歸芪白術(shù)方聯(lián)合奧沙利鉑對胃癌荷瘤小鼠機(jī)體免疫炎癥分子的影響及抑癌作用①

牛世偉 蘇韞③ 龔紅霞 張晗 曾元丁 李菲菲

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000）

2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和病死率在全球分別居于第5位和第4位［1］。我國癌癥中心2019年的數(shù)據(jù)顯示，我國胃癌的發(fā)病率和病死率分別居于第2位和第3位［2］。近年來，運(yùn)用中醫(yī)藥輔助治療胃癌被廣泛關(guān)注，中醫(yī)藥在緩解胃癌臨床癥狀，減輕化療毒副反應(yīng)，提高患者免疫力及延長生存時間方面顯示出較好的療效，具有很大優(yōu)勢。本研究選用的歸芪白術(shù)方出自《普濟(jì)方》卷的“黃芪湯”加白術(shù)而成，課題組前期通過臨床研究、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從患者癥狀評分、炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平、腸道菌群變化、胃癌細(xì)胞凋亡等方面證實(shí)了歸芪白術(shù)方具有很好的輔助治療效果［3-7］。在此基礎(chǔ)上，本研究擬探討歸芪白術(shù)方聯(lián)合奧沙利鉑通過調(diào)節(jié)IL-6/JAK2/STAT3信號通路對胃癌荷瘤小鼠胃癌細(xì)胞的抑瘤作用及免疫炎癥的影響，為其輔助治療胃癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動物MFC小鼠胃癌細(xì)胞，批號：PNS-MC-20，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心提供；動物合格證號：SCXK（甘）2020-0001。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，編號：2020-283。

1.1.2 藥物歸芪白術(shù)方由黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、白術(shù)10 g、白芍10 g、酒大黃6 g、陳皮6 g、甘草6 g組成。以上藥物均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。奧沙利鉑購自山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液（批號：AF29520450）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號：11012-8611）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；IL-6 ELISA試劑盒（批號：MM-0163M1）購自江蘇菲亞生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）試劑（批號：G1003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：H4104750）、實(shí)時熒光定量-PCR試劑盒（批號：H4104620）購自上海翊圣生物有限公司；IL-6抗體（批號：GTX110527）購自GenTex公司；p-JAK2（批號：YP0155）、p-STAT3（批號：YP0250）抗體購自Immunoway公司。

1.1.4 儀器無菌超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；電子天平購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；IMark酶標(biāo)分析儀、電泳儀、凝膠成像儀、S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀、CFX96TM Optics Module PCR儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及胃癌荷瘤小鼠模型的建立小鼠MFC胃癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的孵育箱中。將MFC細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期并將密度調(diào)整為1×107個/ml，小鼠右側(cè)腋下常規(guī)消毒后，接種單細(xì)胞懸液0.2 ml/只，制備胃癌荷瘤模型小鼠。接種5~7 d后可觸及結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)直徑長至大于5 mm時，提示造模成功。

1.2.2 動物分組及給藥根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑加歸芪白術(shù)方高、中、低劑量組（以下簡稱聯(lián)合用藥高、中、低劑量組），10只/組。根據(jù)小鼠和人體表面積比值0.002 6計算小鼠給藥劑量，奧沙利鉑為10 mg/（kg·2 d），歸芪白術(shù)方高、中、低劑量分別為17.68、8.84、4.42 g/（kg·d）。小鼠的灌胃體積和腹腔注射體積為0.2 ml，給藥周期為14 d。另選10只健康昆明小鼠作為空白組，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.2.3 測定抑瘤率及臟器指數(shù)末次給藥24 h后，小鼠眼球取血，分離血清，凍存?zhèn)溆?。頸椎脫臼法處死小鼠后，摘除瘤組織、胸腺及脾臟，稱重記錄。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-藥物組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.4 檢測小鼠血清中炎癥因子取新鮮小鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中IL-6含量。

1.2.5 HE染色觀察各組小鼠瘤組織病理將各組小鼠1/2的瘤組織固定于4%多聚甲醛中12~24 h，石蠟包埋，切成3~4 μm的切片。常規(guī)脫水后，進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 RT-qPCR定量檢測各組小鼠腫瘤組織中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)Trizol法提取腫瘤組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作說明將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板采用熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃10 s，55℃20 s，72℃20 s，40個循環(huán)，繪制溶解曲線，根據(jù)各組Ct值，通過2-ΔΔCt法計算各組IL-6、JAK2、STAT3mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用引物均由北京博邁德有限公司合成。IL-6 F：5′-

CATCCAGTTGCCTTCTTG-3'，R：5′-TATCCAGTTT?GGTAGCATCC-3'；JAK2 F：5′-ACAATGAAATGGAGGC-3'，R：5′-ACAGGCGTAATACCACAAGC-3'；STAT3 F：5′-TGTTGGAGCAGCATCTTC-3'，R：5′-GGTCACAGACTGGTTGTTTC-3'；GAPDH F：5′-GGTGTGAACGGATTTGG-3'，R：5′-GACTCCACGACATACTCAGC-3′。

1.2.7 Western blot檢測腫瘤組織中IL-6、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)取適量腫瘤組織提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，煮沸變性，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。配制SDS-PAGE膠，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后于脫脂奶粉中封閉2 h，一抗稀釋液4℃冰箱孵育過夜。TBST清洗后于常溫?fù)u床二抗孵育2 h，ECL顯色曝光，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行比較，分析相對蛋白表達(dá)量。

1.2.8 免疫組化法檢測瘤組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)4%多聚甲醛固定瘤組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，PBS洗滌5 min×3次，切片放入3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min，BSA室溫封閉30 min，滴加一抗4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。第2天PBS洗滌5 min×3次，加相應(yīng)二抗室溫孵育50 min，DAB顯色后蘇木素復(fù)染脫水封片，顯微鏡觀察，Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，組間比較先采用方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用單因素方差分析，兩兩比較采用Q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用與模型組相比，各給藥組小鼠瘤體重量顯著減輕（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高、中劑量組瘤體重量顯著減輕（P<0.01）。奧沙利鉑組和聯(lián)合用藥高、中、低劑量組抑瘤率分別為46.23%、57.77%、52.29%、50.07%，見表1。

表1 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠瘤體重量、抑瘤率的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Guiqibaizhu Recipe on tumor weight and tumor inhibition rate in MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

表1 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠瘤體重量、抑瘤率的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Guiqibaizhu Recipe on tumor weight and tumor inhibition rate in MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

Note：Compared with model group，1）P<0.01；compared with oxaliplatin group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose Dose/（g/kg）-10×10-3 10×10-3/17.68 10×10-3/8.84 10×10-3/4.42 Tumor weight/g 1.21±0.07 0.65±0.021）0.51±0.031）3）0.58±0.031）2）0.60±0.041）Tumor inhibition rate/%-46.23 57.77 52.29 50.07

2.2 藥物對胃癌荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響與空白組相比，模型組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低（P<0.01）；與模型組相比，奧沙利鉑組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高劑量組脾指數(shù)升高，聯(lián)合用藥高、中劑量組胸腺指數(shù)升高（P<0.05，P<0.01），見表2。

表2 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Guiqibaizhu Recipe on organ index of MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

表2 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Guiqibaizhu Recipe on organ index of MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01；compared with oxaliplatin group，3）P<0.05，4）P<0.01.

Groups Blank Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose Dose/（g/kg）--10×10-3 10×10-3/17.68 10×10-3/8.84 10×10-3/4.42 Spleen index/（mg·g-1）6.79±0.41 5.33±0.251）4.65±0.202）5.33±0.194）5.01±0.13 5.03±0.32 Thymus index/（mg·g-1）5.69±0.35 4.41±0.391）3.54±0.152）4.29±0.394）4.06±0.353）3.97±0.27

2.3 藥物對胃癌荷瘤小鼠血清中IL-6的影響與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-6含量升高（P<0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠血清中的IL-6含量降低（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高、中劑量小鼠血清中的IL-6含量均降低（P<0.05，P<0.01），見表3。

表3 各組小鼠血清中IL-6含量（±s，n=10）Tab.3 Content of IL-6 in serum of mice in each group（±s，n=10）

表3 各組小鼠血清中IL-6含量（±s，n=10）Tab.3 Content of IL-6 in serum of mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01；compared with oxaliplatin group，3）P<0.05，4）P<0.01.

Groups Blank Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose Dose/（g/kg）--10×10-3 10×10-3/17.68 10×10-3/8.84 10×10-3/4.42 IL-6/（ng·ml-1）62.33±7.60 119.69±5.621）98.79±5.012）78.57±4.962）4）81.45±4.082）3）85.85±4.722）

2.4 藥物對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)影響HE結(jié)果顯示，模型組小鼠瘤組織腫瘤細(xì)胞密集，排列均一，未見明顯腫瘤壞死灶。奧沙利鉑組及聯(lián)合用藥高、中、低劑量組腫瘤細(xì)胞密度降低，分布不均，細(xì)胞核固縮、深染，腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，呈現(xiàn)不同程度的腫瘤壞死灶，上述壞死現(xiàn)象以聯(lián)合用藥高劑量組最為顯著，見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)（HE染色，×100）Fig.1 Pathological morphology of tumor tissues in each group of mice（HE staining，×100）

2.5 藥物對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6、JAK2、STAT3基因表達(dá)的影響與模型組相比，各給藥組小鼠的IL-6、JAK2、STAT3mRNA表達(dá)均降低（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高、中劑量組IL-6、STAT3mRNA表達(dá)均降低（P<0.05，P<0.01），聯(lián)合用藥高劑量組JAK2mRNA表達(dá)降低（P<0.05），見表4。

表4 各組MFC胃癌小鼠瘤組織IL-6、JAK2、STAT3基因表達(dá)（±s，n=10）Tab.4 Expressions of IL-6，JAK2 and STAT3 genes in tumor tissues of MFC gastric cancer mice in each group（±s，n=10）

表4 各組MFC胃癌小鼠瘤組織IL-6、JAK2、STAT3基因表達(dá)（±s，n=10）Tab.4 Expressions of IL-6，JAK2 and STAT3 genes in tumor tissues of MFC gastric cancer mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with model group，1）P<0.01；compared with oxaliplatin group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-6 1.00±0.00 0.72±0.051）0.54±0.051）3）0.63±0.021）2）0.64±0.031）JAK2 1.00±0.00 0.68±0.011）0.58±0.041）2）0.61±0.061）0.67±0.041）STAT3 1.00±0.00 0.63±0.061）0.46±0.021）3）0.53±0.031）2）0.58±0.031）

2.6 藥物對胃癌荷瘤小鼠瘤組織中IL-6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響與模型組相比，各給藥組小鼠的IL-6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均降低（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高、中劑量組IL-6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均降低（P<0.05，P<0.01），見圖2、表5。

表5 各組MFC胃癌小鼠瘤組織IL-6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.5 Expressions of IL-6，p-JAK2 and p-STAT3 pro?tein in tumor tissues of MFC gastric cancer mice in each group（±s，n=10）

表5 各組MFC胃癌小鼠瘤組織IL-6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.5 Expressions of IL-6，p-JAK2 and p-STAT3 pro?tein in tumor tissues of MFC gastric cancer mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with model group，1）P<0.01；compared with oxaliplat?in group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-6 0.33±0.02 0.27±0.021）0.17±0.011）3）0.22±0.011）2）0.24±0.021）p-JAK2 0.66±0.02 0.44±0.021）0.32±0.031）3）0.37±0.011）2）0.40±0.031）p-STAT3 0.56±0.04 0.36±0.031）0.19±0.021）3）0.28±0.021）2）0.34±0.031）

圖2 各組MFC胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織中蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein expression levels in tumor tissues of MFC gastric cancer tumor-bearing mice in each group

2.7 藥物對胃癌荷瘤小鼠瘤組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響c-Myc的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，Cyclin D1的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核，主要表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。與模型組相比，各給藥組小鼠的c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)均降低（P<0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯(lián)合用藥高、中劑量組c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)均降低，聯(lián)合用藥低劑量組Cyclin D1蛋白表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01），見圖3、表6。

表6 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠瘤組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Tab.6 Effect of Guiqibaizhu Recipe on expressions of c-Myc and Cyclin D1 protein in tumor tissues of MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

表6 歸芪白術(shù)方對MFC胃癌小鼠瘤組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Tab.6 Effect of Guiqibaizhu Recipe on expressions of c-Myc and Cyclin D1 protein in tumor tissues of MFC gastric cancer mice（±s，n=10）

Note：Compared with model group，1）P<0.01；compared with oxaliplatin group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination middle-dose Combination low-dose c-Myc 0.306±0.035 0.246±0.0191）0.178±0.0201）3）0.198±0.0211）2）0.231±0.0161）Cyclin D1 0.268±0.029 0.207±0.0161）0.131±0.0171）3）0.147±0.0171）3）0.163±0.0181）2）

圖3 免疫組化染色觀察各組小鼠瘤組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)（×200）Fig.3 Immunohistochemical staining to observe expres?sions of c-Myc and Cyclin D1 protein in tumor tissues of each group of mice（×200）

3 討論

胃癌屬于中醫(yī)學(xué)中“胃脘痛”“噎膈”“反胃”“伏梁”等范疇［8］。胃癌的病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾胃虛弱為主，標(biāo)實(shí)則以血瘀、痰凝、氣滯等為主［9］。目前運(yùn)用中醫(yī)藥輔助治療胃癌被廣泛關(guān)注，中藥能改善各種類型胃癌的臨床癥狀，減輕患者化療后的不良反應(yīng)，增強(qiáng)免疫，提高治療率，延長生存時間［10-11］。

歸芪白術(shù)方由明?朱橚等《普濟(jì)方》卷二七二之“黃芪湯”加味白術(shù)變化而來，全方由黃芪、白術(shù)、當(dāng)歸、大黃（酒）、芍藥（白芍）、陳皮、甘草（炒）組成。該方具有攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪、健脾化瘀的功效。課題組前期從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)了歸芪白術(shù)方對于抑制胃癌細(xì)胞的增殖及臨床輔助治療胃癌具有一定作用［3-7］。

IL-6/JAK2/STAT3信號通路在胃腸道腫瘤發(fā)生的過程中高度特異性激活，從促炎、促增殖、免疫調(diào)節(jié)等多個方面促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［12］。有學(xué)者表明IL-6在惡性腫瘤中可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，免疫效應(yīng)細(xì)胞被過度激活，細(xì)胞因子大量釋放，加重癌癥進(jìn)展［13］。IL-6與IL-6R結(jié)合后可活化JAK蛋白酪氨酸激酶，作為上游激酶活化后募集胞漿中的STAT3單體，使無活性的STAT3分子酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚體，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，結(jié)合DNA，導(dǎo)致特定靶基因的開啟，如參與下游基因c-Myc和Cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，進(jìn)而通過影響細(xì)胞的增殖、分化、炎癥免疫等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展（圖4）［14-15］。半夏瀉心湯可通過影響IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖［16］。張剛等［17］通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，延齡草總皂苷可通過抑制IL-6/STAT3信號通路下調(diào)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。以上研究表明，IL-6/JAK2/STAT3信號通路與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

圖4 IL-6/JAK2/STAT3活化途徑信號通路圖Fig.4 IL-6/JAK2/STAT3 activation pathway signal path?way diagram

本實(shí)驗(yàn)建立胃癌荷瘤小鼠模型，通過奧沙利鉑及中藥歸芪白術(shù)方聯(lián)合干預(yù)驗(yàn)證小鼠機(jī)體免疫炎癥分子的影響及抑癌作用，結(jié)果表明與模型組相比，各給藥組小鼠瘤體重量顯著減輕，且病理壞死程度顯著加重；與奧沙利鉑組相比，奧沙利鉑聯(lián)合歸芪白術(shù)方可提高抑瘤率，提高小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，降低小鼠血清中炎癥因子IL-6的表達(dá)，降低瘤組織中的IL-6、JAK2、STAT3mRNA水平和IL-6、p-JAK2、p-STAT3、c-Myc、Cyclin D1蛋白水平，說明聯(lián)合用藥可抑制免疫炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子含量，調(diào)節(jié)IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，提示歸芪白術(shù)方可能通過調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號通路輔助奧沙利鉑發(fā)揮抑瘤作用。