MiR-218-5p通過靶向抑制TDP1表達(dá)促進(jìn)魚藤酮誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡

王園園，呂小紅

0 引言

微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）是一種短的內(nèi)源性非編碼RNA，通過介導(dǎo)翻譯抑制或mRNA降解來(lái)調(diào)控基因表達(dá)[1]。以miRNAs作為標(biāo)志物在癌癥研究和治療中發(fā)揮重要的作用，關(guān)于癌癥miRNAs標(biāo)志物挖掘的研究工作也為癌癥治療提供了寶貴的資源[2]。胃癌是常見惡性腫瘤之一，其臨床治療方法需不斷突破，臨床療效也有待提高[3]。由于缺少合適的生物標(biāo)志物，大多數(shù)胃癌患者被診斷時(shí)已為晚期。miRNAs可以作為胃癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤預(yù)后有關(guān)，具有成為胃癌新治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值[5]。miR-218-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的抑制作用，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明，因此，探究miR-218在胃癌中的靶基因及其機(jī)制，對(duì)于胃癌的治療研究具有重大意義。酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1（tyrosyl DNA phosphodiesterase 1,TDP1）是細(xì)胞核和線粒體DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵因子，在癌癥中呈高表達(dá)水平，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮驅(qū)動(dòng)作用[6-8]。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-218-5p與TDP1存在靶向調(diào)控關(guān)系，因此，推測(cè)miR-218-5p可能通過靶向TDP1調(diào)控胃癌細(xì)胞線粒體DNA損傷修復(fù)過程，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)展，故本文對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，旨在了解miR-218-5p在胃癌中的作用機(jī)制，以期為胃癌有效治療新策略的研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供；胃癌細(xì)胞系SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：miR-218-5p模擬物（mimic）和其陰性對(duì)照（negative control,NC）由上海吉瑪基因生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；胎牛血清、魚藤酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol、Lipofectamine 2000TM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PVDF膜、化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；兔抗TDP1、Bax、Bcl-2、Cyt-c多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。主要儀器：倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的GES-1、SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823細(xì)胞，復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待80%細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行傳代處理。

1.3 RT-PCR檢測(cè)miR-218-5p和TDP1表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，TRIzol試劑盒提取各細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃變性10 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，共39個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-218-5p-F：5’-ATGTAGCGTGC GACCGTGGAC-3’，miR-218-5p-R：5’-CAGGCTGACGCACTCTGTGCT-3’；TDP1-F：5’-TCTTCCAGTTCTTAGCCTCCTCTGC-3’，TDP1-R：5’-TGGCCTGGATCTCACTCTGGAGGC-3’；U6-F：5’-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3’，U6-R：5’-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3’；GAPDH-F：5’-CCACTCCTCCACCTTTG-3’，GAPDH-R：5’-CACCACCCTGTTGCTGT-3’。采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-218-5p與TDP1的靶向關(guān)系

根據(jù)網(wǎng)站TargetScan（www.targetscan.org）預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-218-5p與TDP1之間存在靶向關(guān)系，進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證該關(guān)系，具體實(shí)驗(yàn)過程如下：根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-218-5p與TDP1的結(jié)合片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并插入至熒光素酶載體中，構(gòu)建TDP1野生質(zhì)粒。采用基因突變技術(shù)將結(jié)合片段進(jìn)行突變處理，構(gòu)建TDP1突變質(zhì)粒。將miR-218-5p-mimic、miR-218-5p-NC和野生質(zhì)粒或突變質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000TM混合后，共轉(zhuǎn)染至篩選的胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 構(gòu)建TDP1過表達(dá)載體

根據(jù)TDP1基因序列設(shè)計(jì)合成含GFP的TDP1過表達(dá)慢病毒載體（Lv-TDP1）和陰性對(duì)照空載體（Lv-NC），由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，病毒滴度為1×108TU/ml。

1.6 細(xì)胞損傷模型構(gòu)建及分組

采用含有終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μmol/L魚藤酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞24 h，并對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，篩選出魚藤酮誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞損傷的最佳干預(yù)濃度為1.0 μmol/L。將消化處理后的細(xì)胞分為對(duì)照組、損傷組、miR-218-5p-NC組、miR-218-5p-mimic組、Lv-NC組、Lv-TDP1組和miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組，除對(duì)照組不作處理外，其他組細(xì)胞均采用1 μmol/L魚藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

消化處理各組細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，收集至流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)專用管中。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μl含10%胎牛血清的PBS溶液重懸細(xì)胞沉淀，再加入700 μl無(wú)水乙醇，-20℃固定24 h。3 000 r/min離心30 s，棄上清液，1 ml PBS洗滌2次。加入400 μl PI（50 μg/ml）避光染核10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期占比。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PBS洗滌貼壁細(xì)胞，消化處理后收集至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重懸。取1×105個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，1 ml PBS懸浮細(xì)胞。1 000 r/min離心5 min，加入200 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，分別加入10 μl Annexin V-FITC和PI，混勻后避光孵育30 min。加入300 μl Binding buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞質(zhì)或線粒體蛋白，定量后，以20 μg蛋白上樣量經(jīng)SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗稀釋液（TDP1、Bcl-2稀釋比1:2 000，Bax、Cyt-c稀釋比1:1 000），室溫孵育1 h，PBS清洗3次，加入經(jīng)辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用TANON GIS讀取條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞中miR-218-5p和TDP1 mRNA表達(dá)水平、雙熒光素酶活性、周期及凋亡占比、TDP1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平均以（x±s）表示，符合正態(tài)分布，兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中miR-218-5p與TDP1表達(dá)相關(guān)性

結(jié)果顯示，miR-218-5p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常細(xì)胞（F=25.806,P=0.000），而TDP1表達(dá)水平卻顯著高于正常細(xì)胞（F=55.251,P=0.0 0 0），兩者呈負(fù)相關(guān)（R2=0.9 5 8,P=0.0212），見圖1。本研究選擇在四種胃癌細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)水平最高。TDP1表達(dá)水平低的SGC-7901細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞材料。

圖1 miR-218-5p與TDP1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性Figure 1 Expression of miR-218-5p and TDP1 in gastric cancer cells and their correlation

2.2 miR-218-5p與TDP1靶向關(guān)系驗(yàn)證

雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-218-5p-mimic和TDP1野生質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低（t=6.612,P=0.003），見圖2。

圖2 miR-218-5p與TDP1的靶向關(guān)系Figure 2 Targeting relationship between microRNA-218-5p and TDP1

2.3 miR-218-5p及TDP1對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，損傷組G1期細(xì)胞數(shù)量增多（t=5.795,P=0.004）；與損傷組相比，Lv-TDP1過表達(dá)組G1期細(xì)胞數(shù)量減少（t=3.405,P=0.027），而miR-218-5pmimic +Lv-TDP1組G1期細(xì)胞數(shù)量增多（t=5.577,P=0.005），miR-218-5p-mimic組進(jìn)一步增多（t=14.201,P=0.000），見圖3。

圖3 miR-218-5p及TDP1對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響Figure 3 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on cell cycle of SGC-7901 cells

2.4 miR-218-5p及TDP1對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組、miR-218-5p-NC和Lv-NC組細(xì)胞凋亡率升高（F=21.133,P=0.000）；與損傷組比較，Lv-TDP1組凋亡率降低（t=2.911,P=0.044），而miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組凋亡率升高（t=3.013,P=0.039），miR-218-5p-mimic組凋亡率進(jìn)一步升高（t=5.371,P=0.006），見圖4。

圖4 miR-218-5p及TDP1對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on apoptotic rate of SGC-7901 cells

2.5 miR-218-5p對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體TDP1及細(xì)胞中Bax和Cyt-c蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組線粒體TDP1蛋白水平顯著升高（t=11.416,P=0.000），細(xì)胞中Bax與Cyt-c蛋白表達(dá)水平也顯著升高（t=7.339,P=0.002;t=6.987,P=0.002）；與損傷組比較，Lv-TDP1組線粒體TDP1水平顯著升高（t=4.734,P=0.009），Bax及Cyt-c蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=4.775,P=0.009;t=3.363,P=0.028），而miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組和miR-218-5pmimic組與Lv-TDP1組趨勢(shì)相反，線粒體TDP1水平顯著降低（F=208.357,P=0.000），Bax及Cyt-c蛋白表達(dá)顯著升高（F=29.328,P=0.001;F=29.109,P=0.001），見圖5。

圖5 miR-218-5p及TDP1對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體TDP1及細(xì)胞中Bax和Cyt-c蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on expression of TDP1 in mitochondria and Bax and Cyt-c proteins in SGC-7901 cells

3 討論

胃癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的腫瘤，傳統(tǒng)的化療和生物制劑的預(yù)后均較差[9]。我國(guó)近二十年的胃癌發(fā)病率和死亡率雖然呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)[10]，但疾病負(fù)擔(dān)仍然十分沉重，嚴(yán)重危害著我國(guó)居民的健康，仍是我國(guó)癌癥防治的重點(diǎn)。miR-218-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑制因子作用，影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-218在胃癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平降低與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良有關(guān)，而且miR-218可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。Kim等[14]研究結(jié)果也顯示，miR-218在胃癌細(xì)胞及組織中異常表達(dá)，可能是一種新的胃癌治療靶點(diǎn)。miR-218-5p在胃癌中作為治療靶點(diǎn)的潛力也已被初步探討[5]，Lin等[15]研究結(jié)果顯示miR-218-5p模擬物可抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，miR-218-5p在四種胃癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)低表達(dá)，結(jié)合上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果，提示miR-218-5p與胃癌之間存在密切關(guān)系。

本研究中，miR-218-5p和TDP1在四種胃癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，雙熒光素酶報(bào)告基因亦驗(yàn)證兩者間存在靶向關(guān)系。拓?fù)洚悩?gòu)酶1（Top1）在基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)DNA拓?fù)錉顟B(tài)，當(dāng)Top1無(wú)法從DNA鏈上解離時(shí)可導(dǎo)致DNA斷裂，而TDP1可修復(fù)由Top1介導(dǎo)的染色體斷裂，從而修復(fù)細(xì)胞核及線粒體中的DNA損傷[7,16]。TDP1是一種細(xì)胞核和線粒體蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激（過氧化氫或魚藤酮誘導(dǎo)）損傷時(shí)，TDP1易位轉(zhuǎn)移至線粒體中，維持線粒體DNA的完整性，支持線粒體功能[17]。線粒體基因不穩(wěn)定在胃癌的發(fā)生中起著重要作用，參與其發(fā)病機(jī)制，可通過兩種途徑引起細(xì)胞癌變：一是引起核基因組的不穩(wěn)定；二是線粒體氧化壓力的增加導(dǎo)致線粒體酶表達(dá)異常和凋亡途徑的激活影響細(xì)胞的生物學(xué)特征，使其發(fā)生惡變[18]。Bax存在于線粒體外，當(dāng)其接收到凋亡信號(hào)時(shí)易位至線粒體，改變線粒體膜電位及其通透性，促進(jìn)線粒體中Cyt-c的釋放，從而激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源性凋亡途徑[19]。本次研究采用魚藤酮誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生氧化損傷，當(dāng)miR-218-5p表達(dá)升高時(shí)，細(xì)胞G1期阻滯加劇，細(xì)胞凋亡水平升高，且細(xì)胞中Bax和Cyt-c表達(dá)上調(diào)，而線粒體中TDP1表達(dá)降低；當(dāng)TDP1表達(dá)升高時(shí)，緩解細(xì)胞G1期阻滯，凋亡率降低，線粒體中TDP1水平升高，而Bax和Cyt-c表達(dá)下調(diào)，因此，推測(cè)miR-218-5p可能通過抑制線粒體TDP1水平，促使細(xì)胞線粒體功能受損，從而觸發(fā)細(xì)胞線粒體內(nèi)源性凋亡途徑。

綜上所述，本研究顯示過表達(dá)miR-218-5p或抑制TDP1表達(dá)可促進(jìn)魚藤酮誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制可能與miR-218-5p靶向抑制TDP1介導(dǎo)的線粒體DNA損傷修復(fù)及功能維持、激活線粒體內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)。