劉俊梅,劉彥紅,李 娟,戴貴東,鄭 萍
氧化苦參堿(OMT)是寧夏苦豆子中單體化合物,是一種具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿,分子式為C15H24N2O2。相關(guān)文獻(xiàn)表明,氧化苦參堿具有多種藥理作用,如抗血管、抗心律失常、抗腫瘤、殺菌、抗炎等[1-4]。創(chuàng)面愈合過程中,多種炎癥因子及細(xì)胞修復(fù)共同參與其中,而氧化苦參堿對其是否具有作用,目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本實驗旨在以小鼠背部全層皮膚缺損為實驗?zāi)P停瑧?yīng)用氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù),探討其對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響及可能機(jī)制,為臨床創(chuàng)面愈合提供實驗依據(jù)。
1.1 一般資料:清潔級♂昆明種小鼠,體重(22±2)g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號:SYXK(寧)2009-0003。
1.2 藥品與試劑:氧化苦參堿購自寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司,純度:99.8%,批號:P0100226;戊巴比妥鈉和多聚甲醛購自Sigma公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)檢測試劑盒和血清增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測試劑盒購自ImmunoWay公司;細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)檢測試劑盒購自abcam公司;實驗用水為超純水。
1.3 主要儀器:PMZ000型病理圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA公司);MIAS2000病理圖像分析軟件(川大智勝軟件公司);Rm2015型切片機(jī)(德國LEICA公司);數(shù)碼相機(jī)(日本尼康公司);SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。
1.4 實驗方法
1.4.1 小鼠皮膚創(chuàng)面制備及實驗動物分組:1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,背部去毛,暴露皮膚,用2%碘酒和75%酒精依次消毒后,背部正中剪除全層皮膚,制備1.5 cm×1.5 cm正方形傷口,創(chuàng)面自然干燥,止血。制備創(chuàng)面后,24只♂小鼠隨機(jī)分為4組:創(chuàng)面對照組,氧化苦參堿低、中、高劑量組(20、40、80 mg/kg),除創(chuàng)面對照組給予等體積生理鹽水外,其余各組分別按20、40和80 mg/kg給予氧化苦參堿灌胃,每天1次,共14 d。實驗第3、5、7、9、11、14 d,每組分別取6只小鼠稱重,戊巴比妥鈉過量麻醉處死。
1.4.2 小鼠皮膚創(chuàng)面觀察:①觀察指標(biāo):每天觀察并記錄小鼠毛色、攝食、飲水及活動情況,包括創(chuàng)面色澤、質(zhì)地、有無滲液、是否感染、水腫、肉芽組織生長情況等。在1、3、5、7、9、11、14 d時麻醉小鼠,描繪未愈合皮膚創(chuàng)面。②描繪創(chuàng)面面積:將描繪的創(chuàng)面區(qū)域均勻涂黑,采用清華紫光A900掃描儀及美國Image-Pro PlusVersion6.0(IPP)圖像分析軟件分析并計算各組小鼠未愈合創(chuàng)面面積,與原創(chuàng)面面積比較,評價創(chuàng)面愈合情況。③小鼠皮膚創(chuàng)面組織的Van Gieson染色:實驗第 3、5、7、9、11和14 d 時,從創(chuàng)面組織正中線處剪開,取左側(cè)一半創(chuàng)面組織及周邊正常皮膚,10%多聚甲醛內(nèi)固定24 h后,用流水沖洗3 h,然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片。酸性復(fù)紅和苦味酸以1∶9比例混合,配成VG染色液染色30 s,用分化液分化4 s后脫水,透明,用中性樹膠封片。載玻片置于400倍光學(xué)顯微鏡下,觀察小鼠皮膚創(chuàng)面處膠原纖維生長情況并采圖。
1.5 小鼠皮膚創(chuàng)面組織中PCNA、α-SMA和Type Ⅰ collagen的免疫組織化學(xué)方法檢測:石蠟切片脫蠟、梯度乙醇脫水后,對組織進(jìn)行高壓熱抗原修復(fù),室溫冷卻,PBS沖洗3次,2 min/次(檢測α-SMA的切片不修復(fù))。3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,置于室溫孵育20 min,甩去液體,PBS沖洗3次,2 min/次,滴加一抗,室溫孵育1.5~2 h(PCNA Polyclonal Antibody (YT3617)1∶400、α-SMA Polyclonal Antibody(YT5053)1∶1000、Anti-CollagenⅠantibody (ab34710)1∶800。PBS沖洗3次,2 min/次;除去PBS溶液后滴加二抗,室溫孵育30 min,PBS沖洗3次,2 min/次;除去PBS溶液后,將新配置的DAB顯色工作液滴于載玻片上,顯微鏡下觀察2~8 min;自來水終止反應(yīng);切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。
2.1 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的外觀觀察:小鼠皮膚創(chuàng)面隨時間逐漸被新生肉芽組織填充,上皮覆蓋,部分毛發(fā)生成。第1 d,各組小鼠皮膚創(chuàng)面邊緣收縮,創(chuàng)面無感染。第3、5 d,創(chuàng)面對照組創(chuàng)面較干燥,分泌物較少,創(chuàng)面有肉芽組織充填,肉芽較粗大;氧化苦參堿各組創(chuàng)口周圍毛發(fā)明顯生長,創(chuàng)面較為濕潤,肉芽組織色澤紅潤、肉芽略顯細(xì)小,生長良好。第7、9 d,各組創(chuàng)面已形成瘢痕,觸之較硬,結(jié)痂易碎。第11 d,各組小鼠皮膚創(chuàng)面微小,已無結(jié)痂覆蓋。第14 d,各組小鼠皮膚創(chuàng)面基本愈合。
2.2 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面未愈合面積的影響:描繪小鼠皮膚未愈合創(chuàng)面面積結(jié)果顯示,各組小鼠皮膚創(chuàng)面描繪面積隨時間推移不斷縮小,直至創(chuàng)面愈合。與創(chuàng)面對照組相比,氧化苦參堿20 mg/kg組在第5 d,氧化苦參堿40 mg/kg組在第7、11 d 時小鼠未愈合面積顯著減小(P<0.05);其余各時間點,氧化苦參堿組與創(chuàng)面對照組小鼠創(chuàng)面未愈合面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。
表1 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面未愈合面積的影響
2.3 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面組織VG染色的影響:傷后第11 d,創(chuàng)面對照組的創(chuàng)面幾乎被肉芽組織充填,皮膚創(chuàng)面中纖維細(xì)胞呈細(xì)長梭狀,排列紊亂,膠原纖維增生不明顯;氧化苦參堿各給藥組創(chuàng)面幾乎完全被肉芽組織充填,且成纖維細(xì)胞減少,纖維細(xì)胞明顯增多,肉芽組織新生膠原纖維排列整齊。鏡下可觀察到陽性細(xì)胞在近創(chuàng)緣組織、創(chuàng)面基底部、新生的肉芽組織和表皮細(xì)胞中逐漸增加表達(dá),但維持水平及時間各實驗組存在差異。氧化苦參堿20 mg/kg組創(chuàng)面中α-SMA第3 d 最低,之后開始上升,在愈合中、后期表達(dá)量大幅度增加,到第9、11 d 時達(dá)最高峰。氧化苦參堿40、80 mg/kg組中α-SMA的表達(dá)呈現(xiàn)較平穩(wěn)趨勢。氧化苦參堿40 mg/kg組Type Ⅰ collagen表達(dá)在第3 d 時最低(P<0.05),到第5 d 時達(dá)高峰,之后下降再上升,呈波浪形表達(dá)。氧化苦參堿80 mg/kg組Type Ⅰ collagen第3 d 最低(P<0.05),之后開始迅速上升,到第7 d 時表達(dá)顯著性升高(P<0.05),之后逐漸下降,見表2。
表2 小鼠皮膚創(chuàng)面組織中PCNA、α-SMA、Type Ⅰ collagen含量組織學(xué)評分結(jié)果(分,
在皮膚創(chuàng)面形成早期,機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活,較多中性粒細(xì)胞浸潤,隨后出現(xiàn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤[5]。入侵微生物被炎癥細(xì)胞吞噬,并通過炎癥細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和生長因子促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。研究結(jié)果顯示,氧化苦參堿使小鼠創(chuàng)面愈合過程的中、后期未愈合創(chuàng)面面積顯著減?。籚an Gieson染色結(jié)果顯示,氧化苦參堿組創(chuàng)面被新生表皮覆蓋,新生纖維膠原與表皮平行生長,呈現(xiàn)有序排列,較創(chuàng)面對照組肉芽組織填充更快,新生毛細(xì)血管增多,促進(jìn)創(chuàng)面早期修復(fù)[6-7],以給藥第9 d及第11 d效果最為明顯。提示氧化苦參堿可促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合。
PCNA是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[8-9]。靜止的細(xì)胞PCNA幾乎不表達(dá)。皮膚組織中的PCNA主要定位于表皮基底層細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),在皮膚組織的發(fā)生與修復(fù)過程中PCNA表達(dá)增強(qiáng)[10]。研究表明,通過YAG 激光及強(qiáng)脈沖光激光多次刺激小鼠皮膚,增強(qiáng)了PCNA 表達(dá),使皮膚細(xì)胞增殖活性增強(qiáng),促進(jìn)皮膚結(jié)構(gòu)重建,達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果[11]。本實驗研究結(jié)果顯示,在愈合過程中,氧化苦參堿(20、40、80 mg/kg)組在7 d 時PCNA 表達(dá)高于創(chuàng)面對照組,對小鼠創(chuàng)面組織細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。提示在小鼠創(chuàng)面愈合過程中、后期,氧化苦參堿使PCNA表達(dá)顯著增加。
α-SMA是一種異常的纖維細(xì)胞-肌纖維母細(xì)胞,與創(chuàng)面收縮關(guān)系密切[12-13]。目前認(rèn)為,α-SMA 的表達(dá)使肌成纖維細(xì)胞的收縮能力增加,使肉芽組織纖維化,促進(jìn)結(jié)締組織的形成[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),α-SMA 在創(chuàng)面形成初期3 d 時開始表達(dá)。氧化苦參堿(20 mg/kg)組的α-SMA隨時間表達(dá)量逐漸增加,到創(chuàng)面愈合中、后期α-SMA表達(dá)量較高,而未愈合創(chuàng)面面積明顯減小。提示氧化苦參堿促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合與α-SMA表達(dá)有關(guān)。
成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合過程中的主要細(xì)胞,成纖維細(xì)胞合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,其中包括Type Ⅰ collagen,細(xì)胞依附其生長。當(dāng)成纖維細(xì)胞生長受到抑制,細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生明顯改變,Type Ⅰ collagen分泌減少,從而影響創(chuàng)面愈合[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面對照組的VG染色顯示新生纖維膠原的增加主要見于真皮全層,可見分布均勻、排列稀疏、呈波浪樣、紅色深染膠原纖維束,而氧化苦參堿各組小鼠損傷部位皮膚膠原纖維染色略深,成熟膠原增加,但以淺層變化較為明顯。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,小鼠皮膚創(chuàng)傷后,Ⅰ型膠原纖維在創(chuàng)傷愈合早、中期排列較為紊亂;愈合后期第7、9 d時Ⅰ型膠原纖維排列較為規(guī)律;組織學(xué)評分結(jié)果顯示,氧化苦參堿各給藥組Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)在愈合過程各時間點的整體水平高于創(chuàng)面對照組,各組呈現(xiàn)由低到峰值再下降的趨勢。提示氧化苦參堿可增加小鼠皮膚創(chuàng)面中Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)。
綜上所述,氧化苦參堿能增加皮膚創(chuàng)面的愈合中PCNA、α-SMA及Type Ⅰ collagen的表達(dá)。由于創(chuàng)面愈合過程復(fù)雜,影響因素眾多,氧化苦參堿對創(chuàng)面愈合的影響是否通過其他作用靶點,還需要進(jìn)一步研究。