高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留量

湯水粉，錢卓真，位紹紅，王麗娟

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

硝基咪唑類藥物含有5-硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，具有抗原蟲和抗菌活性，可用于防治滴蟲病、球蟲病以及六鞭蟲病等疾病[1-2]，深受養(yǎng)殖戶的青睞，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，硝基咪唑主要用于治療寄生蟲的感染，導(dǎo)致該類藥物在水產(chǎn)品中殘留[3]。由于硝基咪唑及其在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有潛在的致突變性和致癌性，如果在動物源性食品中殘留累積，則會對食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4-5]。因此，許多國家將硝基咪唑列為違禁藥物。我國已將這類藥物列入《食用動物禁用的獸藥及其他化合物清單(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號)》中。歐盟于1993年、1995年和1998年分別禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑這3種藥物用于食用動物；2002年美國食品與藥物管理局公布了在進(jìn)口動物源性食品中禁止使用包括地美硝唑等硝基咪唑類藥物在內(nèi)的共11種藥物[6]；我國食品中獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的只能用于治療，但不得在動物性食品中檢出的藥物就包括甲硝唑和地美硝唑[7]。

目前，國內(nèi)外用于水產(chǎn)品、獸產(chǎn)品等動物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、氣相色譜法[13]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[14-15]。其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因靈敏度高、選擇性和特異性好、操作簡單、能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn)，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中各類藥物殘留的檢測[16-17]。本研究在已有文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了前處理方法，采用乙酸乙酯提取、正己烷除脂，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜高度的選擇性和抗干擾能力，建立了水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的快速檢測方法。該方法的靈敏度高，實驗周期短，提高了工作效率。改進(jìn)后的方法簡便、準(zhǔn)確，能更好地滿足水產(chǎn)品中硝基咪唑及其代謝物檢測的要求，適合于大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用水產(chǎn)品均購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場、超市或養(yǎng)殖戶。樣品采回后取適量肌肉部分進(jìn)行均質(zhì)，所有基質(zhì)樣品于-20℃冷凍保存，待用。

硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer)，純度≥98%；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(美國Tedia)，色譜純；無水硫酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純；實驗用水為Millipore Academic制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司)；MS105電子分析天平、 ME203E/02電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司)；MS3型旋渦混合器(德國IKA公司)；離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)。

1.3 樣品前處理方法

稱取(5.00±0.05) g均質(zhì)后的樣品，置于100 mL的塑料離心管，加入5 mL磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)，渦旋混勻。再加入30 mL乙酸乙酯和3 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩50 s，以3 500 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入100 mL雞心瓶。殘渣加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并提取液于100 mL雞心瓶。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃水浴蒸干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 10%甲醇水溶液，渦旋振蕩溶解殘留物，再加入1 mL乙腈飽和正己烷渦旋混合30 s，以4 000 r/min離心5 min，取下層清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Hypersil Gold C18柱(100 mm × 2.1 mm，3.0 μm，美國 Thermo公司)；柱溫：30℃；

流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇；流速：0.250 mL/min。

流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子傳輸管溫度：350℃；噴霧電壓：3.0 kV；汽化溫度：200℃；鞘氣(氮氣)壓力：45 arb；輔助氣(氮氣)壓力：10 arb；碰撞氣(高純氬氣)壓力：1.5 mTorr。10種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters of nitroimidazoles and their metabolites

續(xù)表2

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取適量的每種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，先用甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再用甲醇稀釋成濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)中間液。

根據(jù)每種硝基咪唑及其代謝物的靈敏度和線性范圍，分別吸取濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間液5.00～200 μL，配制成濃度為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，以各組分的峰面積(Y)和相對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 回收率與精密度

稱取(5.00±0.05)g勻漿后的樣品，分別加入一定量不同濃度的硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按同樣的樣品前處理方法進(jìn)行提取、凈化以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，計算各種硝基咪唑藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的確定

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗采用蠕動泵，分別將10種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為1 μg/mL)以10 μL/min的流速注入電噴霧離子源，在ESI正離子模式下，對10種硝基咪唑藥物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇離子豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子，第二強(qiáng)的子離子作為定性離子。最后在選擇反應(yīng)監(jiān)測正離子模式下，再次優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表2，總離子流圖見圖1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物及其代謝物是一種中等極性化合物，已有文獻(xiàn)證實反相色譜柱更適合該類化合物的分離與檢測[18]。因此，實驗評估了Thermo Hypersil Gold C18柱和 Agilent ZORBAX SB-C18柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)10種硝基咪唑類藥物在兩種色譜柱上均可實現(xiàn)較好的分離。但是使用Agilent ZORBAX SB-C18柱分離時，色譜峰拖尾，而采用 Thermo Hypersil Gold C18柱作為分析柱時，基線穩(wěn)定，色譜峰拖尾較少，峰形更好。因此，實驗采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱作為分析柱。

由于硝基咪唑類藥物易溶于甲醇和乙腈，微溶于水，實驗選擇反相色譜常用的甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系，并在水相中加入0.1%甲酸促進(jìn)離子化，研究其對分離效果和峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相時，10種硝基咪唑類化合物的分離效果較差，而0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時，可以更好地提高檢測的靈敏度和分離效果，獲得理想的色譜峰。本文還研究了在0.1%甲酸水溶液中加入5.0 mmol/L乙酸銨對10種硝基咪唑類藥物分離效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)在流動相中加入一定量的乙酸銨后，部分目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度下降，而且色譜峰出現(xiàn)峰展寬的現(xiàn)象。因此本實驗選用甲酸水溶液-甲醇作為流動相。此時目標(biāo)化合物能被較好地分離，其色譜圖見圖1。

綜上所述，本研究選用Thermo Hypersil Gold C18柱、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相對硝基咪唑藥物進(jìn)行分離分析。

2.2 前處理方法的選擇

常用于提取動物組織內(nèi)的硝基咪唑類藥物的溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等[18-20]，乙腈和甲醇雖然能提取硝基咪唑及其代謝物，而且能沉淀蛋白質(zhì)，但是其也能與水混溶，會導(dǎo)致水溶性雜質(zhì)較多，給后續(xù)的凈化與分析帶來干擾，加標(biāo)回收率比較低；相比甲醇和乙腈，乙酸乙酯極性較低，在提取硝基咪唑類藥物的同時能減少水溶性雜質(zhì)的溶出；而且硝基咪唑類藥物有一定的熱敏感性，如果在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟中水浴溫度過高，將導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，因此在實驗過程中應(yīng)盡可能選用沸點較低的有機(jī)溶劑，乙酸乙酯低沸點的特點可以彌補(bǔ)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟中過高的水浴溫度或過長的濃縮時間導(dǎo)致回收率偏低的缺點，更適合作為提取溶劑。因此實驗首先選用乙酸乙酯進(jìn)行考察。因動物源性食品樣品含有大量的脂肪等雜質(zhì)，提取液用正己烷脫脂。研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯溶劑對10種硝基咪唑類化合物的回收率可達(dá)70.0%～120%?？紤]到硝基咪唑類藥物具有酸堿兩性性質(zhì)，即在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)，在弱酸性狀態(tài)下呈質(zhì)子化狀態(tài)，因此提前在樣品中加入磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)預(yù)處理，使目標(biāo)物以游離分子狀態(tài)存在，再加入乙酸乙酯進(jìn)行提取。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，加入pH=8.0的弱堿性磷酸鹽緩沖溶液時，樣品回收率在70.0%～120%范圍內(nèi)，且平行性比在中性狀態(tài)下提取的更好。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評估

由于水產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜，常對待測物產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此本研究用流動相和空白水產(chǎn)品樣品經(jīng)提取后的定容液分別繪制系列濃度的硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，將兩種方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果進(jìn)行比較，即基質(zhì)效應(yīng)(%)=空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果/流動相配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果×100，以此評價樣品所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，在樣品基質(zhì)中各種硝基咪唑類藥物的基質(zhì)效應(yīng)在86.8%～108%之間，結(jié)果見圖2。可見，經(jīng)本方法進(jìn)行前處理后10種硝基咪唑類藥物的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受的范圍內(nèi)。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

在上述優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，測得標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1)。從圖中可知，在該優(yōu)化條件下，各種硝基咪唑類藥物得到了很好的分離，且未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)色譜峰的干擾。同時對序列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以峰面積對硝基咪唑類藥物的質(zhì)量濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)。試驗結(jié)果表明，10種硝基咪唑類藥物線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0，說明該方法適用于硝基咪唑類藥物的定量分析。

表3 10種硝基咪唑類藥物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Tab.3 Linear equations and correlation coefficients of ten nitroimidazoles

續(xù)表3

2.5 方法的靈敏度和回收率實驗

由于在液質(zhì)聯(lián)用儀分析樣品的過程中，存在基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品進(jìn)行加標(biāo)處理后，在以信噪比(S/N)>3的前提下，求得10種硝基咪唑類藥物的檢出限為1.00 μg/kg。以不含硝基咪唑類藥物的空白樣品為研究對象，本實驗以魚肉為例，在樣品中分別加入1.00、2.00和5.00 μg/kg三個濃度水平的硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度做三個平行實驗，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，圖3為空白樣品和添加量為5.00 μg/kg的加標(biāo)樣總離子流圖，加標(biāo)回收率和精密度的實驗結(jié)果見表4?？芍诓煌募訕?biāo)濃度下，樣品的回收率均在70.2%～119.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏均差(n=3)在13.5%以下。從試驗結(jié)果可以看出，該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留量檢測的要求。

表4 魚肉加標(biāo)樣的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.4 Recoveries and RSDs for spiked fishes sample

2.6 實際樣品測定

采用本方法對本地區(qū)市售的鯉魚、草魚和鯽魚等共88份樣品進(jìn)行了檢測，均未檢出硝基咪唑類藥物。相關(guān)部門應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)水產(chǎn)品中硝基咪唑藥類物殘留量的監(jiān)測，保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

3 結(jié)論

本研究在相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過對前處理條件和檢測條件的優(yōu)化，實現(xiàn)水產(chǎn)品中10種硝基咪唑類藥物殘留的同時測定。實驗采用乙酸乙酯提取水產(chǎn)品中的硝基咪唑并用正己烷除脂，凈化后在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上檢測，以甲酸水溶液/甲醇作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，改善了硝基咪唑類藥物的響應(yīng)值和峰形，提高檢測的靈敏度。

在本檢測條件下，10種硝基咪唑線性范圍為5.00～200 ng/mL。線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0。對魚肉空白樣品進(jìn)行10種硝基咪唑的加標(biāo)實驗，加標(biāo)量分別為1.00、2.00、5.00 μg/kg，回收率在70.2%～119%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏均差(n=3)在13.5%以下。該檢測方法與原有的標(biāo)準(zhǔn)方法[20]相比，操作更簡便，靈敏度更高，適用于水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的大批量檢測。