高功率脈沖微波協(xié)同大豆異黃酮對牛初乳滅菌效果的研究

許 壯，戴意強(qiáng)，張莉莉，龔 蘭，印伯星，王 英，王 冉，夏秀東*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室,江蘇 南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；4.揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚州 225001）

牛初乳被譽(yù)為“大自然真正的白金食品”，是健康奶牛分娩72 h內(nèi)產(chǎn)的第1批牛奶。牛初乳中含有超過250種功能活性成分和營養(yǎng)素，其與常乳相比，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、免疫球蛋白和具有抗菌活性的肽等［1-3］。IgG是牛初乳中主要的免疫球蛋白，占總免疫球蛋白的80%～90%［4］，其不僅能為人體提供被動免疫，還能調(diào)節(jié)適應(yīng)性和先天性免疫系統(tǒng)［5］，因此牛初乳中的IgG含量被認(rèn)為是牛初乳的品質(zhì)標(biāo)志。歐盟認(rèn)為初乳補(bǔ)充劑對人體健康有多種益處［6］，初乳能增強(qiáng)人體免疫力和保護(hù)胃腸道健康，可能對兒童和成人的各種疾病的治療有一定價值等［7-8］。

牛初乳中富含的營養(yǎng)物質(zhì)為微生物生長創(chuàng)造了適宜的生長條件。奶牛的生長環(huán)境、體表狀況以及擠奶過程中的不規(guī)范操作，都易造成初乳污染。剛采集的牛初乳中微生物種類繁多且數(shù)量大，并在儲存期間迅速生長和繁殖，對初乳產(chǎn)品造成潛在的污染風(fēng)險［9］。因此，控制牛初乳中的微生物數(shù)量對牛初乳產(chǎn)品的質(zhì)量和牛初乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都極為重要。由于牛初乳中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白和生長因子等功效成分對溫度非常敏感，傳統(tǒng)的巴氏殺菌和高溫滅菌方式可能會使這些活性物質(zhì)的活性降低或喪失［10-11］。

高功率脈沖微波（High power pulse microwave，HPPM）殺菌技術(shù)是一種新興的非熱加工技術(shù)，其基本原理是使用相對論電子束產(chǎn)生高功率脈沖波，并通過微波傳輸系統(tǒng)和諧振腔體作用到物料上［12-14］，具有瞬時高能和間歇作用的特點［15］，該項技術(shù)已被證實可通過非熱效應(yīng)達(dá)到殺菌保鮮的作用［16］。

大豆生長過程中會形成一種次級代謝產(chǎn)物，即大豆異黃酮（SI），其具有多種生物活性，如預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗乳腺癌和抗氧化等［17-19］。同時，有研究表明大豆異黃酮具有較好的抑菌活性［20］。

本研究以牛初乳為原料，通過高功率脈沖微波殺菌技術(shù)協(xié)同添加大豆異黃酮，在盡可能保留IgG含量的基礎(chǔ)上，殺滅牛初乳中的微生物或抑制其生長，提高牛初乳的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳由揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司提供，大豆異黃酮（含40%有效成分）購自上海麥克林生化科技有限公司，PCA培養(yǎng)基購自北京奧博生物技術(shù)有限公司，牛IgG酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

DSX-18L-1手提式高壓蒸汽滅菌器（由上海子期實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；DKZ-2B電熱恒溫振蕩水槽（由上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；5420 小型離心機(jī)（由Eppendorf中國有限公司生產(chǎn)）；DW-HL678超低溫冰箱（由中科美菱低溫科技公司生產(chǎn)）；IS412C恒溫培養(yǎng)箱（由浚和（上海）儀器科技有限公司生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀TG600（由云鉑儀器（成都）有限公司生產(chǎn)）；ZX 3渦旋儀（由意大利VELP公司生產(chǎn)）；高功率脈沖微波設(shè)備（由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程創(chuàng)新團(tuán)隊與南京翀電科技有限公司聯(lián)合研制）。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPPM處理 將牛初乳平均分裝在若干個無菌離心管中，設(shè)置牛初乳殺菌初始溫度4 ℃，瞬時輸出功率400 kW，輸出脈沖寬度5 μs，占空比1∶1000，研究不同殺菌時間（0、2、4、6、8、10 min）對牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的影響。

1.3.2 SI處理 將牛初乳平均分裝在若干個無菌離心管中，分別向其中加入0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%的大豆異黃酮，充分混勻后，測定牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率。

1.3.3 HPPM結(jié)合SI處理 設(shè)置高功率脈沖微波的瞬時輸出功率為400 kW，輸出脈沖寬度為5 μs，占空比1∶1000，殺菌時間為6 min，牛初乳殺菌初始溫度為4 ℃，大豆異黃酮添加量為0.4%。以未處理、僅HPPM處理和僅SI處理的牛初乳為對照，研究不同處理條件下牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的變化。

1.3.4 牛初乳中微生物數(shù)量的測定 參照夏秀東等［21］的試驗方法，用0.85%的生理鹽水對樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1 mL的稀釋液均勻涂抹在PCA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1～2 d，記錄菌落總數(shù)。

1.3.5 牛初乳中IgG保留率的測定 牛初乳用pH值為7.2的PBS溶液稀釋20倍，其IgG含量的測定參照產(chǎn)品使用說明書，簡要操作步驟如下：標(biāo)準(zhǔn)品按要求稀釋；將待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品按要求進(jìn)行加樣；37 ℃溫育30 min后洗板；甩干加酶標(biāo)試劑，重復(fù)溫育洗板操作；加入顯色液后避光在37 ℃條件下溫育10 min，加入終止液后在15 min內(nèi)測定。IgG保留率的計算公式為：

式（1）中：Rn為不同添加量SI牛初乳中IgG含量，R0為對照組IgG含量，RR為IgG保留率。

1.3.6 牛初乳中微生物生長動力學(xué)分析 向無菌錐形瓶中準(zhǔn)確量取定量牛初乳，SI（0.4%）和HPPM（6 min）組合處理牛初乳，混合均勻，將樣品分別置于37、25、4 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，研究僅HPPM處理及HPPM和SI聯(lián)合處理后牛初乳中微生物的生長變化。參考Gompertz方程［22］稍作修改，對微生物生長動態(tài)進(jìn)行描述，本文應(yīng)用的方程為：

式（2）中，N(t)為t時的菌數(shù)，N0為初始菌數(shù)，Nmax為最大菌數(shù)，μmax為微生物生長的最大比生長速率，lag為微生物生長的延滯時間。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗結(jié)果經(jīng)過3次重復(fù)測定得到，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。不同處理之間的顯著性差異采用單因素方差分析ANOVA和Duncan多重比較（P＜0.05）。分別應(yīng)用SPSS 22.0軟件和Origin 2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPPM殺菌處理時間對牛初乳中微生物數(shù)量及IgG保留率的影響

為確定最佳的HPPM處理時間，研究了不同HPPM殺菌時間對牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的影響。由圖1可知，HPPM處理10 min，牛初乳中的微生物數(shù)量從5.04 log CFU/mL減少到2.57 log CFU/mL；隨著殺菌時間的延長，牛初乳中IgG保留率降低；處理2～6 min內(nèi)，IgG保留率維持在93.5%左右，而當(dāng)處理時間達(dá)到8 min以上時，IgG保留率進(jìn)一步下降到91.7%。為保證殺菌效果且在最大程度上提高牛初乳中的IgG保留率，設(shè)定高功率脈沖微波的殺菌時間為6 min。

圖1 高功率脈沖微波不同殺菌時間對牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的影響

2.2 SI添加量對牛初乳中IgG保留率及微生物數(shù)量的影響

為確定SI的最佳添加量，研究了不同SI添加量對牛初乳中的微生物數(shù)量和IgG保留率的影響。由圖2可知，0.1%～0.2%的SI添加量可將牛初乳中微生物數(shù)量減少約70%；0.4%～0.8%的SI添加量可將牛初乳中微生物數(shù)量減少88%；當(dāng)SI添加量增加到1.0%時，牛初乳中微生物數(shù)量減少了約92%。同時，隨著SI添加量的增加，牛初乳中IgG保留率也逐漸降低。當(dāng)SI添加量低于0.4%時，牛初乳中IgG保留率保持在90%以上，而隨著SI添加量的進(jìn)一步增加，牛初乳中IgG保留率降低到90%以下。當(dāng)SI添加量為1%時，牛初乳中IgG保留率僅為74.4%。綜上，為有效抑制牛初乳中微生物，同時減少對牛初乳中IgG含量的影響，設(shè)定最適的SI添加量為0.4%。

圖2 不同大豆異黃酮添加量對牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的影響

2.3 HPPM協(xié)同SI對牛初乳微生物數(shù)量和IgG保留率影響

由圖3可知，HPPM結(jié)合SI處理比單獨應(yīng)用HPPM或SI處理具有更好的殺菌效果。在SI添加量為0.4%、HPPM處理6 min的條件下，牛初乳中的微生物數(shù)量由5.04 log CFU/mL減少到2.01 log CFU/mL，相 比CK組 降 低 了3.03 log CFU/mL。同時，IgG保留率仍然保持在90%以上。

圖3 不同殺菌處理方式對牛初乳中微生物數(shù)量和IgG保留率的影響

2.4 HPPM協(xié)同SI處理牛初乳中殘留微生物的生長動力學(xué)分析

2.4.1 微生物菌落計數(shù)分析 牛初乳中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物在牛初乳中極易快速生長，易產(chǎn)生生物安全風(fēng)險。因此，分析滅菌后牛初乳中殘留微生物的生長狀況對于指導(dǎo)牛初乳加工和運輸非常重要。如圖4所示，僅HPPM處理和經(jīng)HPPM協(xié)同SI處理的牛初乳中的微生物生長動態(tài)用修正的Gompertz方程描述。牛初乳中微生物生長呈現(xiàn)典型的S形曲線，且擬合所得的相關(guān)系數(shù)R2均較高（表1）。僅HPPM處理和經(jīng)HPPM結(jié)合SI處理后的牛初乳中的微生物在25 ℃和37 ℃條件下，經(jīng)過一段延滯期后迅速增長，并于16 h內(nèi)達(dá)到平臺期。同時，對殘留微生物在4 ℃條件下的生長狀況進(jìn)行了分析（圖4），發(fā)現(xiàn)僅經(jīng)過HPPM處理的牛初乳中的微生物呈現(xiàn)持續(xù)緩慢增長的趨勢，而HPPM協(xié)同SI處理后的牛初乳中的微生物呈現(xiàn)出前4 h進(jìn)一步減少，此后再緩慢增長的趨勢。

圖4 不同溫度和殺菌處理下牛初乳中微生物的生長曲線

2.4.2 牛初乳中微生物的生長動力學(xué)參數(shù)分析 為進(jìn)一步分析HPPM協(xié)同SI處理后牛初乳中的微生物生長狀況，對25 ℃和37 ℃條件下微生物生長動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析（表1）。與僅經(jīng)過HPPM處理的牛初乳中微生物生長相比，HPPM結(jié)合SI處理后的牛初乳不僅微生物數(shù)量進(jìn)一步減少，而且微生物的延滯期進(jìn)一步延長，生長速率和最大菌落數(shù)均顯著降低。在37 ℃條件下，僅經(jīng)過HPPM處理的牛初乳中微生物的生長延滯期為0.50 h，最大比生長速率為0.8752 h-1，最大菌落數(shù)為8.61 log CFU/mL；而HPPM協(xié)同SI處理后的牛初乳中微生物生長延滯期則延長至3.21 h，最大比生長速率降低到0.3399 h-1，最大菌落數(shù)僅為7.26 log CFU/mL。在25℃條件下，僅經(jīng)過HPPM處理的牛初乳中微生物生長延滯期為1.90 h，最大比生長速率為0.9214 h-1，最大菌落數(shù)為8.58 log CFU/mL；而HPPM協(xié)同SI處理后的牛初乳中微生物生長延滯期則延長至3.85 h，最大比生長速率降低到0.4818 h-1，最大菌落數(shù)僅為7.22 log CFU/mL。以上結(jié)果說明，添加大豆異黃酮不僅進(jìn)一步減少了經(jīng)HPPM處理牛初乳中的微生物數(shù)量，而且進(jìn)一步抑制了殘留微生物的生長。

表1 微生物生長動力學(xué)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

牛初乳含有豐富的營養(yǎng)成分和免疫球蛋白、乳鐵蛋白等活性成分，已被用于多種食品和膳食補(bǔ)充劑中。然而，受奶牛生長環(huán)境、擠奶設(shè)備、儲存器具等因素的影響，牛初乳中含有大量的微生物。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致牛初乳污染的微生物包括副結(jié)核、支原體屬、大腸桿菌和沙門氏菌屬、葡萄球菌等［23-25］。這些病原體通常起源于乳腺，在擠奶期間污染牛初乳，并在儲存期間生長，會對產(chǎn)品造成潛在生物安全風(fēng)險［9,26］。目前對牛初乳中微生物殺菌主要為膜分離滅菌、高壓電場、加熱殺菌3種方式。徐思思［27］研究表明，膜分離殺菌可以有效截留牛初乳中的細(xì)菌和體細(xì)胞，保持初乳原有的風(fēng)味，但I(xiàn)gG保留率隨著進(jìn)料速率的增加呈先上升后急劇下降的趨勢，IgG損失率超過15%；Elfstrand［28］和Stabel［29］等人的研究表明，盡管巴氏瞬時殺菌（HTST）可以殺滅牛初乳中大多數(shù)病原體，但牛初乳的品質(zhì)也顯著降低，特別是牛初乳中的IgG含量降低了約25%。此外，在巴氏殺菌過程中或之后，顯著增加了流體的黏度，影響了牛初乳的產(chǎn)品品質(zhì)。因此采用合理的殺菌技術(shù)對于牛初乳的質(zhì)量尤為重要。高功率脈沖（HPP）殺菌是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)［30-31］，已被證實是一種效果較好的非熱殺菌技術(shù)。賈健輝等［32］研究發(fā)現(xiàn)，利用高功率脈沖電場對牛初乳進(jìn)行殺菌處理，具有一定的殺菌效果，且殺菌率與電場強(qiáng)度呈正相關(guān)，但缺乏對牛初乳中IgG含量的分析。本研究利用HPPM處理牛初乳，當(dāng)HPPM瞬時輸出功率400 kW，輸出脈沖寬度5 μs，占空比1∶1000，處理10 min以內(nèi)時，隨著處理時間的延長，殺菌效果也隨之增強(qiáng)，IgG保留率可維持在90%以上。

一些植物的提取物已被證實可以作為天然的抑菌劑，如大豆、花椒、大蒜、甘草、連翹等的提取物已被報道具有抑菌活性［33-34］。大豆異黃酮是大豆生長過程中產(chǎn)生的重要次級代謝物，大量研究證明大豆異黃酮具有廣譜抑菌效果［35-36］。Yin等［37］研究發(fā)現(xiàn)1.8 mg/mL的大豆異黃酮對P. aeruginosaPAO1和C. violaceum026具有良好的抑菌效果。Dhayakaran等［38］研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮對單增李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌具有抗菌和抑制生物膜生成的作用。王海濤等［35］的研究表明，大豆異黃酮對真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，大豆異黃酮的抑菌作用隨其濃度升高而增強(qiáng)。本文研究了大豆異黃酮不同添加量對牛初乳中微生物抑制的影響。結(jié)果表明，隨著大豆異黃酮添加量的增加，滅菌效果逐漸增強(qiáng)。

天然抑菌物質(zhì)與物理滅菌的聯(lián)合使用已被證明是一種有效的滅菌方式，Wang等［39］研究表明：柚皮素與脈沖電場協(xié)同處理對果汁中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅活存在增效作用，且柚皮素濃度越高、場強(qiáng)越大其協(xié)同效應(yīng)越明顯。本研究采用HPPM協(xié)同SI對牛初乳進(jìn)行處理，結(jié)果表明：HPPM協(xié)同SI可明顯增強(qiáng)對牛初乳中微生物的殺滅效果，且SI添加量4%、HPPM處理時間6 min條件下牛初乳中微生物數(shù)量由5.04 log CFU/mL減少到2.01 log CFU/mL，且IgG保留率仍超過90%，證明了HPPM協(xié)同SI可對牛初乳進(jìn)行滅菌，且對牛初乳中IgG的影響較小。進(jìn)一步的生長動力學(xué)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，添加大豆異黃酮的牛初乳與未添加大豆異黃酮的牛初乳相比，不僅微生物數(shù)量進(jìn)一步減少，而且殘留微生物延滯期進(jìn)一步延長，最大比生長速率、最大菌落數(shù)均顯著降低，說明大豆異黃酮不僅有滅菌作用，而且還可抑制殘留微生物的生長。

本文研究了高功率脈沖微波協(xié)同大豆異黃酮對牛初乳的滅菌效果和對牛初乳中IgG含量的影響，試驗結(jié)果表明：隨著HPPM殺菌時間延長和SI添加量的增加，牛初乳中的微生物含量顯著減少，當(dāng)HPPM殺菌時間為6 min、SI添加量為0.4%時，牛初乳中微生物數(shù)量由5.04 log CFU/mL降至2.01 log CFU/mL，且IgG保留率為91.6%。高功率脈沖微波協(xié)同大豆異黃酮殺菌技術(shù)為牛初乳滅菌提供了新的方向，也為天然抑菌物質(zhì)與物理滅菌的聯(lián)合使用提供了參考。