瑤藥螞蝗七水煎液對小鼠離體腸平滑肌的影響

劉傳夢，楊丹荔，馮秋瑜，2 *

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤醫(yī)藥與醫(yī)養(yǎng)結(jié)合人才小高地，廣西 南寧 530020)

螞蝗七ChiritafimbrisepalaHand.-Mazz.又名石螃蟹、石蜈蚣、紅螞蝗七、巖白菜、水白菜等，為苦苣苔科唇柱苣苔屬Chirita的植物，以根莖入藥[1]。螞蝗七生于林中石上，山林濕地，為廣西瑤族民間習用草藥。其性涼，味微苦，具有清熱利濕、行滯消積、止血活血、解毒消腫的功效，多用于治療胃腸道疾病以及跌打外傷[2]，瑤族民間常用于治療消化不良及小兒疳積等。近年來，關(guān)于螞蝗七成分研究發(fā)現(xiàn)，它的主要化學成分為黃酮類。螞蟥七總黃酮是螞蟥七根莖中具有藥理活性的主要成分之一，前期研究證實其具有廣泛的抗菌、抗炎的藥理作用[3-4]。目前已確定的化合物為mahuangchiside(Ⅰ)，hispidulin(Ⅱ)，kaempferol(Ⅲ)和甾醇苷daucosteral(Ⅳ)[5]，其中II和III首次從Gesneriaceae家族中分離得到，并首次從Chirita屬中分離出Ⅳ[6]。對螞蟥七藥理作用研究主要集中在抗菌、抗炎等方面。在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)螞蝗七能抑制腸道收縮，對腹瀉的患者具有很好的療效，目前尚未有文獻報道。本實驗擬以小鼠腸平滑肌為研究對象，研究螞蝗七水提液對離體腸平滑肌的影響，并對其作用機制進行了分析。

1 實驗材料

1.1 動物

KM種小鼠，SPF級，雌雄兼用，體質(zhì)量(20±2)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證編號：SCXK(湘)2016-0002)。

1.2 儀器

BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；HW-400E型恒溫平滑機槽(成都泰盟軟件有限公司)；PT-100型生物張力傳感器(成都泰盟軟件有限公司)。

1.3 藥品與試劑

螞蝗七采集于廣西來賓市金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物螞蟥七ChiritafimbrisepalaHand.-Mazz的根；乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach，國藥集團化學試劑有限公司，批號20160523)；阿托品(Atropine，Atr，民生藥業(yè)集團紹興醫(yī)藥有限公司，批號0601002)；Tyrode's溶液所用試劑均為分析純，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 實驗方法

2.1 Tyrode’s溶液配制[7]

取NaH2PO4·2H2O 0.065 g、CaCl20.2 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.26 g、NaHCO31.0 g、葡萄糖1.0 g，CaCl2溶液須在其他基礎溶液混合并加蒸餾水稀釋之后，方可攪拌。同時，逐滴加入，否則將生成鈣鹽沉淀，葡萄糖在臨用前即時加入，加入葡萄糖的溶液不能久置。

2.2 樣品的制備

取螞蝗七原藥材200 g，適當粉碎，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱煮沸，小火保持微沸，煎煮1.5 h取出，用8層紗布過濾。藥渣內(nèi)加入8倍量水，煎煮1 h，取出用8層紗布過濾。藥渣內(nèi)再加入8倍量水，再煎煮1 h，取出用8層紗布過濾，合并煎煮液，用8層紗布過濾，水浴濃縮至200 mL，得到含生藥1 g·mL-1的螞蝗七水煎液。

2.3 實驗裝置

將生物機能實驗系統(tǒng)、恒溫平滑機槽、張力傳感器等按圖1安裝。設置恒溫平滑機槽的溫度為37 ℃，調(diào)節(jié)空氣流速，速度為每秒1～2個氣泡。浴槽內(nèi)管裝入新鮮配置的15 mL Tyrode營養(yǎng)液。將十二指腸掛在浴槽中，一端用線結(jié)一角，固定于張力傳感器上與生物信號采集處理系統(tǒng)相連，另一端固定在L型通氣鉤上，記錄十二指腸收縮時張力的變化。實驗裝置如圖1。

圖1 實驗裝置

2.4 離體小腸平滑肌的制備

取禁食12 h后的小鼠，脫頸椎致死，立即剖開腹腔，找出胃幽門與十二指腸交界處，以此為起點，取十二指腸近端6～8 cm腸管置于裝有Tyrode溶液的平皿中[8-12]。

2.5 螞蝗七水煎液對正常小鼠離體腸平滑肌的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min，然后加入0.1 mL的蒸餾水(空白對照組)或加入0.1 mL不同濃度的受試藥液(其終濃度分別為12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，記錄加入蒸餾水或受試藥液后的曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

2.6 螞蝗七水煎液對Ach致小鼠離體腸平滑肌興奮作用的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min(計算1，5，10 min時間點張力，取平均值作為正常值)，然后加入1.5×10-5g·mL-1Ach 2滴，1 min 后加入0.1 mL蒸餾水(對照組)或不同濃度的受試藥液(其終濃度分別為 12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，并記錄曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

2.7 螞蝗七水煎液對Atr致小鼠離體腸平滑肌抑制作用的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min(計算1，5，10 min時間點張力，取平均值作為正常值)，然后加入0.5 mg·mL-1Atr 0.1 mL，1 min后加入0.1 mL蒸餾水(對照組)或同體積不濃度的受試藥液(其終濃度分別為12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，并記錄曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

3 統(tǒng)計學方法

4 實驗結(jié)果

4.1 螞蝗七水煎液對正常小鼠離體腸平滑肌收縮作用的影響

結(jié)果表明，螞蝗七水煎液能使腸肌張力降低，收縮幅度變小，給藥前后比較平均張力、頻率有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。給藥前后比較，螞蝗七水煎液在50、75、100 mg生藥·mL-1劑量內(nèi)，具有顯著差異。說明螞蝗七水煎液對正常小鼠離體腸平滑肌收縮作用有明顯抑制作用。實驗結(jié)果見表1、圖2、圖3。

表1 各劑量螞蟥七對小鼠正常離體腸平滑肌頻率和平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-e表示12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

4.2 螞蝗七水煎液對Ach致小鼠離體腸平滑肌收縮作用的影響

結(jié)果顯示，Ach造成離體腸平滑肌興奮模型，表現(xiàn)為基線上升、張力明顯提高。給藥前與給藥后比較平均張力，在50、75、100 生藥mg·mL-1劑量時，說明螞蝗七水煎液具有對抗Ach興奮小鼠離體平滑肌的作用，實驗結(jié)果見表2、圖4、圖5。

表2 各劑量螞蟥七Ach致離體腸平滑肌興奮平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-f表示0、12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

4.3 螞蝗七水煎液對Atr致小鼠離體腸平滑肌抑制作用的影響

結(jié)果顯示，Atr造成離體腸平滑肌抑制模型，表現(xiàn)為基線下降、張力明顯降低。給藥前后比較平均張力，在50、75、100生藥mg·mL-1劑量，具有顯著性差異，說明高劑量的螞蝗七水煎液與Atr可協(xié)同作用于小鼠離體平滑肌，使離體平滑肌抑制，實驗結(jié)果見表3、圖6、圖7。

表3 各劑量螞蟥七Ach致離體腸平滑肌興奮平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-f表示0、12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

5 討論

本研究表明，在生藥50～100 mg·mL-1劑量的螞蝗七水煎液對小鼠正常離體腸的運動具有不同程度的抑制作用，呈劑量依賴性。Ach為M受體激動劑，M受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在結(jié)合Ach后生成第二信使IP3，激活肌漿網(wǎng)，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，誘導腸肌收縮[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)螞蟥七能明顯拮抗Ach對小鼠離體腸平滑肌的興奮作用。Atr是M受體拮抗劑，能可逆性阻斷節(jié)后膽堿能神經(jīng)支配的效應器上的M受體，Atr通過與Ach競爭性結(jié)合M受體，能抑制腸道收縮，解除平滑肌痙攣[14]。我們研究發(fā)現(xiàn)螞蝗七對Atr的舒張起到協(xié)同作用。由此可以推測瑤藥螞蝗七水煎液可能通過阻斷M受體，從而減弱腸道平滑肌的收縮活動。而關(guān)于螞蟥七對其他影響腸道平滑肌收縮的因素(如鈣離子通道以及組胺受體等)的作用，尚需要進一步觀察研究。