膜吸附法結(jié)合可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)柑橘黃龍病菌

李鎮(zhèn)希, 李文婷, 黃家權(quán), 鄭正, 許美容, 鄧曉玲

膜吸附法結(jié)合可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)柑橘黃龍病菌

李鎮(zhèn)希, 李文婷, 黃家權(quán), 鄭正, 許美容, 鄧曉玲

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是由候選韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）侵染引起的一種柑橘病害。對(duì)于該病害的防治主要采取綜合措施，包括實(shí)施檢疫、種植無(wú)病苗木、及時(shí)挖除病樹(shù)和集中大面積聯(lián)防聯(lián)控柑橘木虱等。前3種方法都需要依靠準(zhǔn)確的柑橘黃龍病診斷技術(shù)。【】利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification, LAMP），結(jié)合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen熒光染料可視化，建立黃龍病田間核酸快速檢測(cè)方法。以黃龍病菌-操縱子與原噬菌體DNA聚合酶基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)LAMP特異性引物，包括外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP、環(huán)引物L(fēng)oopF/LoopB和莖引物StemF/StemB。通過(guò)對(duì)環(huán)引物和莖引物設(shè)定不同的用量組合，對(duì)LAMP引物體系進(jìn)行優(yōu)化，確定合適的引物濃度。用優(yōu)化后的LAMP引物體系對(duì)188份田間柑橘葉片進(jìn)行檢測(cè)，并構(gòu)建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析實(shí)時(shí)熒光LAMP（qLAMP）在CLas檢測(cè)上的準(zhǔn)確性。對(duì)qLAMP預(yù)混反應(yīng)液進(jìn)行兩步的常溫干燥，分別設(shè)定不同的存放條件，評(píng)估LAMP常溫干燥試劑的穩(wěn)定性。用本研究建立的CLas可視化LAMP快速檢測(cè)方法，對(duì)田間71個(gè)柑橘葉片樣品和35個(gè)柑橘果實(shí)樣品進(jìn)行檢測(cè)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）比較兩者的符合率。在LAMP體系中加入環(huán)引物、莖引物或增加其濃度都能促進(jìn)反應(yīng)速率的提升，并且同時(shí)加入終濃度均為1.6 μmol·L-1的環(huán)引物和莖引物能進(jìn)一步提高LAMP反應(yīng)速率。LAMP預(yù)混液通過(guò)兩步法干燥在不同溫度存放1—4周均能保持反應(yīng)活性基本不變，表明制備的兩步法干燥L(fēng)AMP試劑檢測(cè)性能較好，在低溫和常溫環(huán)境下的穩(wěn)定性尚可，僅35℃高溫存放會(huì)略微增加LAMP試劑的反應(yīng)時(shí)間。使用孔徑0.1 μm尼龍膜代替纖維素濾紙作為核酸吸附材料能提升CLas快速診斷技術(shù)的靈敏度。結(jié)合DNA快速提取和可視化LAMP建立的CLas快速核酸診斷方法最低能檢測(cè)到濃度為102copies/μL的重組質(zhì)粒樣品，總體準(zhǔn)確率高。經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，該方法的診斷結(jié)果與qPCR無(wú)顯著差異。可視化LAMP快速檢測(cè)相較常規(guī)檢測(cè)有著更低的成本和耗時(shí)，而且可視化LAMP快速檢測(cè)無(wú)需離心機(jī)和PCR儀等昂貴的儀器，僅需一臺(tái)65℃恒溫設(shè)備即可。建立的CLas快速核酸檢測(cè)方法成本低，30 min即可觀察到檢測(cè)結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，可替代qPCR在田間進(jìn)行黃龍病的快速鑒定。

柑橘黃龍?。缓蜻x韌皮部桿菌亞洲種；田間檢測(cè)；膜吸附法；DNA快速提取；可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍病（Huanglongbing，HLB）是由候選韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）侵染引起的柑橘病害，在田間主要通過(guò)帶病苗木和帶菌的柑橘木虱（）進(jìn)行傳播，是柑橘生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。目前尚未有有效的藥劑可以治療柑橘黃龍病，對(duì)于該病害的防治主要采取綜合的措施，包括實(shí)施檢疫、種植無(wú)病苗木、及時(shí)挖除病樹(shù)和集中大面積聯(lián)防聯(lián)控柑橘木虱等，前3種方法都需要依靠準(zhǔn)確的柑橘黃龍病診斷技術(shù)。另外，密切了解果園中柑橘黃龍病的發(fā)病情況是防治的首要條件之一，通常果農(nóng)會(huì)將疑似黃龍病的柑橘枝條交由專業(yè)的研究所或高校檢測(cè)，但往往需要較高的檢測(cè)成本和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間。因此，建立黃龍病菌的田間快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)黃龍病的防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】田間診斷法被最早應(yīng)用于癥狀鑒別，人們通過(guò)觀察田間柑橘植株是否具有典型的黃龍病癥狀，來(lái)判斷該植株是否感染黃龍病菌。在發(fā)病初期，柑橘植株通常表現(xiàn)為黃梢，病葉會(huì)出現(xiàn)斑駁型黃化或缺鋅狀黃化[1]。但葉片的癥狀受營(yíng)養(yǎng)條件、氣候環(huán)境和生長(zhǎng)時(shí)期等多種因素影響，單從葉片癥狀就鑒定柑橘植株是否感染黃龍病菌并不可靠[2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）利用了DNA指數(shù)擴(kuò)增期間的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化來(lái)實(shí)時(shí)分析目的基因的拷貝數(shù)變化趨勢(shì)，具有操作簡(jiǎn)便、快速和高靈敏度的特點(diǎn)；其次，在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，大大降低了氣溶膠污染的可能性[3]。2004年，我國(guó)首次建立柑橘黃龍病菌qPCR檢測(cè)體系[4]。2000年，Notomi等[5]發(fā)明了一種新的DNA擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），根據(jù)目標(biāo)基因的6個(gè)特異性序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，在具有強(qiáng)烈的鏈置換活性的DNA聚合酶參與下，可以使DNA無(wú)需熱變性過(guò)程就能大量擴(kuò)增，降低了對(duì)設(shè)備的要求；2005年，Okuda等[6]首次根據(jù)黃龍病菌KJAL-B操縱子序列設(shè)計(jì)引物，建立了一種檢測(cè)黃龍病菌的LAMP方法。之后，利用LAMP技術(shù)診斷柑橘黃龍病的研究逐漸增多[7-17]，但是將目前的研究應(yīng)用到黃龍病田間診斷仍有一定的局限性，例如引物靶標(biāo)設(shè)計(jì)在種間差異較大的原噬菌體短串聯(lián)重復(fù)區(qū)域[7]，引物間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)造成假陽(yáng)性[9]，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，試劑需要在低溫下運(yùn)輸儲(chǔ)存和診斷耗時(shí)較長(zhǎng)等。而Keremane等[12]利用便攜式的實(shí)時(shí)熒光恒溫儀快速檢測(cè)柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌的-操縱子與原噬菌體DNA聚合酶基因保守序列獲得較好的效果，但對(duì)于植物樣本快速檢測(cè)的研究仍然較少[9,18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基礎(chǔ)的兩對(duì)引物L(fēng)AMP反應(yīng)速率較慢，通常需要反應(yīng)60 min以上[13-17]，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)和加入環(huán)引物和莖引物來(lái)加快反應(yīng)速率。實(shí)驗(yàn)室常用的DNA提取試劑盒和LAMP試劑盒難以在田間使用，迫切需要操作和使用簡(jiǎn)易的DNA提取技術(shù)和LAMP試劑。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用LAMP常溫干燥試劑，結(jié)合膜吸附法DNA快速提取技術(shù)，建立CLas田間核酸快速鑒定技術(shù)，為后續(xù)CLas田間檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 柑橘葉片采集：2018年9月至2020年9月，從廣東省惠州博羅楊村、梅州、肇慶、廣州從化等不同地區(qū)的果園和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)崗山網(wǎng)室采集疑似感染黃龍病和健康的不同柑橘品種葉片，柑橘品種包括砂糖橘（cv. Shatangju）、尤力克檸檬（）、沙田柚（cv. Shatian Yu）、紅心蜜柚（cv. Guangximiyou）、年橘（cv. NianJu）、貢柑（var. Gonggan）、甜橙（）、紅橘（cv. Tangerina）、沃柑（var. Orah）。

柑橘果實(shí)采集：2019年7月，從廣東省惠州博羅楊村果園和廣州從化柑橘果園分別采集疑似感染黃龍病和健康枝條上的砂糖橘和沃柑果實(shí)。

采集葉片和果實(shí)時(shí)盡量保證材料不受損傷，把樣品放入保鮮塑料封口袋中，用濕紙巾包好進(jìn)行保濕保鮮。樣品從田間采回實(shí)驗(yàn)室后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit（200）試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；2.0 WarmStart?DNA Polymerase、10×Isothermal Amplification Buffer、100 mmol·L-1MgSO4Solution購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；EveGreen（20×水溶液）購(gòu)自上海翊圣生物有限公司；SuperGreen/GelGreen核酸染料（10 000×水溶液）購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司；TMGreen qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CLas DNA的常規(guī)提取 采用OMEGA BIO- TEK公司的E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit試劑盒，稱取柑橘葉片葉中脈或果實(shí)橘絡(luò)約0.1 g，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品不同部位的柑橘總DNA。

1.2.2 CLas DNA的膜吸附法提取 具體提取步驟如下：（1）吸附核酸的膜材料圓盤(pán)制備：使用打孔器制備直徑為3 mm的纖維素濾紙或尼龍膜（孔徑0.1 μm）小圓盤(pán)若干，用于核酸的吸附。（2）柑橘組織裂解液的配制：裂解液包含20 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、25 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1Na2EDTA、0.05% SDS、3% PVP和2% DTT。（3）膜材料漂洗液的配制：漂洗液包括75%乙醇溶液和吐溫緩沖液。吐溫緩沖液包含10 mmol·L-1Tris（pH 8.0）和0.1%吐溫-20；（4）DNA的提?。涸谔幚聿煌臉悠泛筒课磺?，均用工業(yè)酒精對(duì)剪刀、刀片和鑷子進(jìn)行消毒。用剪刀剪取葉片中脈組織。將果實(shí)的果皮撥剝開(kāi)，用鑷子從囊壁和果皮上小心撕出橘絡(luò)。每個(gè)樣品的不同部位各稱取約0.01 g植物組織，置于1.5 mL的離心管中，并加入50 μL柑橘組織裂解液，用一次性研磨棒研磨30 s。將核酸吸附材料圓盤(pán)浸入柑橘組織裂解液中至少3 s，然后轉(zhuǎn)移到200 μL的75%乙醇溶液和吐溫緩沖液中先后洗滌至少3 s。最后將圓盤(pán)轉(zhuǎn)移至配制好的反應(yīng)體系中進(jìn)行DNA擴(kuò)增或浸泡在TE緩沖液中洗脫獲得DNA粗提取物。

1.2.3 CLas的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 參考Zheng等[19]使用RNRf/RNRr引物檢測(cè)CLas的方法，采用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光/可視化LAMP的引物設(shè)計(jì)和CLas檢測(cè) 從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)上獲取CLas菌株A4（CP010804）的全基因組序列，根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)要求，以基因簇B-E-G-KAJL-B與原噬菌體DNA聚合酶基因作為靶基因擬定各LAMP引物序列，通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7分析各引物之間的二聚體發(fā)生情況，確定本研究的LAMP引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 柑橘黃龍病菌LAMP檢測(cè)引物序列

實(shí)時(shí)熒光LAMP（qLAMP）反應(yīng)體系包含F(xiàn)3/B3引物各0.4 μmol·L-1，F(xiàn)IP/BIP引物各1.6 μmol·L-1，LoopF/LoopB和StemF/StemB各0.4—1.6 μmol·L-1，1×Isothermal Amplification Buffer，MgSO46 μmol·L-1，dNTPs 1.4 μmol·L-1，2.0 DNA Polymerase 0.32 U·μL-1，1×Evegreen，DNA模板1 μL，其余補(bǔ)充ddH2O至10 μL。將以上混合體系置于CFX ConnectTMqPCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min，每分鐘采集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光/可視化LAMP常溫干燥試劑的制備和田間應(yīng)用 LAMP反應(yīng)干燥試劑的制備方法參考Diego等[20]的方法稍作改良。具體操作如下：將1.36 μL引物和0.224 μL海藻糖（2 mol·L-1）混勻置入0.2 mL離心管底部，于真空濃縮儀以V-AQ模式常溫干燥30 min。然后，將1.4 μL dNTPs、0.4 μL聚合酶和0.6 μL海藻糖（2 mol·L-1）混勻加至沉淀底部，可視化LAMP需要將1 μL 800×Gelgreen核酸熒光染料加到離心管管蓋上，以相同模式室溫干燥15 min。在進(jìn)行LAMP反應(yīng)前，往LAMP干燥試劑加入1 μL 10×LAMP Buffer、0.6 μL MgSO4（100 mmol·L-1）和1 μL DNA模板，qLAMP則需要加入0.5 μL Evegreen，最后補(bǔ)充去離子水使最終體積為10 μL，并且加入10 μL液體石蠟防止LAMP反應(yīng)液蒸發(fā)。

將干燥L(fēng)AMP試劑分別保存在常溫環(huán)境（25℃）、低溫環(huán)境（4℃）和高溫環(huán)境（35℃）中，分別于干燥第1周、第2周和第4周復(fù)溶后進(jìn)行qLAMP擴(kuò)增檢測(cè)，并設(shè)置未干燥的新鮮配制qLAMP試劑為對(duì)照組。通過(guò)可視化LAMP快速檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)106個(gè)柑橘田間樣品，與常規(guī)檢測(cè)方法比較，使用Microsoft Excel軟件對(duì)不同干燥方法和存放條件的Tt值進(jìn)行線性擬合比較不同處理對(duì)qLAMP的影響。以常規(guī)提取檢測(cè)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)不同樣本通過(guò)膜吸附法結(jié)合可視化LAMP快速檢測(cè)的準(zhǔn)確率。使用MedCalc 19軟件進(jìn)行ROC曲線分析膜吸附法結(jié)合可視化LAMP快速檢測(cè)的敏感性和特異性。使用IBM SPSS 26軟件對(duì)快速檢測(cè)和常規(guī)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)表格的McNemar檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CLas LAMP檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)

CLas LAMP檢測(cè)引物A3的引物設(shè)計(jì)如圖1所示，其中CLas-F1c和CLas-StemF之間，CLas-B1c、CLas-LoopB和CLas-StemB之間有部分序列重疊。靶序列長(zhǎng)度為189 bp，引物經(jīng)過(guò)在線BLAST軟件比對(duì)到NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CLas全基因組上，未發(fā)現(xiàn)存在SNP。各引物之間通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7分析，未預(yù)測(cè)到影響較大的引物二聚體。

圖1 LAMP引物與黃龍病菌菌株A4基因組比對(duì)示意圖

進(jìn)行qLAMP后，熔解曲線呈單峰，擴(kuò)增曲線呈典型的S型動(dòng)力學(xué)曲線，指數(shù)期和平臺(tái)期明顯，為理想的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，如圖2所示。

2.2 CLas LAMP檢測(cè)引物體系的優(yōu)化

通過(guò)在LAMP反應(yīng)體系中加入不同濃度的環(huán)引物和莖引物，比較qLAMP在不同反應(yīng)條件下的Tt值，繪制Tt值隨目的片段重組質(zhì)粒濃度對(duì)數(shù)值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，篩選環(huán)引物和莖引物的最佳濃度，結(jié)果如圖3所示。單獨(dú)加入0.4 μmol·L-1莖引物的LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率最低，反應(yīng)所需時(shí)間較長(zhǎng)。其余反應(yīng)條件均有接近的擴(kuò)增效率，隨著環(huán)引物濃度增加，反應(yīng)所需時(shí)間縮短，但濃度高于1.6 μmol·L-1時(shí)提升不明顯。當(dāng)環(huán)引物和莖引物的總濃度在1.6 μmol·L-1以上時(shí)，環(huán)引物和莖引物等濃度加入反應(yīng)體系中對(duì)反應(yīng)速率的提升要高于單獨(dú)添加環(huán)引物。

以RNRf/RNRr-qPCR結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Ct值小于32時(shí)判定為陽(yáng)性，評(píng)價(jià)A3-qLAMP診斷CLas的準(zhǔn)確性。通過(guò)ROC曲線分析，ROC曲線下面積為0.995（圖4），qLAMP的最佳診斷Tt值為8.03，敏感性為100%，特異性為96.24%，說(shuō)明qLAMP檢測(cè)CLas的效果良好。

圖2 polA3-qLAMP的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖3 不同環(huán)引物和莖引物濃度下qLAMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 qLAMP診斷黃龍病菌的ROC曲線

兩種檢測(cè)方法診斷黃龍病結(jié)果的配對(duì)四格表如表2所示，qLAMP在最佳診斷Tt值下和qPCR的診斷結(jié)果一致性優(yōu)良（Kappa=0.937，＜0.001）；qLAMP的真陽(yáng)性率為91.67%，真陰性率為100%，總體準(zhǔn)確率為97.34%。經(jīng)McNemar檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法診斷結(jié)果無(wú)顯著差異（＞0.05），表明在田間檢測(cè)中可用qLAMP代替qPCR鑒定柑橘黃龍病。

表2 RNRf/RNRr-qPCR與qLAMP診斷黃龍病結(jié)果

2.3 LAMP檢測(cè)試劑的常溫干燥

通過(guò)兩步法干燥的qLAMP試劑與液態(tài)未干燥qLAMP試劑（對(duì)照試劑）的檢測(cè)效果，評(píng)價(jià)常溫干燥試劑的生物活性。Gelgreen核酸熒光染料常溫干燥后攤平黏附在管蓋內(nèi)，呈橙紅色蠟質(zhì)固體；LAMP預(yù)混液常溫干燥后聚集于管底，呈半透明膠狀固體。用于干燥L(fēng)AMP試劑復(fù)溶的溶液中含有與對(duì)照試劑相同濃度的模板。與液態(tài)未干燥qLAMP試劑相比，經(jīng)過(guò)干燥程序的常溫干燥試劑生物活性有所下降，但常溫干燥試劑在3個(gè)存放溫度條件之間，擴(kuò)增效率均沒(méi)有發(fā)生明顯變化，只有存放在高溫環(huán)境中的干燥試劑隨存放時(shí)間增加，相同濃度模板下的Tt值有所上升，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

A：在4℃存放 Stored at 4℃；B：在25℃存放 Stored at 25℃；C：在35℃存放 Stored at 35℃

用兩步法干燥L(fēng)AMP試劑和相同模板進(jìn)行Gelgreen可視化LAMP檢測(cè)，比較干燥L(fēng)AMP試劑在不同溫度存放條件下的靈敏度。如圖6所示，常溫和高溫環(huán)境下存放1周的靈敏度為102copies/μL，隨存放時(shí)間增加，常溫環(huán)境下的靈敏度沒(méi)有變化，而高溫環(huán)境下的靈敏度從第2周開(kāi)始下降為103copies/μL，低溫環(huán)境下存放1周的靈敏度為101copies/μL，在第4周下降為102copies/μL。

利用Gelgreen-可視化LAMP比較纖維素濾紙和尼龍膜（孔徑0.1 μm）快速提取DNA的效果，結(jié)果如圖7所示。以纖維素濾紙作為核酸吸附材料時(shí)，Gelgreen-可視化LAMP的靈敏度為103copies/μL，而且陰性管中的纖維素濾紙?jiān)谧贤鉄粝乱舶l(fā)出微弱的熒光；以尼龍膜（孔徑0.1 μm）作為核酸吸附材料時(shí)，Gelgreen-可視化LAMP的靈敏度為102copies/μL。

2.4 膜吸附法結(jié)合可視化LAMP快速檢測(cè)田間樣品

采用膜吸附法結(jié)合可視化LAMP快速檢測(cè)田間71個(gè)柑橘葉片樣品和35個(gè)柑橘果實(shí)樣品，驗(yàn)證黃龍病可視化LAMP檢測(cè)（快速檢測(cè)）的可行性，以DNA試劑盒法提取和RNRf/RNRr-qPCR（常規(guī)檢測(cè)）作為對(duì)照，當(dāng)Ct值小于32時(shí)判斷為陽(yáng)性。部分葉片檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，快速檢測(cè)能有效檢出不同柑橘品種和癥狀葉片中的CLas，其中斑駁型黃化葉片的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，“綠島”、缺素型黃化葉片的檢測(cè)結(jié)果既有陽(yáng)性也有陰性，對(duì)少數(shù)無(wú)明顯癥狀的葉片也能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。

同一存放條件的8個(gè)管依次加入了不同拷貝數(shù)的黃龍病菌LAMP陽(yáng)性質(zhì)粒（分別為107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL）

A：纖維素濾紙 Cellulose filter paper；B：尼龍膜 Nylon membrane。從左往右依次從含有濃度為105、104、103、102、101、100、0 copies/μL CLas β-操縱子重組質(zhì)粒的植物組織液中快速提取核酸 Nucleic acids were rapidly extracted from plant tissue extract containing CLas β-operon recombinant plasmids with concentrations of 105, 104, 103, 102, 101, 100, 0 copies/μL, respectively

快速檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法診斷黃龍病結(jié)果的配對(duì)四格表如表3所示，快速檢測(cè)和常規(guī)檢測(cè)診斷結(jié)果一致性較好（Kappa=0.867，＜0.001）；快速核酸檢測(cè)方法的真陽(yáng)性率為98.18%，真陰性率為88.24%，總體準(zhǔn)確率為93.40%。經(jīng)McNemar檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法診斷結(jié)果無(wú)顯著差異（＞0.05）。

表3 可視化LAMP快速檢測(cè)與常規(guī)檢測(cè)診斷黃龍病結(jié)果

N/A：未產(chǎn)生Ct值/未確定No Ct value or undetermined

葉片樣品共計(jì)71個(gè)，其中快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致的樣品有65個(gè)，符合率為91.55%；有一個(gè)樣品的快速檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而常規(guī)檢測(cè)結(jié)果為陰性，假陽(yáng)性率為1.41%；有5個(gè)樣品的快速檢測(cè)結(jié)果為陰性而常規(guī)檢測(cè)為陽(yáng)性，假陰性率為7.04%。其中顯癥葉片35個(gè)，無(wú)明顯癥狀葉片36個(gè)，快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致的樣品分別有33和32個(gè)，符合率分別為94.29%和88.89%，假陽(yáng)性率分別為0%（0/35）和2.78%（1/36），假陰性率分別為5.71%（2/35）和8.33%（3/36）。果實(shí)樣品共計(jì)35個(gè)，其中快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致的樣品有34個(gè)，符合率為97.14%；果實(shí)樣品的快速檢測(cè)沒(méi)有假陽(yáng)性，但有一個(gè)樣品出現(xiàn)假陰性，占所有樣品的2.86%。

膜吸附法結(jié)合可視化LAMP快速檢測(cè)每個(gè)樣品的耗材成本和耗時(shí)相比于DNA試劑盒法提取和qPCR檢測(cè)（常規(guī)檢測(cè)）都大幅度降低，其中，快速檢測(cè)的成本降低了85%，而耗時(shí)縮短了69%，具體信息如表4所示。

表4 柑橘黃龍病常規(guī)檢測(cè)與可視化LAMP快速檢測(cè)的耗材成本（元/樣本）與步驟耗時(shí)（分鐘/樣本）比較

*各試劑耗材成本的價(jià)格參考銳競(jìng)科研采購(gòu)平臺(tái)（https://www.rjmart.cn/）在2021年3月的數(shù)據(jù)所得

*The prices of the consumables are based on data from the Reagent Procurement Platform (https://www.rjmart.cn/) in March 2021

3 討論

3.1 環(huán)引物與莖引物/群引物聯(lián)用顯著提升LAMP擴(kuò)增效率

常規(guī)的四引物L(fēng)AMP由于反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，目前研究者更青睞于設(shè)計(jì)環(huán)引物、莖引物或者是群引物加快反應(yīng)速率[21-23]。通常情況下，F(xiàn)2和B2在目的片段上的距離應(yīng)在120—160 bp，但在該條件下會(huì)造成F1和B1的距離過(guò)短，難以在F1和B1之間設(shè)計(jì)莖引物[24]。因此，本研究通過(guò)將StemF和F1c共用部分序列，LoopB、B1c和StemB共用部分序列，這些共用部分序列的引物有著相同的延伸方向，理論上不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，繞開(kāi)了環(huán)引物和莖引物設(shè)計(jì)在空間不足上的限制。從圖1可以看出，在靶序列F1和B1區(qū)域之間僅有9 bp的距離下設(shè)計(jì)了共33 bp的莖引物，根據(jù)莖引物（結(jié)合在F1和B1之間的“莖”上）和群引物（結(jié)合在F1、B1上或者附近）的定義[22-23]，本研究的莖引物在定義上更接近為群引物，兩者的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。Khorosheva等[25]通過(guò)數(shù)字單分子LAMP進(jìn)行引物設(shè)計(jì)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)加入環(huán)引物能提高LAMP的靈敏度，而LAMP的反應(yīng)速率與靈敏度之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，加入環(huán)引物、莖引物以及增加其濃度均能促進(jìn)反應(yīng)速率的提升，但反應(yīng)速率的提升并不能帶來(lái)較大的靈敏度提升。另一方面，環(huán)引物對(duì)反應(yīng)速率的提升會(huì)隨著自身濃度的升高而縮小，而莖引物對(duì)反應(yīng)速率的提升不如環(huán)引物，但在自身濃度較高的情況下繼續(xù)增加濃度依然能提高一定的反應(yīng)速率，與Martineau等[23]的結(jié)論比較吻合，說(shuō)明在低引物濃度下，環(huán)引物濃度的影響更大；而高引物濃度下，莖引物濃度的影響更大。雖然Qian等[9]在進(jìn)行可視化LAMP檢測(cè)時(shí)由于高濃度高長(zhǎng)度引物形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，在常溫下出現(xiàn)強(qiáng)烈的背景信號(hào)，但在本研究中，即使加入了高濃度的環(huán)引物和莖引物，紫外燈下的陰性管也未見(jiàn)有熒光信號(hào)，說(shuō)明高濃度高長(zhǎng)度的引物不是導(dǎo)致有二級(jí)結(jié)構(gòu)的原因，應(yīng)該在引物設(shè)計(jì)時(shí)就避免引物二聚體或“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

3.2 DNA提取是制約可視化LAMP準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟

總體來(lái)看，膜吸附法的DNA得率較低和DNA聚合酶抑制劑殘留是造成黃龍病快速診斷出現(xiàn)假陰性的主要原因。由于黃龍病菌寄生在韌皮部組織中[26]，要獲取黃龍病菌的DNA需要將植物和細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜都徹底裂解，而膜吸附法中省略了65℃恒溫孵育的步驟，對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的裂解不夠徹底，使得DNA的提取效率較低。本研究后續(xù)可以進(jìn)一步探討尼龍膜的不同孔徑對(duì)PCR或LAMP反應(yīng)的影響，開(kāi)發(fā)DNA吸附或提取效果更好的膜材料；嘗試提高PCR或LAMP反應(yīng)體系的體積，從而相對(duì)減少核酸吸附膜材料本身和提取試劑殘留對(duì)DNA聚合酶活性的影響。Gelgreen可視化LAMP結(jié)合膜吸附法的靈敏度稍低于結(jié)合常規(guī)提取，為102copies/μL，但基本滿足田間檢測(cè)的需要。后續(xù)可以通過(guò)設(shè)計(jì)引物變體來(lái)進(jìn)行檢出限測(cè)定，進(jìn)一步提高引物A3的靈敏度，或者基于黃龍病菌基因組的、和等高拷貝數(shù)基因設(shè)計(jì)引物[19,27]。

3.3 兩步法干燥有效提升LAMP試劑穩(wěn)定性

Hayashida等[28]使用兩步法干燥和羥基溴酚藍(lán)（HNB）、Evagreen雙指示劑法，先將指示劑、引物和海藻糖混合放置在管蓋干燥，再將dNTPs、聚合酶和海藻糖混合放置在管底干燥，做成LAMP干燥試劑用于人類非洲錐蟲(chóng)病的快速檢測(cè)；Diego等[20]使用一步法干燥L(fēng)AMP反應(yīng)試劑，發(fā)現(xiàn)一步法干燥試劑在室溫存放1個(gè)月后完全喪失了反應(yīng)活性。本研究結(jié)果表明，兩步法干燥的LAMP試劑在不同溫度存放1—4周均能保持反應(yīng)活性基本不變，說(shuō)明干燥L(fēng)AMP試劑檢測(cè)性能較好，在低溫和常溫環(huán)境下的穩(wěn)定性尚可，僅35℃高溫存放會(huì)略微增加LAMP試劑的反應(yīng)時(shí)間。本研究通過(guò)真空濃縮儀獲得的干燥試劑外觀為黏附在管底的透明膠狀沉淀，而張建中[29]通過(guò)冷凍干燥器制備的PCR凍干試劑呈白色光滑小球，擴(kuò)增效率與未干燥的PCR反應(yīng)體系相比基本一致，說(shuō)明凍干試劑沒(méi)有受到干燥過(guò)程的影響，但是冷凍干燥的制備復(fù)雜，儀器成本高，較難推廣應(yīng)用于田間檢測(cè)。

3.4 LAMP快速檢測(cè)橘絡(luò)組織有更高的準(zhǔn)確率

受限于膜吸附法提取技術(shù)存在DNA損失和DNA聚合酶抑制劑殘留的問(wèn)題，可視化LAMP快速檢測(cè)柑橘葉片診斷黃龍病會(huì)有較大的假陰性率（7.04%），但對(duì)于柑橘果實(shí)則有較高的準(zhǔn)確率（97.14%），這是因?yàn)楸驹囼?yàn)所用到的柑橘果實(shí)主要從表現(xiàn)黃龍病相關(guān)癥狀的枝條上采摘，在同一感染黃龍病的帶果枝條上，果實(shí)橘絡(luò)中的黃龍病菌濃度往往高于其他部位，其濃度可達(dá)葉中脈的26倍，果實(shí)橘絡(luò)也被認(rèn)為具有富集黃龍病菌的作用[30-31]。另外，果實(shí)橘絡(luò)的木質(zhì)化程度低于葉中脈，組織纖細(xì)柔軟，便于研磨，使植物細(xì)胞裂解更加充分。因此，筆者建議采用果實(shí)橘絡(luò)作為可視化LAMP快速檢測(cè)的DNA提取部位，避免發(fā)生葉中脈中的黃龍病菌濃度或DNA得率較低而出現(xiàn)假陰性的情況。

3.5 膜吸附法結(jié)合可視化LAMP有較大的田間應(yīng)用潛力

由表4可知，可視化LAMP快速檢測(cè)相較常規(guī)檢測(cè)有著更低的成本和更短的耗時(shí)；其次，可視化LAMP快速檢測(cè)的DNA提取和DNA擴(kuò)增步驟無(wú)需離心機(jī)和PCR儀等昂貴的儀器，DNA擴(kuò)增步驟僅需一臺(tái)65℃恒溫設(shè)備即可進(jìn)行；最后，LAMP預(yù)混液的干燥延長(zhǎng)了試劑在常溫下的穩(wěn)定性，在減少運(yùn)輸和儲(chǔ)存成本的同時(shí)，也減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟及其帶來(lái)的交叉污染問(wèn)題。因此，可視化LAMP快速檢測(cè)技術(shù)非常適合在基礎(chǔ)設(shè)施較落后的地區(qū)進(jìn)行黃龍病田間檢測(cè)。

4 結(jié)論

應(yīng)用膜吸附法結(jié)合可視化LAMP建立的柑橘黃龍病快速鑒定技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在柑橘黃龍病的田間快速診斷中發(fā)揮作用，可為柑橘黃龍病菌檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

[1] 羅志達(dá), 葉自行, 許建楷, 胡桂兵. 柑桔黃龍病的田間診斷方法. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(3): 91-93.

LUO Z Z, YE Z X, XU J K, HU G B. Field diagnostic methods for citrus Huanglongbing. Guangdong Agricultural Sciences, 2009(3): 91-93. (in Chinese)

[2] 許美容, 陳燕玲, 鄧曉玲. 柑橘黃龍病癥狀與“Liberibacter asiaticus” PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析. 植物病理學(xué)報(bào), 2016, 46(3): 367-373.

XU M R, CHEN Y L, DENG X L. Correlationships between symptoms of citrus Huanglongbing and PCR detection of ‘Liberibacter asiaticus’. Acta Phytopathologica Sinica, 2016, 46(3): 367-373. (in Chinese)

[3] FREEMAN W M, WALKER S J, VRANA K E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques, 1999, 26(1): 112-122, 124-125.

[4] 廖曉蘭, 朱水芳, 趙文軍, 羅寬, 漆艷香, 陳紅運(yùn), 何昆, 朱曉湘. 柑桔黃龍病病原16S rDNA克隆、測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2004, 12(1): 80-85.

LIAO X L, ZHU S F, ZHAO W J, LUO K, QI Y X, CHEN H Y, HE K, ZHU X X. Cloning and sequencing of citrus Huanglongbing pathogen 16S rDNA and its detection by real-time fluorescent PCR. Journal of Agricultural Biotechnology, 2004, 12(1): 80-85. (in Chinese)

[5] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, YONEKAWA T, WATANABE K, AMINO N, HASE T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 2000, 28(12): e63.

[6] OKUDA M, MATSUMOTO M, TANAKA Y, SUBANDIYAH S, IWANAMI T. Characterization of theB-E-G-KAJL-B gene cluster of the citrus greening organism and detection by loop-mediated isothermal amplification. Plant disease, 2005, 89(7): 705-711.

[7] CHOI C W, HYUN J W, HWANG R Y, POWELL C A. Loop- mediated isothermal amplification assay for detection of ‘Liberibacter asiaticus’, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal, 2018, 34(6): 499-505.

[8] 丁鵬, 盧占軍, 黃愛(ài)軍, 蘇華楠, 劉映雪, 周承華, 鄒俊丞, 黃玉玲. 柑桔黃龍病菌LAMP檢測(cè)制樣方法比較. 中國(guó)南方果樹(shù), 2018, 47(1): 12-16.

DING P, LU Z J, HUANG A J, SU H N, LIU Y X, ZHOU C H, ZOU J C, HUANG Y L. Comparison of LAMP methods for detection of citrus Huanglongbing pathogen. South China Fruits, 2018, 47(1): 12-16. (in Chinese)

[9] QIAN W J, MENG Y Q, LU Y, WU C, WANG R, WANG L, QIAN C, YE Z Z, WU J, YING Y B. Rapid, sensitive, and carryover contamination-free loop-mediated isothermal amplification-coupled visual detection method for ‘Liberibacter asiaticus’. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(38): 8302-8310.

[10] GHOSH D K, BHOSE S, WARGHANE A, MOTGHARE M, SHARMA A K, DHAR A K, GOWDA S. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) based method for rapid and sensitive detection of ‘Liberibacter asiaticus’ in citrus and the psyllid vector,Kuwayama. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 2016, 25(2): 219-223.

[11] WU X H, MENG C L, WANG G H, LIU Y Z, ZHANG X, YI K X, PENG J. Rapid and quantitative detection of citrus Huanglongbing bacterium ‘Liberibacter asiaticus’ by real-time fluorescent loop-mediated isothermal amplification assay in China. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2016, 94: 1-7.

[12] KEREMANE M L, RAMADUGU C, RODRIGUEZ E, KUBOTA R, SHIBATA S, HALL D G, ROOSE M L, JENKINS D, LEE R F. A rapid field detection system for citrus Huanglongbing associated ‘Liberibacter asiaticus’ from the psyllid vector,Kuwayama and its implications in disease management. Crop Protection, 2015, 68: 41-48.

[13] 王賢達(dá), 林雄杰, 胡菡青, 王宗華, 范國(guó)成. 柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2014, 35(5): 918-924.

WANG X D, LIN X J, HU H Q, WANG Z H, FAN G C. Establishment and application of visual loop-mediated amplification assay on citrus Huanglongbing. Chinese Journal of Tropical Crops, 2014, 35(5): 918-924. (in Chinese)

[14] 程保平, 趙弘巍, 彭埃天, 陳霞, 宋曉兵, 凌金鋒. 以基因?yàn)榘袠?biāo)的3種檢測(cè)方法對(duì)柑橘黃龍病菌檢測(cè)效果比較. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 41(5): 141-145.

CHENG B P, ZHAO H W, PENG A T, CHEN X, SONG X B, LING J F. Comparative study on citrus Huanglongbing molecular detection methods with thetarget gene. Guangdong Agricultural Sciences, 2014, 41(5): 141-145. (in Chinese)

[15] 孔德英, 孫濤, 李應(yīng)國(guó), 滕少娜, 陸麗華, 鄧朝暉. 柑桔黃龍病LAMP快速檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)南方果樹(shù), 2013, 42(1): 8-11.

KONG D Y, SUN T, LI Y G, TENG S N, LU L H, DENG C H. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Huanglongbing. South China Fruits, 2013, 42(1): 8-11. (in Chinese)

[16] 彭軍, 廖孝文, 楊海中, 曾凡云, 龍海波, 裴月令, 郭建榮. 柑桔黃龍病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法建立及應(yīng)用. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2013, 34(10): 1998-2003.

PENG J, LIAO X W, YANG H Z, ZENG F Y, LONG H B, PEI Y L, GUO J R. Rapid detection of citrus Huanglongbing using a LAMP method. Chinese Journal of Tropical Crops, 2013, 34(10): 1998-2003. (in Chinese)

[17] 黃麗, 蘇華楠, 唐科志, 黃愛(ài)軍, 周常勇, 李中安. 柑橘黃龍病LAMP快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2012, 29(6): 1121-1126, 1155.

HUANG L, SU H N, TANG K Z, HUANG A J, ZHOU C Y, LI Z A. Establishment and application of loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of citrus Huanglongbing. Journal of Fruit Science, 2012, 29(6): 1121-1126, 1155. (in Chinese)

[18] 王華堂, 曾鑫年, 薛培培, 楊柳. Direct-PCR檢測(cè)柑橘黃龍病的快速制樣方法研究. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2014, 31(4): 733-738.

WANG H T, ZENG X N, XUE P P, YANG L. Research on DNA extraction methods for Direct-PCR detection of citrus Huanglongbing. Journal of Fruit Science, 2014, 31(4): 733-738. (in Chinese)

[19] ZHENG Z, XU M R, BAO M L, WU F N, CHEN J C, DENG X L. Unusual five copies and dual forms ofin ‘Liberibacter asiaticus’: biological implications and PCR detection application. Scientific Reports, 2016, 6: 39020.

[20] DIEGO J G, FERNáNDEZ-SOTO P, CREGO-VICENTE B, ALONSO-CASTRILLEJO S, FEBRER-SENDRA B, GóMEZ- SáNCHEZ A, VICENTE B, LóPEZ-ABáN J, MURO A. Progress in loop-mediated isothermal amplification assay for detection ofDNA: towards a ready-to-use test. Scientific reports, 2019, 9: 14744.

[21] NAGAMINE K, HASE T, NOTOMI T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and cellular probes, 2002, 16(3): 223-229.

[22] GANDELMAN O, JACKSON R, KIDDLE G, TISI L. Loop- mediated amplification accelerated by stem primers. International Journal of Molecular Sciences, 2011, 12(12): 9108-9124.

[23] MARTINEAU R L, MURRAY S A, CI S F, GAO W M, CHAO S H, MELDRUM D R. Improved performance of loop-mediated isothermal amplification assays via swarm priming. Analytical Chemistry, 2017, 89(1): 625-632.

[24] TOMITA N, MORI Y, KANDA H, NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature protocols, 2008, 3(5): 877-882.

[25] KHOROSHEVA E M, KARYMOV M A, SELCK D A, ISMAGILOV R F. Lack of correlation between reaction speed and analytical sensitivity in isothermal amplification reveals the value of digital methods for optimization: validation using digital real-time RT-LAMP. Nucleic Acids Research, 2016, 44(2): e10.

[26] ACHOR D, WELKER S, BEN-MAHMOUD S, WANG C X, FOLIMONOVA S Y, DUTT M, GOWDA S, LEVY A. Dynamics of ‘Liberibacter asiaticus’ movement and sieve-pore plugging in citrus sink cells. Plant Physiology, 2020, 182(2): 882-891.

[27] BAO M, ZHENG Z, SUN X, CHEN J, DENG X. Enhancing PCR capacity to detect ‘Liberibacter asiaticus’ utilizing whole genome sequence information. Plant disease, 2020, 104(2): 527-532.

[28] HAYASHIDA K, KAJINO K, HACHAAMBWA L, NAMANGALA B, SUGIMOTO C. Direct blood dry LAMP: A rapid, stable, and easy diagnostic tool for human African trypanosomiasis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2015, 9(3): e0003578.

[29] 張建中. 應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)的核酸提取與擴(kuò)增試劑冷凍干燥研究[D]. 廈門(mén): 廈門(mén)大學(xué), 2019.

ZHANG J Z. Study on freeze-drying of reagents for nucleic acid extraction and amplification in point of care testing[D]. Xiamen: Xiamen University, 2019. (in Chinese)

[30] 郭亨玉, 羅小玲, 李桃, 鄧曉玲, 鄭正. 柑橘黃龍病菌在染病貢柑枝條和果實(shí)橘絡(luò)內(nèi)的分布規(guī)律. 植物病理學(xué)報(bào), 2020, 50(5): 543-548.

GUO H Y, LUO X L, LI T, DENG X L, ZHENG Z. Distribution of ‘Liberibacter asiaticus’ in Huanglongbing-affectedBlanco cv. Gongkan branches and the fruit pith. Acta Phytopathologica Sinica, 2020, 50(5): 543-548. (in Chinese)

[31] 李桃, 鄭正, 鄧曉玲. 離體砂糖橘黃龍病病果中病菌濃度變化規(guī)律的探究. 植物病理學(xué)報(bào), 2021, 51(2): 298-302.

LI T, ZHENG Z, DENG X L. Quantitative analysis of ‘Liberibacter asiaticus’ in the excised citrus fruits. Acta Phytopathologica Sinica, 2021, 51(2): 298-302. (in Chinese)

Detection of ‘Liberibacter asiaticus’ by membrane adsorption method combined with visual loop-mediated isothermal amplification

LI ZhenXi, LI WenTing, HUANG JiaQuan, ZHENG Zheng, XU MeiRong, DENG XiaoLing

College of Plant Protection, South China Agricultural University, Guangzhou 510642

【】Citrus Huanglongbing (HLB) is a citrus disease caused by ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas). The main approaches to control HLB include plant quarantine, establishing disease-free nurseries, removing disease trees, and concentrating on large area joint control of citrus psyllids (). The first three methods all rely on accurate HLB diagnosis techniques.【】The objective of this study is to establishment of a rapid and handy field/laboratory nucleic acid detection method of CLas using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with membrane adsorption rapid DNA extraction and Gelgreen fluorescence dye visualization.【】The LAMP primers were designed using the-operon and the prophage DNA polymerase gene of CLas as templates, including outer primer F3/B3, inner primer FIP/BIP, loop primer LoopF/LoopB and stem primer StemF/StemB. The LAMP primer set was optimized by setting different dosage combinations for loop primers and stem primers to determine the appropriate primer concentration. A total of 188 field citrus leaves were detected using the optimized LAMP primer set, and the receiver operating characteristic (ROC) curves were constructed to analyze the accuracy of real-time fluorescent LAMP (qLAMP) for CLas detection. The qLAMP premixed reaction solution was dried in two steps at room temperature, storage temperature (4, 25 and 35℃) and storage time (1, 2 and 4 weeks) were also set to assess the enzyme activity stability of the dry LAMP reagent. Using dry LAMP reagent, combined with membrane adsorption rapid DNA extraction technique in this study, 71 citrus leaf samples and 35 citrus fruit samples collected in the field were detected, while the detection results of real-time fluorescent quantitative (qPCR) were used as controls to compare the coincidence rates of the two detection methods.【】The addition of loop primer, stem primer or increasing their concentrations in LAMP reaction could promote the increase of reaction rate, and the addition of both loop primer and stem primer at a final concentration of 1.6 μmol·L-1could further improve the reaction rate. The reaction activity of LAMP premix could be maintained unchanged by two-step drying at different temperatures for 1-4 weeks, indicating that the two-step drying LAMP reagent prepared in this experiment had good detection performance and fair stability at low and room temperatures, and only at 35℃ storage would slightly increase the reaction time of LAMP reagent. Using 0.1 μm pore size nylon membrane instead of cellulose filter paper as nucleic acid adsorption material could improve the sensitivity of rapid diagnostic techniques. The overall accuracy of rapid DNA diagnosis for HLB established by combining rapid DNA extraction and visual LAMP was high, and the lowest detectable plasmid concentration was 102copies/μL. The diagnostic results of this method were not significantly different from those of qPCR by paired Chi-square test. Thevisual LAMP rapid detection was less cost and time-consuming than routine detection, and visual LAMP rapid detection required no expensive instruments such as centrifuges and PCR instruments, requiring only a 65℃ thermostatic device.【】The rapid DNA detection method for CLas established in this study has low cost and can observe detection results in 30 min, easy to operate and high accuracy, which can replace qPCR for rapid identification of HLB in the field.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas); field detection; membrane adsorption; rapid DNA extraction; visual LAMP

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.007

2021-06-03；

2021-07-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201500）、廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專項(xiàng)（桂科AA18118046）、廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（2019B020217003）

李鎮(zhèn)希，E-mail：554706824@qq.com。通信作者鄧曉玲，E-mail：xldeng@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）