構(gòu)成威脅。據(jù)現(xiàn)有文獻報道，野生動物中常常發(fā)現(xiàn)大腸桿菌感染的情況[8]。郭定宗等[9]在1例病死金絲猴(Rhinopithecussp.)的死因研究中發(fā)現(xiàn)，該金絲猴是死于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和大腸桿菌混合感染導(dǎo)致的敗血癥。范光麗等[10]在對幼齡朱鹮(Nipponianippon)感染大腸桿菌死亡的研究中認為，幼齡朱鹮更易感染源自臭蛋爆裂污染及排泄物中的大腸桿菌。梅妹等[11]在2005年從134份腹瀉梅花鹿(Cervusnippon)的糞便中分離鑒定得到127株大腸桿菌，所得菌株呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。生長在臥龍大熊貓研究中心、雅安碧峰峽野生動物園的國寶大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)也常在9—11月大腸桿菌病流行期感染該菌[12]。

本研究針對小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌MT820501進行耐藥分析，并以小鼠為受試生物，驗證其致病性及損傷特征，為該類大腸桿菌病的診斷和臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，并為小熊貓細菌病的防治補充資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2017年11月21日分離自成都大熊貓繁育研究基地的1例死亡小熊貓腎臟中的致腎盂腎炎大腸桿菌(MT820501)。

1.2 實驗動物

SPF級小鼠，共48只，體重18～22 g，雌雄各半，購買于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.3 菌種復(fù)蘇

將前期保存的菌種逐步恢復(fù)到室溫，于無菌環(huán)境中吸取50～100 μL接種到腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟傳代2～3次，獲得生長活力良好的菌液。

1.4 藥敏試驗

用無菌生理鹽水將菌液稀釋至0.5個麥?zhǔn)蠞舛?，取適量菌液到MH瓊脂培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)表面，涂布均勻后貼好藥敏紙片(購自英國Oxoid公司及杭州微生物試劑有限公司)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)一定時間后取出，觀察結(jié)果并測量抑菌圈的直徑(培養(yǎng)時間參照CLSI M100 2018標(biāo)準(zhǔn)，測量結(jié)果以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo))，抑菌圈的邊緣以肉眼看不到細菌明顯生長為限，以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.5 小鼠致病性試驗

將小鼠隨機分為6組，每組8只，腹腔注射系列濃度菌液0.5 mL/只，濃度分別為 1.20×109、4.32×108、1.55×108、5.59×107、2.01×107cfu/mL，對照組注射等量滅菌生理鹽水。攻毒后，各組分籠飼養(yǎng)(溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%)，連續(xù)7 d觀察記錄各組小鼠的食欲、精神狀況等臨床表現(xiàn)，并記錄各組小鼠的發(fā)病和死亡情況，計算其半數(shù)致死量。對死亡小鼠剖檢，觀察記錄病理變化，采集各組織臟器，進行病原菌的分離；另外采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸道等組織，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度為5 μm)，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

由表1可見：小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌MT820501對青霉素類藥物(哌拉西林)、頭孢菌素類藥物(頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢吡肟)、非經(jīng)典β-內(nèi)酰胺類藥物(美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐青霉素-舒巴坦)、氨基糖苷類藥物(卡那霉素、丁胺卡那、新霉素)、四環(huán)素類藥物(米諾環(huán)素)、喹諾酮類藥物(左氧氟沙星)、硝基呋喃類藥物(呋喃唑酮)、多肽類藥物(多黏菌素B)敏感，對其余抗生素耐藥。

表1 小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌MT820501的耐藥表型

2.2 小鼠致病性

攻毒后6 h，高劑量組小鼠活動變得緩慢，活力下降，震顫，畏寒，喜扎堆；攻毒12 h后，開始有小鼠發(fā)病死亡。按照改良寇氏法計算其半數(shù)致死量[13]，其LD50為8.42×107cfu/mL。從死亡小鼠的心臟、肝臟、肺臟、腎臟等組織中均能分離出生長形態(tài)一致的菌落，與小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌的形態(tài)特點相同。分離菌株經(jīng)革蘭氏染色后表現(xiàn)為革蘭氏陰性短桿菌(圖1)。分離菌株16S rDNA基因PCR擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 500 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)。將測序所得序列于GenBank中進行BLAST序列比對，結(jié)果顯示，分離菌株與小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌(MT820501)的序列相似度為100%。

圖1 小鼠體內(nèi)分離菌株革蘭氏染色

圖2 死亡小鼠不同組織內(nèi)分離菌株的16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果

攻毒組死亡小鼠口鼻、腳趾發(fā)黑，眼角有黃色分泌物，肛周有黃褐色稀薄糞便污染。與對照組比較，剖檢后的攻毒組死亡小鼠實質(zhì)臟器顏色呈暗紅色，表面伴有不同大小的充血出血斑塊，腸段透明稀薄。病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示：心肌間質(zhì)水腫增寬，組織中小靜脈血管、毛細血管擴張，充滿紅細胞，散在中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，可見藍色細菌團塊(圖3A)；肝細胞腫大，部分肝細胞脂肪變性，肝臟組織內(nèi)見有大小不等的壞死灶，散見有數(shù)量不等的淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，部分肝竇中可見藍色細菌團塊(圖3B)；脾臟白髓區(qū)淋巴濾泡生發(fā)中心擴大，細胞碎片增多；紅髓區(qū)充血出血，有少量中性粒細胞浸潤，淋巴細胞相對減少(圖3C)；肺泡壁增厚，毛細血管擴張，充滿紅細胞，肺泡壁有炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)偶見漏出的紅細胞及脫落的肺泡上皮細胞，支氣管上的假復(fù)層柱狀纖毛上皮細胞少量脫落，腔內(nèi)有少量纖維素型漿液(圖3D)；腎小球體積腫大、充血，腎小管上皮細胞廣泛性腫大及顆粒變性，部分細胞壞死，細胞核染色較深且發(fā)生固縮，與基底膜細胞分離，嚴(yán)重時整個腎小管壞死，腎間質(zhì)血管擴張充血，部分管腔內(nèi)見細菌栓子，髓質(zhì)區(qū)集合管間質(zhì)充血，上皮細胞腫大、顆粒變性，散在細胞壞死現(xiàn)象(圖3E)；胃無明顯病理損傷(圖3F)；整個腸段表現(xiàn)為腸絨毛脫落，部分固有層毛細血管擴張，充滿紅細胞，并伴有數(shù)量不等的炎性細胞浸潤(圖3G、H)。

圖3 攻毒組小鼠病理組織損傷觀察

3 討論

通過對小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌MT820501的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對極少數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物、四環(huán)素類藥物、喹諾酮類藥物、多肽類藥物及氨基糖苷類藥物敏感，對大部分藥物耐藥。劉青等[14]在對107份圈養(yǎng)野生動物源大腸桿菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，雜食動物源大腸桿菌中有90%以上的菌株對氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物敏感，70%以上的菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感。而本研究顯示，同樣作為雜食動物的小熊貓，體內(nèi)分離的大腸桿菌對氨芐西林、羧芐西林、頭孢哌酮、慶大霉素等出現(xiàn)一定的耐藥性，與獸醫(yī)在小熊貓死亡前使用舒普深和慶大霉素治療無效的情況吻合。大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生與抗生素種類、抗生素使用頻率、使用劑量等密切相關(guān)。李州[8]對福州動物園內(nèi)的動物源大腸桿菌耐藥性研究顯示，有48株表現(xiàn)為三重以上的耐藥菌株，占比64.86%；東北虎林園內(nèi)虎源大腸桿菌對常用抗生素氨芐西林耐藥率達100%，對四環(huán)素、復(fù)方新諾明等藥物也表現(xiàn)出高度的耐藥性[15]。據(jù)文獻報道，多種圈養(yǎng)野生動物如大熊貓[16]、東北虎(Pantheratigrisaltaica)[17]、鶴類[18]等出現(xiàn)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌菌株。隨著野生動物體內(nèi)耐藥菌株不斷發(fā)現(xiàn)，給臨床的疾病治療及用藥帶來極大的挑戰(zhàn)。因此，臨床建議避免長期使用相同的抗生素或使用較為先進的抗生素，可通過藥敏試驗及時篩選敏感藥物控制病情，同時長期監(jiān)測動物體內(nèi)常見菌的耐藥性情況，合理使用抗生素，減少耐藥性的產(chǎn)生。

本研究小鼠人工感染菌株后顯示，該菌株對小鼠有一定的致病性，其半數(shù)致死量為8.42×107cfu/mL。從感染小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中，均分離到與前期從死亡小熊貓體內(nèi)分離菌株一致的菌落。通過對死亡小鼠的病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，其心臟、肝臟和腎臟內(nèi)均能發(fā)現(xiàn)染成藍色的細菌團塊，多個實質(zhì)臟器出現(xiàn)水腫、充血、細胞變性甚至壞死、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。這些病變是細菌性敗血癥的典型特征[19]，與高新蕾等[20]在對小鼠感染致腎盂腎炎大腸桿菌的組織病理學(xué)表現(xiàn)一致，也與死亡小熊貓腎臟、肝臟和肺臟均出現(xiàn)充血、實質(zhì)細胞變性壞死及中性粒細胞浸潤等病理現(xiàn)象高度相似[21]。其中，腎臟皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)都觀察到腎小管上皮細胞廣泛性腫大及顆粒變性，部分腎小管上皮細胞甚至整個腎小管壞死，表明該菌株對腎臟的毒性較大，可能與該菌株的P菌毛、Ⅰ型菌毛占比較高密切相關(guān)，這2種毒力因子可介導(dǎo)菌株在腎臟的定植，增加其對腎臟的致病性[21-22]。

與之前死亡小熊貓病理表現(xiàn)不同的是，小鼠的各腸段均發(fā)生了腸絨毛上皮脫落，固有層毛細血管擴張，充滿紅細胞的病變。推測小鼠與小熊貓細菌感染出現(xiàn)病理表現(xiàn)差異的主要原因有3個：(1)二者屬于不同種屬，具有較大種屬差異，不同動物的遺傳特性和生物學(xué)特性不同，對大腸桿菌的清除率和易感性存在差異，感染時會有不同表現(xiàn)[23]。(2)實驗小鼠的微生物、寄生蟲等級情況明晰，且培養(yǎng)環(huán)境條件有一定的控制，和小熊貓的生活環(huán)境條件有較大差異，二者接觸病原種類不同，免疫系統(tǒng)功能也不同，病原致病特性表現(xiàn)也會有所差異[24]。(3)小鼠細菌感染試驗時采用腹腔注射細菌，更容易通過全身的血液循環(huán)導(dǎo)致多器官出現(xiàn)病理損傷，而致腎盂腎炎大腸桿菌為尿路感染的主要細菌，一旦上行至上尿道，臨床的病理表現(xiàn)包括腎盂腎炎、膀胱炎和尿道炎[22]。死亡小熊貓的主要病理損傷表現(xiàn)為腎盂腎炎[21]，因此，小熊貓自然感染致腎盂腎炎大腸桿菌的可能路徑為通過尿道上行感染而誘發(fā)機體出現(xiàn)炎癥特征，不同感染途徑也可能使得二者的病理表現(xiàn)出現(xiàn)差異。

4 結(jié)論

本研究通過對前期課題組分離的小熊貓源致腎盂腎炎大腸桿菌MT820501進行藥敏試驗及小鼠感染實驗，證明該菌株對臨床上常使用的氨芐西林、頭孢哌酮、慶大霉素等藥物產(chǎn)生一定的耐藥性。動物感染實驗顯示該菌株有一定的致病性，建議臨床上使用哌拉西林、頭孢西丁、美羅培南等敏感藥物進行此類細菌病的防治。另外，注意長期監(jiān)測圈養(yǎng)動物體內(nèi)常見菌的耐藥性情況，避免長期使用相同抗生素、較新抗生素，以減少耐藥性的產(chǎn)生。