基于轉(zhuǎn)錄組分析ABA促進葡萄花青苷積累相關(guān)基因

徐獻斌，耿曉月，李慧，孫麗娟，鄭煥，陶建敏

基于轉(zhuǎn)錄組分析ABA促進葡萄花青苷積累相關(guān)基因

徐獻斌，耿曉月，李慧，孫麗娟，鄭煥，陶建敏

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095

【】分析參與調(diào)控ABA促進葡萄著色的相關(guān)基因，探討ABA促進葡萄果實花青苷積累的分子機制。以‘紅巴拉多’葡萄為試材,在轉(zhuǎn)色前期（約花后6周）使用300 mg?L-1ABA對果穗進行浸果處理，以清水處理為對照。觀察表型，并利用超高液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）測定花青苷組分及含量，再利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從分子水平對ABA促進花青苷積累的機制進行生物信息學(xué)分析。外源ABA處理3 d后，葡萄果實著色明顯加深，花青苷種類和含量增多，其中芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷兩種單體花青苷含量增加最為顯著。分析ABA處理18 h和3 d后葡萄果實轉(zhuǎn)錄水平的差異，并通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)了11個ABA信號通路基因以及52個與花青苷生物合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因差異表達，它們均在外源ABA處理后表達上調(diào)。通過將差異基因與葡萄轉(zhuǎn)錄因子庫進行比對，共發(fā)現(xiàn)297個轉(zhuǎn)錄因子差異表達。進一步分析差異轉(zhuǎn)錄因子表達模式，篩選與表達模式相近的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)15個MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的轉(zhuǎn)錄因子，其可能參與調(diào)控花青苷生物合成。啟動子順式作用元件分析表明，大部分篩選到的差異基因啟動子中含有ABRE元件，說明這些差異表達基因的啟動子可能為ABA誘導(dǎo)型啟動子。對部分候選基因的表達模式進行實時熒光定量（qRT-PCR）分析,證實了RNA-seq的準(zhǔn)確性。ABA促進葡萄花青苷積累涉及11個ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、52個花青苷合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因，15個轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控了這一生物過程。研究結(jié)果為揭示ABA促進葡萄花青苷積累的分子機制提供了一定基礎(chǔ)。

葡萄；花青苷；ABA；轉(zhuǎn)錄組；啟動子

0 引言

【研究意義】葡萄（L）是一種全球廣泛栽培的水果作物，可用于鮮食、釀酒、加工、制汁等，其中鮮食葡萄占有較大比重（約30%）[1]。在我國南方地區(qū)避雨栽培模式下，一些紅色或黑色品種的葡萄果實，常常因為溫度高或光照不足難以著色。果實顏色是衡量鮮食葡萄商業(yè)價值的重要指標(biāo)，成熟期的果實著色不佳嚴(yán)重影響葡萄的經(jīng)濟價值。在許多鮮食葡萄品種中，外源使用ABA能有效促進葡萄果實著色已得到證實，但其潛在的分子機理尚不清楚[2-4]。因此，探究ABA促進葡萄果實著色分子機制，可為生產(chǎn)上外源使用ABA提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】前人研究表明，ABA是調(diào)控非呼吸躍變型果實成熟的重要激素，內(nèi)源ABA含量在果實始熟期開始快速上升，在果實糖分積累、軟化、著色等過程中起著關(guān)鍵作用[5]。研究表明，外源ABA處理使葡萄提早成熟，顯著促進葡萄的著色，且不會明顯影響可溶性固形物、可滴定酸等果實品質(zhì)[3-4,6]。也有學(xué)者認(rèn)為，外源ABA不僅可以促進葡萄果實著色，同時可以提高葡萄的內(nèi)在品質(zhì)[7-8]。ABA對葡萄果實品質(zhì)產(chǎn)生不同影響的原因可能是外源ABA的濃度、施用方式以及葡萄品種的不同。但可以證實的是，ABA能促進葡萄果實著色，提高果實的外觀品質(zhì)。在生理水平上，研究者們對外源ABA促進葡萄著色的機理開展了一些研究。外源ABA處理后，果實內(nèi)源ABA含量提高，內(nèi)源乙烯合成增加，改變了ABA、乙烯、吲哚乙酸、赤霉素、玉米素核苷等之間的動態(tài)平衡關(guān)系，從而促進果實花青苷合成和果實著色[9]。在分子水平上，有一些研究從基因角度探究ABA促進葡萄著色的機理。外源ABA通過上調(diào)、、、、、、等類黃酮通路結(jié)構(gòu)基因和、等轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，促進花青苷的生物合成[10-11]。Gao等[12]證實了ABA受體基因在‘巨峰’葡萄中瞬時過表達可以促進花青苷積累?！颈狙芯壳腥朦c】盡管前人對ABA促進葡萄果皮花青苷積累方面進行了大量研究，但ABA促進花青苷生物合成是一個涉及許多基因的復(fù)雜過程，其相關(guān)的分子機制仍不明確。通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法逐一地對這一生物合成過程涉及的大量基因進行研究，不僅效率低，而且難度大。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）能夠全面、快速地分析ABA促進花青苷合成相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘紅巴拉多’葡萄為試材,在轉(zhuǎn)色前期使用ABA處理，選取關(guān)鍵時期進行轉(zhuǎn)錄組測序。深入研究與花青苷合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在ABA處理后的表達模式，并且篩選可能參與調(diào)控ABA促進花青苷積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，以全面地了解ABA促進葡萄花青苷合成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表達模式，為ABA促進花青苷積累的分子機制研究奠定基礎(chǔ)，同時為生產(chǎn)上外源使用ABA促進葡萄著色提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄基地進行。

1.1 試驗材料

選用‘紅巴拉多’葡萄為試驗材料，選擇樹體長勢一致的植株，樹形為平棚架型，栽培管理等同常規(guī)。

果實的轉(zhuǎn)色前期（花后第6周），在預(yù)試驗基礎(chǔ)上選用300 mg?L-1ABA（上海源葉）對‘紅巴拉多’葡萄果穗進行浸果處理，以清水處理為對照。處理后24 h內(nèi)每隔6 h取樣一次，處理后3 d（出現(xiàn)明顯表型差異）取樣一次。將所取樣品用手術(shù)刀片剝?nèi)」?，液氮速凍?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花青苷的提取及定性分析

總花青苷的提取參照J(rèn)ia等[13]的方法并加以改進。取待測定的葡萄果皮樣品，用液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含1%鹽酸的甲醇溶液，4℃黑暗條件下靜置24 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提兩次，合并上清液，用0.22 μm濾膜過濾后合并上清液待測。

使用AB SCIEX Triple TOF 5600+液質(zhì)聯(lián)用儀測定花青苷的組分及相對含量，參照Zhang等[14]的方法并加以改進。流動相A泵溶液：0.1%甲酸水溶液；B泵溶液：0.1%乙腈。洗脫條件：流動相洗脫梯度：0—0.5 min，5% B；0.5—20.5 min，5%—40% B；0.5—22.5 min，40%—95% B。流速：0.2 mL?min-1。進樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：使用正離子模式下的電噴霧源和質(zhì)譜采集模式，選擇的質(zhì)量范圍為50—1 200 m/z。使用亮氨酸腦啡肽（m/z 556.2771）重新校準(zhǔn)，啟用鎖定質(zhì)量選項。電離參數(shù)為：毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐電壓40 V，源溫度120℃、脫溶氣體溫度為400℃。

采用外標(biāo)法對花青苷組分進行相對定量：配制0.02—20 ng·mL-1不同濃度的錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9986，回歸方程為=1E+06-245385。

1.3 ABA含量測定

ABA的提取和測定參照Hu等[15]的方法并加以改進。取待測定的葡萄果皮樣品，用液氮研磨成粉末，稱取1.0 g樣品粉末，加入10 mL含80%的甲醇溶液，4℃黑暗條件下靜置12 h，10 000 r/min高速離心10 min，沉淀反復(fù)浸提兩次，合并上清液，加入0.2 g PVPP，在4℃恒溫?fù)u床中120 r/min振蕩1 h,離心后取上清液過C18小柱，使用冷凍干燥器凍干48 h，再加入1 mL 80%的甲醇溶解，用0.45 μm濾膜過濾后合并上清液待測。

HPLC條件：所用儀器為3200 Qtrap高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX），色譜柱：phenomenex Kinetex? XB-C18（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流動相：A泵溶液：0.1%甲酸水溶液，B泵溶液：甲醇。洗脫條件：0—1 min，5% B；1—4 min，5% B—95% B；4—8 min，95% B；8—8.1 min，95% B—5% B。流速：0.3 mL· min-1；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：在MRM模式下，用電噴霧電離ESI負(fù)離子模式，離子源：Turbo Spray，氣簾氣CUR：25，離子源噴霧電壓IS：-4 500 kV，溫度TEM：500℃，噴霧氣GS1：45，輔助加熱氣GS2：30，碰撞氣CAD：Medium，入口電壓EP：-10 V，碰撞單元出口電位CEP：-18.37，出口電壓CXP：-2.2 V。

精確配制5—1 000 ng·mL-1不同濃度的ABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.99913，回歸方程為=127.22+145.81。

1.4 總RNA提取、cDNA文庫建立及測序

總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，China），所有操作按照說明書進行。取2 μL RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA樣品的質(zhì)量。用Nanodrop ND-1000超微量分光光度計檢測RNA濃度。

使用NEBNext? UltraTMRNA文庫制備試劑盒（NEB，USA）建立測序文庫。使用Qubit 2.0熒光儀和Agilent 2100生物分析儀檢查cDNA文庫質(zhì)量。檢測合格的cDNA文庫在Illumina Hiseq平臺上測序。每個樣品進行3次生物學(xué)重復(fù)。將原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除接頭污染、未知堿基N含量過高和低質(zhì)量序列后，獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)（clean reads）。

1.5 葡萄參考基因組比對及基因功能注釋

利用HISAT2將clean reads與葡萄參考基因組（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/003/745/GCF_000003745.3_12X/GCF_000201 003745.3_12X_genomic.fna.gz）進行比對。計算每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments（FPKM值），用RSEM工具檢測基因和轉(zhuǎn)錄表達水平，用DEseq2檢測差異表達基因（DEGs）。篩選差異基因的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）閾值設(shè)為≤0.05。差異基因基于NCBI非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫（Nr，http://ftpprivate.ncbi.nlm.nih.gov）、Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（GO，http://www.geneology. org/）、KEGG Ortholog數(shù)據(jù)庫（KEGG，http://www. genome.jp/kegg/）進行基因功能注釋。

1.6 差異表達基因富集分析

根據(jù)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）的注釋結(jié)果和官方分類，分別對差異基因的功能和生物學(xué)途徑進行分類。用Blast2Go進行GO富集分析，-value（adj）≤0.05。采用兩種統(tǒng)計檢驗（hypergeometric Fisher’s exact test，＜0.01）進行統(tǒng)計分析，以確定KEGG途徑在統(tǒng)計學(xué)上的顯著富集。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子(TF)分析及啟動子順式作用元件分析

將差異基因與葡萄轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb. cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi）進行比對，獲取差異表達的轉(zhuǎn)錄因子以進行進一步篩選。

利用TBtools（http://www.tbtools.com/）軟件和葡萄全基因組序列提取候選差異基因上游2 kb啟動子序列，上傳到plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進行順式作用元件分析。

1.8 qRT-PCR分析

qRT-PCR引物使用Beacon Designer 7.0軟件（Premier Biosoft Internaition，USA）設(shè)計，引物見表1。所有引物均用PCR擴增、電泳和溶解曲線進行測試以保證引物特異性。使用ABI-7300系統(tǒng)進行qRT-PCR，反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix（Takara）試劑盒說明書進行。以為內(nèi)參，用2-ΔΔCT公式計算相對表達量[16]。

表1 熒光定量PCR引物設(shè)計序列

2 結(jié)果

2.1 ABA處理后‘紅巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和組分分析

如圖1所示，外源ABA處理3 d后，‘紅巴拉多’葡萄外觀出現(xiàn)了明顯的變化，果皮呈現(xiàn)紅色。UPLC-MS結(jié)果顯示，與對照組相比，ABA處理組葡萄果皮的總花青苷含量約為對照的9倍，表明ABA處理顯著提高了葡萄的總花青苷含量。對照組葡萄果皮中只有飛燕草素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷3種花青苷，且含量很低。與對照組相比，ABA處理組增加了3種花青苷，分別是矮牽牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷），但含量并不高。但ABA處理顯著增加了芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷的含量，ABA處理組的含量分別約為對照組的12倍和9倍（表2）。

圖1 外源ABA處理3 d后‘紅巴拉多’葡萄表型

2.2 VvNCED1表達模式分析及內(nèi)源ABA含量測定

qRT-PCR結(jié)果顯示，ABA處理后24 h內(nèi)的表達隨著處理時間表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢；其在處理后18 h達到峰值，隨后逐漸下降（圖2）。此外，ABA處理后相對表達水平顯著高于對照，說明葡萄果皮中受到ABA的誘導(dǎo)迅速上調(diào)表達（圖2）。

表2 外源ABA處理對‘紅巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和組分的影響

**表示差異極顯著（＜0.01）

** indicate extremely significant difference (＜0.01)

對葡萄果皮ABA含量進行HPLC-MS分析，結(jié)果表明ABA處理顯著提高了果皮中ABA含量。在處理后18 h，ABA處理組果皮ABA含量約為對照組的1.7倍，而在處理后3 d則為對照的6.2倍（圖3）。

*和**分別表示同期處理與對照在0.05和0.01水平存在顯著性差異。下同

圖3 葡萄果皮ABA含量

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeq高通量測序平臺對已構(gòu)建好的12個cDNA文庫進行測序,得到4 135.2—4 852.8萬條不同數(shù)目的原始序列。數(shù)據(jù)過濾后得到4 005.4— 4 733.7萬條有效序列，有效比例96.19%—97.87%。與葡萄參考基因組比對后得到3 578.7萬—4 225.3萬條匹配的序列，比對率為94.3%—95.33%。通常質(zhì)量控制參數(shù)Q30＞80%表示轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可靠,本試驗中Q30＞94.3%表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量很高,可用于ABA處理后葡萄果皮差異表達基因的挖掘及對ABA促進葡萄果實著色機制的探討（表3）。

表3 轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計

將處理后18 h和處理后3 d兩個時期的ABA處理組和對照組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比對分析，分別獲得5 439和2 717個差異表達基因。在處理后18 h，共計2 897個基因表達上調(diào)，2 542個基因表達下調(diào)；在處理后3 d，共計1 336個基因表達上調(diào)，1 381個基因表達下調(diào)（圖4）。

2.4 KEGG富集分析

為了進一步分析預(yù)測差異基因的生物功能，對ABA 18 h vs CK 18 h和ABA 3 d vs CK 3 d兩組差異基因進行了KEGG富集分析，分別有2 529個差異基因富集到118個通路、1 335個差異基因富集到113個通路上。如圖5所示，黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成以及植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在兩組差異基因的KEGG分析中顯著富集。

圖4 不同時期的差異表達基因

2.5 ABA信號通路差異表達基因分析

差異表達基因在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中注釋分析，獲得植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（KEGGID：vvi04075）中ABA信號通路的差異基因。11個差異表達基因中有1個基因被注釋為ABA受體（PYL/PYR），5個被注釋為2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、3個基因被注釋為SnRK2激酶、2個基因被注釋為ABRE元件結(jié)合因子（AREB/ABFs）。通過繪制熱圖對差異表達基因在兩個時期的表達水平進一步分析（圖6），結(jié)果顯示，ABA受體基因表達水平在ABA處理后18 h上調(diào)，在ABA處理后3 d下調(diào)。除外的其他10個ABA信號通路基因表現(xiàn)出相似的表達模式，與對照相比，差異基因的表達水平在ABA處理后18 h和3 d均上調(diào)。與ABA處理3 d后相比，ABA處理18 h后，表達水平較高，表達水平較低。

圖5 差異基因KEGG富集分析氣泡圖

顏色代表相應(yīng)的FPKM數(shù)值，數(shù)值越大，顏色越紅；從左到右樣本依次為CK-18 h、ABA-18 h、ABA-3 d、CK-3 d、ABA-3 d。下同

2.6 花青苷合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達

差異表達基因在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中注釋分析，獲得類黃酮生物合成途徑（KEGGID：vvi00941）的差異基因。5個基因被注釋為苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），2個基因被注釋為肉桂酸4-羥化酶（cinnamate-4- hydroxylase，C4H），2個基因被注釋為4-香豆酰CoA連接酶（4-coumaroyl-CoA synthase，4CL），8個基因被注釋為查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS），2個基因被注釋為查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI），1個基因被注釋為類黃酮3′-羥化酶（flavonoid- 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H），5個基因被注釋為F3′5′H，2個基因被注釋為黃烷酮3-羥化酶（flavanone-3- hydroxylase，F(xiàn)3H），1個基因被注釋為黃烷酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR），1個基因被注釋為無色花色素雙加氧酶，6個基因被注釋為UDP葡萄糖-類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid glucosyltransferase，UFGT）。

根據(jù)基因功能注釋，在差異基因列表中查找與花青苷修飾和轉(zhuǎn)運相關(guān)的差異表達基因。差異基因中有6個基因與花青苷修飾有關(guān)，5個被注釋為O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）和1個花青苷?；D(zhuǎn)移酶（anthocyanin acyltransferases，AAT）。此外，有11個差異基因與花青苷轉(zhuǎn)運相關(guān)，其中有6個被注釋為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、1個被注釋為ATP結(jié)合盒亞族C（ATP binding cassette C family，ABCC）、4個被注釋為多藥和有毒化合物排出家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）。

對花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因、修飾和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達模式進行分析（圖7），52個差異基因均在ABA處理后表達水平上調(diào)。與ABA處理18 h后相比，18個差異基因在ABA處理3 d后表達水平較低，34個差異基因表達水平較高。值得注意的是，2個均在ABA處理18 h后表達水平最高，5個中有4個也在ABA處理18 h后表達水平最高。

圖7 花青苷積累相關(guān)基因表達模式分析

2.7 花青苷生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，參考北京大學(xué)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）公布的葡萄轉(zhuǎn)錄因子家族序列信息，共獲得296個差異轉(zhuǎn)錄因子。如圖8所示，對差異表達轉(zhuǎn)錄因子進行劃分，共分為40個轉(zhuǎn)錄因子家族。含有轉(zhuǎn)錄因子最多的3個家族是MYB家族、ERF家族、NAC家族，分別含有28、23、23個轉(zhuǎn)錄因子。其他含有轉(zhuǎn)錄因子較多的是WRKY、bHLH、bZIP家族，分別有21、20、17個轉(zhuǎn)錄因子。

對所有差異表達的轉(zhuǎn)錄因子進行表達模式分析（圖8），并篩選與表達模式相似的轉(zhuǎn)錄因子。共得到14個可能與花青苷生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要有MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。也有少量的bZIP、bHLH、NAC、Dof、HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子涉及花青苷生物合成、ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆脅迫、果實成熟等多個生物代謝途徑。

2.8 差異基因啟動子序列ABRE元件統(tǒng)計

候選差異基因啟動子中ABA響應(yīng)元件（ABRE）數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果顯示（表4），60個差異基因的啟動子序列中含有ABRE元件，有50個啟動子中含有多個ABRE元件。類黃酮生物合成途徑中的32個差異基因啟動子序列中含有ABRE元件，只有（LOC100232999）、（LOC100232843、LOC100241164）、（LOC100264341）4個基因的啟動子序列中不含有ABRE元件。與花青苷修飾相關(guān)的7個差異基因中，只有（LOC100251744）的啟動子序列不含ABRE元件。與花青苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的11個差異基因中，只有3個（LOC100242506、LOC100232976、LOC100233043）的啟動子序列中不含ABRE元件。15個可能參與調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列中均含有ABRE元件。值得注意的是，與花青苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的啟動子中含有11個ABRE元件，調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子啟動子中含有13個ABRE元件。

圖8 差異基因轉(zhuǎn)錄因子分析

表4 差異基因2000 bp啟動子序列中ABRE作用元件數(shù)量統(tǒng)計

續(xù)表4 Continued table 4

2.9 差異表達基因的qRT-PCR驗證

選取6個花青苷生物合成相關(guān)基因、2個花青苷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因和4個差異表達轉(zhuǎn)錄因子進行qRT-PCR分析。如圖9所示，12個差異表達基因均在ABA處理后表達上調(diào)，其中、、、-處理后18 h相對表達水平最高，、、、、、、、均在處理后3 d相對表達水平最高。以上qRT-PCR結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

圖9 差異表達基因qRT-PCR驗證

3 討論

3.1 外源ABA處理對葡萄果皮花青苷合成的影響

前人研究表明，花青苷的含量和組分決定了葡萄著色的類型[17]。外源ABA能促進葡萄果皮中總花青苷和花青苷單體的含量[10,18]。本研究中，外源ABA處理3 d后‘紅巴拉多’葡萄果實明顯呈現(xiàn)紅色，而清水處理的葡萄仍為綠色（圖1）。外源ABA處理增加了葡萄果皮花青苷的種類和含量，但增加的矮牽牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍藥素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）含量很低，因此，花青苷種類的增加可能不是葡萄迅速著色的原因。外源ABA處理后，葡萄果皮中芍藥素3-O-葡萄糖苷、錦葵色素3-O-葡萄糖苷兩種單體花青苷含量的顯著提高可能促進了葡萄著色。

3.2 外源ABA處理對葡萄果實內(nèi)源ABA合成的影響

ABA是調(diào)控葡萄成熟的關(guān)鍵內(nèi)源激素，其含量的變化與果實成熟進程高度相關(guān)[19]。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是植物體內(nèi)ABA生物合成的關(guān)鍵限速酶[20]。在葡萄果實始熟期啟動ABA的合成，在果實成熟過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用[21]。研究表明，外源ABA處理葡萄果實后表達迅速上調(diào)，同時內(nèi)源ABA含量增加。本試驗qRT-PCR結(jié)果也顯示，外源ABA處理顯著上調(diào)了的表達，且在處理后18 h達到峰值。HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，ABA處理后18 h和處理后3 d，內(nèi)源ABA含量均顯著增加。外源ABA可能通過激活的轉(zhuǎn)錄，啟動了葡萄果實中內(nèi)源ABA的合成，從而促進了葡萄果實的花青苷積累和著色。

3.3 ABA信號通路中的差異表達基因

ABA信號通路由ABA受體（PYL/RCAR）、2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、SnRK2激酶、ABRE元件結(jié)合因子（AREB/ABFs）組成[22]。葡萄基因組中鑒定和分離出了7個ABA受體基因，這些基因受不同非生物脅迫因子的調(diào)控[23]。研究表明參與調(diào)控葡萄果實花青苷的生物合成[12]。本研究中在ABA處理后18 h表達上調(diào)，說明可能在ABA誘導(dǎo)的花青苷積累中發(fā)揮調(diào)控作用，這與前人研究報道一致。葡萄中有兩個AREB/ABFs類基因，被命名為和[24]。其在荔枝中的同源基因s也被證明參與調(diào)控荔枝果皮花青苷生物合成過程[15]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，和在ABA處理后兩個時期的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，可能其在調(diào)控花青苷生物合成方面與作用相似。共有11個ABA信號通路基因在ABA處理后表達上調(diào)，說明葡萄果實ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在花青苷合成中可能具有重要作用。

3.4 花青苷生物合成、轉(zhuǎn)運相關(guān)差異表達基因

葡萄果皮中花青苷的生物合成主要通過類黃酮通路進行，這個過程由結(jié)構(gòu)基因所控制，調(diào)節(jié)下游各個結(jié)構(gòu)酶形成多酶復(fù)合物，進而催化花青苷生物合成[25]。本研究有35個差異基因富集到類黃酮通路中，包括、、、、、、、、、、等11個結(jié)構(gòu)基因。ABA處理后這些結(jié)構(gòu)基因表達上調(diào)，類黃酮通路合成增加，催化了花青苷的合成。O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）和花青苷?；D(zhuǎn)移酶（AAT）可將花青素進行修飾，使其更穩(wěn)定和多樣化[26-27]。差異基因中的5個和1個也在ABA處理后表達水平增加，表明ABA處理后花青苷修飾過程活躍。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、ATP 結(jié)合盒亞族C（ABCC）、多藥和有毒化合物排出家族（MATE）基因是將花青苷從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡中的關(guān)鍵基因[28-30]。11個花青苷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因上調(diào)，說明ABA處理后花青苷轉(zhuǎn)運過程增強。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA對葡萄花青苷的影響是一個復(fù)雜的過程，涉及合成、修飾、轉(zhuǎn)運等多個過程。

3.5 可能調(diào)控花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子

花青苷生物合成涉及許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，是調(diào)控葡萄花青苷生物合成重要的轉(zhuǎn)錄因子在自身啟動子的作用下遺傳轉(zhuǎn)化白皮品種‘霞多麗’葡萄植株，轉(zhuǎn)基因葡萄果皮變紅，在35S啟動子的作用下過表達，轉(zhuǎn)基因植株的果皮果肉均積累花青苷呈現(xiàn)黑紫色；而在黑皮品種‘西拉’葡萄中沉默后，轉(zhuǎn)基因植株果皮花青苷積累很少或不積累，呈現(xiàn)紅皮或者白皮的表型[31]。有研究表明通過激活、的啟動子來調(diào)節(jié)其表達，從而調(diào)控花色苷的合成積累[32]。功能相似或參與同一生物合成過程的轉(zhuǎn)錄因子往往表現(xiàn)出相似的表達模式，因此與表達模式相近的轉(zhuǎn)錄因子可能與花青苷生物合成有關(guān)。本研究篩選得到的15個轉(zhuǎn)錄因子中，6個轉(zhuǎn)錄因子已被證明參與調(diào)控花青苷生物合成。、和在葡萄2號染色體上形成基因簇，和決定了葡萄是否著色以及著色類型[33]。有研究表明MYB家族成員可能正調(diào)控類黃酮的合成[34]。屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，研究證實、、、和相互作用參與調(diào)控類黃酮途徑[35]。轉(zhuǎn)錄抑制因子和負(fù)調(diào)控花青苷生物合成過程。轉(zhuǎn)錄抑制因子通過與bHLH結(jié)合或抑制和的表達負(fù)調(diào)控花青苷的合成[36]。R2R3轉(zhuǎn)錄抑制因子在煙草中過表達引起花的色素積累減少，在擬南芥中過表達下調(diào)了花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因、、的表達水平[37]。負(fù)調(diào)控花青苷生物合成的和表達水平上調(diào)，這可能是一種花青苷合成的反饋調(diào)節(jié)機制。研究表明，在花青苷積累過程中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄激活子可能會上調(diào)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄抑制子的表達，從而提供反饋抑制使花青苷處于適當(dāng)?shù)乃絒38-40]。此外，還有8個差異表達的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控花青苷生物合成，其中包括2個MYB（，LOC10050942；，LOC100260647）、1個NAC（，LOC104879728）、3個bZIP（，LOC100243434；，LOC100232889；，LOC100258873）、1個Dof（，LOC100265549）、1個HD-ZIP（，LOC100245524）。這些轉(zhuǎn)錄因子均在ABA處理后表達上調(diào)，在花青苷生物合成過程中的調(diào)控作用尚需進一步驗證。

3.6 差異表達基因啟動子的ABRE元件分析

啟動子是控制基因表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，分析啟動子序列中的順式作用元件是了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達模式及調(diào)控機制的關(guān)鍵[41-42]。ABRE元件是一種含有G-box的保守順式作用元件，一般存在于ABA所調(diào)控基因的啟動子中，ABA通過啟動子區(qū)域的ABRE元件激活下游基因的表達[43]。為了研究ABA對差異表達基因的調(diào)控作用，對差異基因啟動子進行提取和順式作用元件分析。60個候選差異基因的啟動子中含有ABRE元件，這些啟動子可能是ABA誘導(dǎo)型啟動子，可在ABA信號的刺激下快速調(diào)整轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。在先前的多個研究中，受到ABA的誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)啟動子序列中含有13個ABRE元件，說明可能是ABA直接調(diào)控的基因，這與前人研究相符。大多數(shù)與花青苷合成、修飾、轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，啟動子序列中含有ABRE元件，說明它們可能是ABA誘導(dǎo)型基因。由此推測，與葡萄花青苷積累相關(guān)基因在ABA處理后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，可能與啟動子中ABRE元件的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)有關(guān)。外源ABA處理后，葡萄果實內(nèi)源ABA水平提高，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活躍，激活了下游一系列與花青苷積累相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而使花青苷合成和轉(zhuǎn)運增強，在果皮中積累而使葡萄著色。ABA信號通路中兩個ABF轉(zhuǎn)錄因子對花青苷合成的調(diào)控作用，有待通過基因過表達技術(shù)和基因沉默技術(shù)進一步證實，其是否能夠作用于含有ABRE元件的花青苷生物合成相關(guān)基因的啟動子序列，尚需酵母單雜交、雙熒光素酶報告基因等相關(guān)試驗進行驗證。

4 結(jié)論

ABA處理促進葡萄果實著色明顯加深和花青苷積累，涉及11個ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、52個花青苷合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因，15個MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控花青苷的生物合成。大部分篩選到的差異基因啟動子中含有ABRE元件，這些差異表達基因的啟動子可能為ABA誘導(dǎo)型啟動子。

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Transcriptome Analysis of Genes Involved in ABA-Induced Anthocyanin Accumulation in Grape

XU XianBin, GENG XiaoYue, LI Hui, SUN LiJuan, ZHENG Huan, TAO JianMin

College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The aim of this study was to analyze the genes involved in the regulation of ABA induced grape coloring, and to explore the molecular mechanism of ABA induced anthocyanin accumulation in grape. 【】In present study, Benibalado was used as the experimental material. In the early stage of veraison, the grape clusters were treated with 300 mg·L-1ABA, water treated as control. The grape phenotypes were observed and anthocyanins were determined by UPLC-MS. The mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation was analyzed by transcriptome sequencing. 【】After 3 days of exogenous ABA treatment, the grape berries were obviously colored, and the variety and content of anthocyanins were also increased. Among them, Peonidin 3-O-glucoside and Malvidin 3-O-glucoside increased most significantly. By KEGG enrichment analysis, 11 DEGs related to ABA signaling and 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, and transportation were identified, all of which were up-regulated. After exogenous ABA treatment, the DEGs from RNA-seq were searched by using BLAST against the grape TF database, and 297 transcription factors were identified. Through the further analyzing of the expression patterns of identified TFs, 15 members of MYB, bHLH, bZIP, NAC, Dof, and HD-ZIP families were observed to regulate anthocyanin biosynthesis. The analyzing of cis-acting elements in promoters showed that ABREs were identified in most of the promoters. The accuracy of RNA-seq was validated by qRT-PCR analysis of some candidate genes. 【】Overall, ABA promoting anthocyanin accumulation in grape was a complex process, including 11 DEGs related to ABA signal transduction, 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, modification and transportation, 15 transcription factors. This study provided a basis for revealing the molecular mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation in grape fruits.

grape; anthocyanin; ABA; RNA-seq; promoter

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.012

2021-03-15；

2021-06-08

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-29）、國家自然科學(xué)基金（31901975，31972384）、江蘇農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JATS［2021］450）、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（PZCZ201723）、國家重點研發(fā)計劃（2020YFD1000204）

徐獻斌，E-mail：619262966@qq.com。通信作者陶建敏，E-mail：taojianmin@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）