c.1311C>T和c.1004C>A與廣西G6PD缺乏癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性

石 鳳，滕元姬, 何麗橋, 李 蘭, 李光景, 仇雯麗, 王春芳, 王俊利

先天性溶血性貧血包括紅細(xì)胞酶異常、紅細(xì)胞膜異常和血紅蛋白異常，其中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD) 缺乏癥是常見(jiàn)的因紅細(xì)胞酶異常而引起的溶血性疾病[1]。G6PD是以X染色體連鎖不完全的顯性遺傳性溶血性疾病，俗稱(chēng)“蠶豆病”， 臨床表現(xiàn)為G6PD酶表達(dá)水平降低，在中國(guó)南方廣東、廣西地區(qū)的發(fā)病率較高。由于其遺傳特性，在男性患者的發(fā)病率明顯高于女性患者[2]。G6PD酶表達(dá)水平不足可影響紅細(xì)胞的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致紅細(xì)胞氧化損傷、引起溶血反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起高膽紅素血癥進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，威脅患者生命健康[3]。G6PD基因突變可能會(huì)引起G6PD酶表達(dá)水平降低，廣西最常見(jiàn)的突變基因位點(diǎn)包括95A>G、1376G>T、1388G>A[4]。該研究分析G6PD基因c.1311C>T和c.1004 C>A位點(diǎn)突變與G6PD缺乏癥和酶表達(dá)水平的相關(guān)性，探討該位點(diǎn)突變是否會(huì)引起表型改變，為G6PD缺乏癥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，為篩查G6PD缺乏癥患者提供更加全面的檢測(cè)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象隨機(jī)選取2017年1月—2019年6月經(jīng)確診的417 例G6PD缺乏癥患者作為病例組，并選取同期進(jìn)行G6PD篩查的295例健康人群作為對(duì)照組，其中，病例組男性261例，女性156 例；對(duì)照組男性98例，女性197例。病例組年齡為1～90(35.05±22.33) 歲，對(duì)照組年齡為1～86(36.11±18.48)歲，兩組年齡差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.491)。所有研究樣本均于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)，并經(jīng)臨床醫(yī)師診斷確診。本研究的所有研究對(duì)象均經(jīng)受試者本人知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 全基因組DNA提取采集受試者EDTA-K2抗凝全血2 ml，3 000 r/min離心5 min，去掉上清液，吸取20 μl壓積紅細(xì)胞于1 ml去離子水完全溶解，使用G6PD酶檢測(cè)試劑盒(上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司)，采用日立7600-series全自動(dòng)生化分析儀 (日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司) 檢測(cè)G6PD酶活性的表達(dá)。再提取全基因組DNA，于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.3 多重單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型檢測(cè)使用SNPscanTM多重SNP方法對(duì)G6PD SNP c.1311C>T和c.1004C>A進(jìn)行分型。操作步驟為：① 設(shè)計(jì)3條探針引物序列，包括5′端的通用引物序列和等位基因鑒別引物序列，以及1條3′端特異性序列、位點(diǎn)鑒別連接序列。兩個(gè)等位基因特異性鑒別序列與通用引物連接生成產(chǎn)物基因型，引物序列如表1所示。② 高溫處理短片段基因組DNA并與探針混合物變性復(fù)性。③ 加入連接酶反應(yīng)體系，特異性連接同一模板上緊鄰的配對(duì)探針，生成連接產(chǎn)物。④ 通過(guò)熒光標(biāo)記的通用引物擴(kuò)增連接產(chǎn)物，使用熒光毛細(xì)管電泳鑒別不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)其峰譜鑒定不同位點(diǎn)的基因型。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃、2 min；94 ℃、20 s，62 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，9個(gè)循壞；94 ℃、20 s，57 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，25個(gè)循壞。

表1 c.1311C>T和c.1004C>A引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理G6PD病例組和對(duì)照組的基因型和等位基因頻率采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)所得，兩組的基因型和等位基因分布差異通過(guò)Logistic回歸計(jì)算，并經(jīng)年齡和性別校正計(jì)算P值和風(fēng)險(xiǎn)值。通過(guò)在線(xiàn)SHEsis軟件計(jì)算兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的單倍型分布頻率。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G6PD病例組與對(duì)照組的性別差異比較本研究納入對(duì)象共712例，病例組男性261例，占62.6%，女性156例，占37.4%；對(duì)照組男性98例，占33.2%，女性197例，占66.8%。與對(duì)照組相比，病例組男性發(fā)病率升高(62.6%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，OR=3.363, 95%CI=2.459～4.600)。

2.2 兩組G6PD SNP比較本研究選取G6PD基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)c.1311C>T和 c.1004C>A進(jìn)行基因型和等位基因比較，如表2所示，在病例組和對(duì)照組中， c.1311C>T位點(diǎn)的基因型TT和CC+CT和等位基因T與G6PD缺乏癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[TTvsCC:(P=0.001,OR=0.373, 95%CI=0.204～0.683); TTvsCC+CT:(P=0.001,OR=0.371, 95%CI=0.203～0.678); TvsC:(P=0.002,OR=0.601, 95%CI=0.435～0.829)。然而，c.1004C>A位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組間的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組間G6PD SNPs基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.3 G6PD SNP與G6PD酶表達(dá)水平的相關(guān)性檢測(cè)G6PD病例組和對(duì)照組兩組G6PD酶的表達(dá)水平，并比較G6PD SNP c.1311C>T不同基因型之間G6PD的表達(dá)水平差異，研究結(jié)果顯示，G6PD病例組的G6PD酶表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.001)，見(jiàn)圖1A。在G6PD病例組中，相對(duì)于c.1311基因型TT和c.1311基因型CC患者，攜帶c.1311基因型CT患者有較高G6PD酶表達(dá)水平(P<0.001)，見(jiàn)圖1B，但其仍低于對(duì)照組c.1311基因型 CT的表達(dá)水平(P<0.001)，見(jiàn)圖1C。

圖1 c.1311C>T基因多態(tài)性與G6PD酶表達(dá)水平A：兩組的G6PD酶表達(dá)水平差異；與對(duì)照組比較：***P<0.001；B：病例組G6PD基因多態(tài)性位點(diǎn)c.1311不同基因型的G6PD酶表達(dá)水平差異；C：對(duì)照組和病例組CT的G6PD酶表達(dá)水平差異；與CC組比較：△△△P<0.001；與CT組比較：###P<0.001；與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.4 G6PD SNPs單倍型分析將本研究G6PD突變的兩位點(diǎn)c.1311C>T和c.1004C>A進(jìn)行在線(xiàn)SHEsis單倍型分型。結(jié)果顯示，該兩多態(tài)性位點(diǎn)有3種單倍型組合，包括C-C、T-C和T-A，主要為C-C單倍型，在G6PD病例組和對(duì)照組分別占89.6%和82.9%。C-C單倍型在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶C-C單倍型與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)(P<0.001,OR=2.057, 95%CI=1.494～2.832)，而攜帶T-C單倍型與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān) (P<0.001,OR=0.486, 95%CI=0.353～0.669)。見(jiàn)表3。

表3 病例組和對(duì)照組的G6PD SNP單倍型分析[n(%)]

3 討論

G6PD酶是在磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶，能使反應(yīng)產(chǎn)物還原型輔酶Ⅱ作為保持谷胱甘肽還原性的供氫體，維持紅細(xì)胞的穩(wěn)定性。2017年，中國(guó)G6PD缺乏癥的總體發(fā)病率達(dá)到0.77%，而新生兒G6PD缺乏癥發(fā)病率高達(dá)3.39%，其中山西的發(fā)病率最低，而廣西的發(fā)病率最高[5]。G6PD酶缺陷引起患者嚴(yán)重溶血反應(yīng)、高膽紅素血癥和神經(jīng)性腦病。既往研究[6]表明SNP影響基因功能。G6PD缺乏癥主要是由于基因突變以及遺傳因素導(dǎo)致G6PD酶表達(dá)活性或表達(dá)水平降低引起，G6PD位于X染色體長(zhǎng)臂，遺傳方式呈X連鎖不完全顯性遺傳。男性只有一條X染色體，女性有兩條X染色體。因此，男性只要發(fā)生G6PD染色體變異即呈致病表現(xiàn)。男性發(fā)病率較女性高。然而，G6PD酶缺陷患者在沒(méi)有外源誘導(dǎo)發(fā)病機(jī)制時(shí)不發(fā)病，如蠶豆、某些化學(xué)藥物等[7]。在廣西人群中，常見(jiàn)的G6PD突變位點(diǎn)包括c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.1376G>T和c.1388G>A[5]。c.1311C>T是指G6PD基因11外顯子發(fā)生C→T突變。近年來(lái)，研究[8-10]表明c.1311C>T聯(lián)合其他多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型分型與G6PD酶活性降低有關(guān)。廣西地區(qū)處于多種遺傳性疾病的高發(fā)地區(qū)。因此，研究廣西群體的基因多態(tài)性具有重要價(jià)值。

該研究檢測(cè)了G6PD酶缺陷患者的c.1311C>T和c.1004C>A兩位點(diǎn)。結(jié)果顯示，在該研究群體中，男性G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于女性患者，相對(duì)于對(duì)照組，G6PD缺乏癥患者的G6PD酶表達(dá)水平顯著降低；相對(duì)于c.1311基因型TT和CC患者，攜帶c.1311基因型CT患者有較高的G6PD酶表達(dá)水平，然而，c.1311基因型CT患者的G6PD酶表達(dá)水平仍比正常組人群的G6PD表達(dá)水平低。該研究顯示c.1004C>A與G6PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。將c.1311C>T和c.1004C>A位點(diǎn)聯(lián)合進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示，單倍型C-C與G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，而單倍型C-T與G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。c.1004C>A是國(guó)內(nèi)少見(jiàn)的G6PD基因突變類(lèi)型，在李文瑞等[11]研究結(jié)果中，672例G6PD缺乏癥患者出現(xiàn)c.1004C>A基因突變例數(shù)僅有6例。在該研究中，共檢出c.1004C>A基因突變8例，其中包括4例雜合子突變CA和4例純合子突變AA。以往研究[12]表明G6PD基因c.1311的等位基因C突變?yōu)門(mén)，其氨基酸及蛋白并未發(fā)生改變，屬于同義突變，與G6PD缺乏無(wú)關(guān)，并且該基因突變位點(diǎn)主要出現(xiàn)于地中海貧血性疾病中。然而，該研究c.1311C>T位點(diǎn)突變降低G6PD疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且本研究群體的疾病診斷排除了地中海貧血。然而，該基因位點(diǎn)不同基因型的G6PD表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與以上研究結(jié)果不一致。其可能原因：第一，G6PD病例組研究群體所選樣本均來(lái)自長(zhǎng)期居住在廣西地區(qū)，可能存在影響該位點(diǎn)的遺傳特異性；第二，病例組人群可能存在其他位點(diǎn)的基因突變，影響c.1311C>T位點(diǎn)突變結(jié)果以及干擾G6PD表達(dá)水平。