新疆維吾爾族T2DM患者外周血circRNA差異表達初步研究

仝夢維，常向云

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(international diabetes federation，IDF)報告顯示全球DM患病人數(shù)逐年升高；其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus ，T2DM)患者約占90%[1]。T2DM長期可累積損害心、腦、腎等器官，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。近年研究提示一不具有5′端帽子和3′端多聚A尾的非編碼RNA，由外顯子、內(nèi)含子或者外顯子和內(nèi)含子共同構(gòu)成[2]，并且大量存在[3]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)具有組織特異性及發(fā)育特異性、進化保守性、較高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的特點[4-5]，這些特性可更好地輔助研究疾病的發(fā)生機制及提高有關(guān)疾病的預防和診療水平。多項研究[6-8]表明，circRNA參與了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程。多次流行病學調(diào)查顯示新疆地區(qū)維吾爾族T2DM的患病率遠高于同地區(qū)其他民族，并且其并發(fā)癥檢出率也較高[9]。該研究通過高通量核苷酸測序技術(shù)篩選出維吾爾族T2DM患者差異表達的circRNAs，選取其中4條，經(jīng)擴大人群樣本量觀察其在外周血中的表達情況，探討這些circRNAs在維吾爾族T2DM分子生物學發(fā)病機制方面的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象入組樣本來自石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2019年10月—2020年6月門診體檢者及住院患者的外周靜脈血。該研究經(jīng)石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批號：2018-028-01)；并征得所有研究對象的知情同意，進入研究之前均簽署知情同意書。所有入組人員均接受過75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT試驗)。T2DM診斷均符合1999年WHO的糖尿病診斷標準[10]，余納入標準：① 長期居住新疆，三代內(nèi)未與其他民族通婚的維吾爾族；② 無自身免疫性疾病，無嚴重的心、肝、腎臟疾病，無惡性腫瘤，非妊娠、哺乳期婦女；③ 年齡均大于40歲。最初的“高通量核苷酸測序隊列”由5例明確診斷的維吾爾族T2DM患者和5例維吾爾族正常對照者(NC組)組成，而驗證隊列由22例明確診斷為T2DM患者和20例NC組成。其中，T2DM組平均年齡(62.10±11.23)歲，男9例，女13例；NC組平均年齡(56.95±9.72)歲， 男9例，女11例。見表1。

表1 入組對象基本信息

1.2 單核細胞提取入組的研究對象均要求夜00：00以后禁食，以確保空腹8 h以上，于次日晨抽取外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中；根據(jù)外周血單核細胞提取試劑盒(TBD公司，天津)說明將試劑與外周血形成濃度梯度后置于水平離心機中以2 500 r/min離心20 min，收集離心后的單核細胞，加入TRIzol，-80 ℃冰箱保存。

1.3 總RNA的提取以及質(zhì)量和完整性檢測按照TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書，提取外周血單核細胞的總RNA；用紫外分光光度儀(Nanodrop ND-2000，美國Thermo公司)測定總RNA的濃度和純度，要求A260/A280在1.8 ～2.0之間；用變性瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA的完整性。見圖1。

圖1 RNA電泳圖

1.4 差異環(huán)狀RNA篩選采用Findcirc(武漢生命之美科技有限公司)進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，預測出來的circRNA中滿足長度大于10 000 bp，且back spliced reads數(shù)目大于2的進行基因組定位分析。通過樣本聚類關(guān)系判斷測序?qū)嶒炘O計及樣本取材的正確性，表達值由顏色刻度表示，強度從藍色(相關(guān)系數(shù)越低)增至紅色(相關(guān)系數(shù)越高)；如樣本相似性越高，相似系數(shù)越大，聚類分析熱圖越接近紅色，樣本類聚關(guān)系越近。見圖2。根據(jù)各樣本中的circRNA表達情況進行兩樣本間的相關(guān)性分析，以此來檢查不同樣品之間的circRNA表達水平的相關(guān)性。采用edgeR軟件進行數(shù)據(jù)標準化和差異性表達的circRNA篩選，當表達變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2.0或≤0.5，P<0.05時表示有顯著差異性，通過MA Plot(縱坐標表示以10為底取log值的表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性(以10為底取log值)，橫坐標表示以2為底取log值表達量變化倍數(shù)(以2為底取log值)。上調(diào)circRNAs位于上方的藍色線條(M value=1,FC=2)以上部分，下調(diào)circRNAs位于下方的藍色線條(M value=1,FC=0.5)以下部分。分層聚類分析產(chǎn)生熱圖[每一列表示一個組織樣本，每一行表示1個circRNA，表達值由顏色刻度表示，強度從藍色(相對低表達)增至紅色(相對高表達)]，以顯示NC和T2DM外周血之間的表達上調(diào)和下調(diào)的circRNAs。

圖2 樣本聚類圖

1.5 反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR采用Thermo(美國)反轉(zhuǎn)錄試劑盒：20 μl反應液體系：Templet RNA 8 μl，Oligo(dT) primer 1 μl， 5×Reaction Buffer 4 μl, RiboLock RNnase Inhibitor 1 μl，10 mmol/L Dntp Mix 2 μl，RevertAid M-MuLV RT(200 U/μl) 1 μl， RNase-free water 2 μl；反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。circRNAs雙向引物由引物設計軟件Blast設計，交由上海吉瑪合成。RT-qPCR采用的QuantiNova SYBR-Green PCR Kit(500)，20 μl反應液體系(德國 Qiagen GmbH)：2×SYBR-Green PCR Master Mix 10 μl，QN ROX Reference Dye 0.5 μl，CircRNA引物1 μl， 第一鏈cDNA 2 μl， RNase-free water 6.5 μl。在實時定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司7500 Fast Real-Ttime PCR System)上進行擴增，反應條件為:95 ℃、5 min，40個PCR循環(huán)[95 ℃、10 s，60 ℃、30 s(收集熒光)]，為建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結(jié)束后，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，從60 ℃緩慢加熱至99 ℃(儀器自動進行Ramp Rate為0.05 ℃/s)。反應結(jié)束由系統(tǒng)自動計算各反應管Ct值，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。所有樣本定量PCR反應均為1式3孔。PCR擴增曲線基線平滑，指數(shù)擴增期明顯，直到平臺期，副孔之間平行性較好，說明PCR擴增良好；熔解曲線為單峰，無雜峰，說明擴增產(chǎn)物具有特異性，無其他非特異性產(chǎn)物存在。見表2。

表2 用于分析circRNA 水平的RT-qPCR 引物

2 結(jié)果

2.1 高通量核苷酸測序結(jié)果本次高通量核苷酸測序共發(fā)現(xiàn)134個差異表達的circRNAs，其中87個表達上調(diào)，47個表達下調(diào)，見圖3。這些差異表達的circRNAs大多數(shù)由外顯子構(gòu)成，見圖4；并且分布于各個染色體，包括X染色體，見圖5。通過MA Plot過濾，最終確定兩組間差異有統(tǒng)計學意義的circRNAs，見圖6，并根據(jù)以下兩個基本參數(shù)(FC≥2或≤0.5，P<0. 05)選定目標circRNAs進行qRT-PCR實驗；經(jīng)篩選和比對挑選出符合標準的4個circRNAs，其中表達上調(diào)：hsa-circ-0139634(FC=3.365，P=0.009)，has-circ-0005414(FC=3.343，P=0.006)；表達下調(diào)：hsa-circ-0032491(FC=3.456，P=0.044)，hsa-circ-0002922(FC=3.690，P=0.013)。見表3。

圖3 NC和T2DM外周血微陣列分析熱圖

圖4 根據(jù)基因組起源對顯著失調(diào)的circRNAs 進行分類

圖5 染色體中環(huán)狀RNA分布

表3 四個顯著失調(diào)的circRNAs

圖6 NC與T2DM的外周血circRNAs的差異表達的MA plot

2.2 RT-qPCR驗證候選circRNA及ROC曲線分析本研究選取T2DM患者(n=22)及NC人外周血(n=20)進一步驗證。通過RT-qPCR技術(shù)實時繪制熔解曲線及擴增曲線，最終結(jié)果顯示，擴增曲線基線平滑且熔解曲線為單峰，其中hsa-circ-0139634(P<0.001)、hsa-circ-0032491(P=0.029)及has-circ-0002922(P=0.040)在2組人群中差異表達具有統(tǒng)計學意義，與測序結(jié)果一致；has-circ-0005414(P=0.910)在2組人群中的差異表達未得到驗證，見表4。分別對4個circRNAs進行ROC曲線分析顯示，hsa-circ-0139634的ROC曲線下面積是0.926[95%CI(0.839～1.000)，P<0.001], 約登指數(shù)為0.833，敏感性為1.000，特異性為0.833，截斷值為0.169；has-circ-0005414的ROC曲線下面積是0.575[95%CI(0.370～0.779)，P=0.910], 約登指數(shù)為0.278，敏感性為0.412，特異性為0.867，截斷值為5.749；hsa-circ-0032491的ROC曲線下面積是0.316[95%CI(0.086～0.440)，P=0.017]， 約登指數(shù)為0.056，敏感性為1.000，特異性為0.056，截斷值為0.230；hsa-circ-0002922的ROC曲線下面積是0.263[95%CI(0.078～0.428)，P=0.014]， 約登指數(shù)為0.080，敏感性為0.955，特異性為0.125，截斷值為0.011，見圖7。

表4 兩組間RT-qPCR驗證的基因情況[M(P25，P75)]

圖7 所選定的4條circRNA的ROC曲線A：has-circ-0005414基因；B：hsa-circ-0139634基因；C：has-circ-0032491基因；D：has-circ-0002922基因

3 討論

T2DM在全球是一個比較普遍的代謝性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚，僅知其由環(huán)境因素和遺傳因素聯(lián)合作用所致。維吾爾族是T2DM的高發(fā)病率人群，該研究為首次探索新疆維吾爾族T2DM患者外周血中circRNAs的差異表達譜及其在維吾爾族T2DM分子生物學發(fā)病機制方面的意義。該研究運用高通量核苷酸測序技術(shù)對維吾爾族5例T2DM者和5例NC的志愿者樣本進行了測序，獲得了兩組間circRNAs差異表達譜，差異表達的circRNAs分布于各個染色體上；通過MA plot過濾發(fā)現(xiàn)這些差異表達circRNAs中的大部分在維吾爾族T2DM組中是上調(diào)表達的，其中外顯子占比為86%。根據(jù)基因hsa-circ-0139634、has-circ-0005414、hsa-circ-0032491及has-circ-0002922的序列設計出用于RT-qPCR驗證的雙向引物，通過42例樣本檢測了4個circRNAs的表達量，結(jié)果顯示hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在兩組人群中的差異表達具有統(tǒng)計學意義。查閱近幾年關(guān)于circRNAs與DM發(fā)生有關(guān)的國內(nèi)外文章，未見關(guān)于hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922與DM相關(guān)聯(lián)的報道。本次實驗是首次提出hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在維吾爾族T2DM患者與NC人群中的表達量存在差異性。通過對hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922進行ROC曲線下面積分析，顯示hsa-circ-0139634的曲線下面積最大，且其靈敏度、特異性及正確指數(shù)均較高，推測其在維吾爾族T2DM分子生物學發(fā)病機制方面具有潛在價值，可能成為區(qū)分維吾爾族T2DM患者與NC人群的新型分子標志物。

目前研究者[11]認為circRNAs主要通過以下四種方式發(fā)揮作用：① 作為micro RNA(miRNA)海綿，通過吸附miRNAs抑制其翻譯功能；② 少部分circRNAs可作為翻譯模板，翻譯出對應蛋白質(zhì)；③ 與蛋白質(zhì)相結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)的作用；④ 可調(diào)節(jié)親本基因參與轉(zhuǎn)錄，其中以作為miRNA海綿的作用最為重要，這是一種通過內(nèi)源性競爭作用來調(diào)節(jié)miRNA靶基因的轉(zhuǎn)錄。如環(huán)狀RNA CIRS-7/CDR1as能夠通過阻斷miR-7及其下游通路，調(diào)節(jié)胰島細胞胰島素的轉(zhuǎn)錄和分泌；環(huán)狀RNA circHIPK3可通過隔離miR-124-3p和miR-338-3p以及調(diào)節(jié)β細胞關(guān)鍵基因如Slc2a2、Akt1和Mtpn的表達而干擾胰島細胞的功能[12]。因此，推測此次測序發(fā)現(xiàn)的差異表達的circRNAs可能是通過miRNA海綿作用對下游靶基因產(chǎn)生調(diào)節(jié)，從而影響維吾爾族T2DM的發(fā)生發(fā)展。

目前研究還沒有確鑿的證據(jù)證明hsa-circ-0139634的功能；因此，hsa-circ-0139634與miRNA的相互作用機制將是后期深入研究的內(nèi)容。該研究是單一中心的研究，受試者在地理上高度集中，尚不清楚其他地區(qū)和民族是否也有類似的circRNAs表達譜，因此該研究結(jié)果需要在更多樣化的隊列中進一步驗證；并且該研究為小樣本研究，未在大樣本中進一步驗證，因此課題組將在后期研究中對該研究的circRNAs進行大樣本驗證及對應通路預測和驗證。該研究為探索維吾爾族T2DM的分子生物學發(fā)病機制打下了前期基礎，為維吾爾族T2DM患者的診療帶來新思路。