ACE抑制肽的制備、構(gòu)效關(guān)系及活性評價研究進(jìn)展

沈嘉森，蘇永昌，林河通，李水根，陳曉婷，劉智禹*

(1.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；4.福建海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)校，福建 福州350002)

高血壓是以動脈收縮壓或舒張壓增高為特征的慢性病，同時是引起多種并發(fā)癥的心血管疾病[1]。目前，常見的沙坦類、普利類等降血壓藥都有良好的降壓效果，但易引起血膽固醇、甘油三酯升高，提高糖脂代謝異常等糖尿病的發(fā)病機(jī)率，引發(fā)蛋白尿等腎衰竭癥狀，更嚴(yán)重者還會導(dǎo)致心率過緩、誘發(fā)急性心力衰竭[2]。而天然提取的降血壓抑制肽生物活性多[3-4]、經(jīng)濟(jì)價值高、易消化吸收、安全性高等[5]特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。圍繞食源性血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-I converting enzyme，ACE)抑制肽開發(fā)高效的降血壓活性產(chǎn)品具有很高的研究價值。但絕大多數(shù)抑制肽只在活性上做研究，未能對制備工藝、分離純化體系作出總結(jié)[6]。因此，本文歸納ACE抑制肽的發(fā)展及維持血壓平衡作用的關(guān)系，從ACE抑制肽的工藝制備、分離純化鑒定、構(gòu)效關(guān)系、體內(nèi)外活性評價研究方面展開論述，以期為深入研究ACE抑制肽奠定基礎(chǔ)。

1 ACE抑制肽概況

ACE屬二肽外肽酶，是含鋅元素的羧基肽酶。作為機(jī)體腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)中的調(diào)節(jié)劑，廣泛分布于肺、睪丸等組織臟器中[7-8]。在平衡血壓方面，血漿中的ACE酶將無活性的十肽血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)的羧基端水解成有活性的八肽血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)和二肽的組氨酰亮氨酸(His-Leu)，從而促進(jìn)血管收縮、血壓升高。除了誘導(dǎo)血管緊張素Ⅱ收縮外，它還作用于激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS) 抑制緩激肽(Bradykinin，BK)分解成無活性片段，也會使血壓增高[9]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEⅠ)是通過抑制Ang Ⅱ的合成或減少緩激肽的釋放，從而為降低血壓提供有效途徑[10]。ACE抑制肽在平衡血壓中起到?jīng)Q定性作用。Oshima G等[11]最早是在明膠食物中進(jìn)行細(xì)菌膠原酶降解時獲得的ACE抑制肽，通過分析其氨基酸組成和SephadexG-25證實(shí)了其6條ACE抑制活性較強(qiáng)序列主要集中在分子量較小的部分；Wang J P等[8]研究的牡蠣純化ACE抑制肽VVYPWTQRF(Val-Val- Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe)對小鼠有降壓活性。因此，研究ACE抑制肽對高血壓患者治療有積極作用和廣闊前景[12]。

2 ACE抑制肽的制備

ACE抑制肽以食源性蛋白為原料，包括馬鈴薯[13]、葵花籽[14]、昆蟲[15]、牡蠣[16]、禽類[17]等動植物，通過酸堿提取法、微生物發(fā)酵法、虛擬水解法及酶解法等制備方法[18]進(jìn)行提取。

2.1 酸堿提取法

酸堿提取法是指利用適量的酸或堿與蛋白源生物體反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)pH使蛋白成分溶解析出的一種提取方式，但成本較高、提取效率極低。范彥娜等[19]通過堿溶酸沉的方式直接從枸杞提取ACE抑制肽，多肽粗蛋白提取含量僅占34.15%，ACE活性約為71.15%。楊敏[20]以鰈(Paralichthysolivaceus)魚皮為原料，通過加入磷酸浸泡提取膠原蛋白，結(jié)果表明磷酸可提取出典型的Ⅰ型膠原蛋白，提取得率達(dá)41.1%。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法利用微生物代謝發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)酶解成小分子生物活性肽，該法成本低，可獲得較好的ACE抑制活性，但操作繁瑣[21]。姚雨杉[22]利用納豆芽胞桿菌發(fā)酵魷魚加工副產(chǎn)物，通過響應(yīng)面分析得到最佳工藝參數(shù)：在發(fā)酵時間37.5 h、發(fā)酵溫度42.1℃、接種量6.0%、料液比22.7的條件下制備樣品，測得其ACE抑制率為82.22%。高潔等[23]采用納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊，通過單因素和響應(yīng)面方法的結(jié)合，在發(fā)酵時間38.4 h、發(fā)酵溫度39.9℃、接種量6.0%、料液比22.5的工藝下得到的ACE抑制率為83.70%。

2.3 虛擬水解法

虛擬水解是利用已知蛋白序列，借助計算機(jī)的特定酶解技術(shù)進(jìn)行酶切，將水解得到的特定小肽進(jìn)行數(shù)據(jù)庫篩選比對[24]，找到高活性的多肽，此法可直接獲得特定的多肽序列，且抑制活性較好，但模擬篩選的方式較傳統(tǒng)酶解方法仍有較多不確定的因素。紀(jì)慧卓等[25]基于生物信息學(xué)的方式，以大黃魚為蛋白源虛擬酶解出CMK、GWR、 WAK 和 WQK，其IC50分別為 0.19、2.40、0.40、1.10 mmol/L。于志鵬等[26]虛擬酶解雞蛋蛋白，通過生物活性、分子質(zhì)量、水溶性、吸收代謝等性質(zhì)預(yù)測出與ACE能穩(wěn)定結(jié)合的FQK、WGK、ADW，其IC50分別為(250±0.25)、(222.74±1.02)、(85.38±0.54)μmol/L。

2.4 酶解法

酶解法是由于蛋白酶具有不同的特異性酶切位點(diǎn)，將蛋白質(zhì)分子酶切成多個小片段的氨基酸序列，從而獲得具有降血壓功效的ACE抑制肽等天然產(chǎn)物，是目前制備活性肽最常用的方法，具有專一性和高效性等特點(diǎn)[27-28]。Lee J K等[29]利用6種蛋白酶在適宜水解條件下酶解鮭(Oncorhynchusketa)魚皮，結(jié)果顯示胰蛋白酶的IC50為1.08 mg/mL，表現(xiàn)出最高的ACE抑制活性。Khiari Z等[30]在胃蛋白酶酶解24 h條件下，研究獲得的魚皮副產(chǎn)物多肽的ACE抑制活性為74.1%，具有抗氧化、降血壓等多種生物活性。

3 ACE抑制肽的分離純化

食源性的蛋白通過多種提取方式加工制備混合多肽，但其酶解液成分復(fù)雜，要研究多肽的生物活性還需進(jìn)一步分離純化[31]。目前，多肽的提取制備主要基于膜分離、凝膠層析和離子交換層析等技術(shù)及反向高效液相色譜法進(jìn)行逐級分離純化[32]。

3.1 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)(Membrane separation technique，MST)是多肽的混合物根據(jù)不同分子量的孔徑大小，通過陶瓷膜和超濾膜等，實(shí)現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)，可達(dá)到分離提純的目的[33]，其在常溫下有效成分損失少、操作方便、濃縮成本低。目前，根據(jù)孔徑的截留量劃分為微濾(Microfiltration，MF)、超濾(Ultrafiltration，UF)、納濾(Nanofiltration，NF)等。本文介紹的超濾技術(shù)是利用膜的兩側(cè)能量差作為推動力，通過超濾膜表面的微孔結(jié)構(gòu)，截留分子量范圍在1～300 kDa的蛋白質(zhì)、多肽等分子。Cao D等[34]通過超濾得到>10 kDa、3～10 kDa和<3 kDa三個組分，提取<3 kDa的龍須菜胰蛋白酶多肽液具有(78.15±1.56)%的ACE抑制活性。宋華曾等[35]超濾魚回(Ictaluruspunctatus)魚皮明膠提取液，得到>3 kDa和<3 kDa兩組分多肽，體外活性評價表明<3 kDa的抑制活性優(yōu)于>3 kDa，并進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)獲得了驗(yàn)證。綜上研究表明，小分子量多肽的生物活性優(yōu)于大分子量多肽[36]。

3.2 凝膠層析技術(shù)

凝膠層析技術(shù)(Gel filtration chromatography，GFC)也稱分子篩/排阻色譜，基于不同分離物的蛋白分子量大小差異，根據(jù)凝膠篩分子量大的先出峰的洗脫原理獲取活性高的目標(biāo)物質(zhì)[37]，其操作條件溫和、不需要有機(jī)溶劑、能分離出高分子物質(zhì)，但對于分子量接近的蛋白質(zhì)分離效果較差。Lin Y H等[38]利用Sephadex G-15凝膠柱將PN-1蛋白洗脫出7個組分，其F組分顯示最高的IC50，為0.015 mg/mL。Zhang T等[39]通過Sephadex G25、Superdex 10/300 GL純化獲得的牡蠣蛋白G1E1的IC50為0.045 mg/mL。

3.3 離子交換層析

離子交換層析(Ion-exchange chromatography，IEC)利用蛋白質(zhì)分子所帶電荷的不同這一特性，在一定pH濃度下與離子交換劑進(jìn)行分離洗脫，從而達(dá)到分離提純的目的[37]，但遇到特殊的蛋白結(jié)構(gòu)則難分離。Liu P R等[16]通過固定化金屬離子交換純化了兩種新穎的ACE抑制肽His-Leu-His-Thr(HLHT)和Gly-Trp-Ala(GWA)，IC50值分別為(458.06±3.24) μmol/L和(109.25±1.45) μmol/L。Wu S G等[40]利用IEC離子交換層析從魚肉蛋白水解產(chǎn)物中純化出新型ACE抑制肽Arg-Val-Cys-Leu-Pro(RVCLP)，對其進(jìn)行體外ACE抑制活性研究，測得IC50值為175 μmol/L。

3.4 反向高效液相色譜

反向高效液相色譜法(Reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)以非極性的反相介質(zhì)為固定相、極性有機(jī)溶劑或其水溶液作為流動相進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離，利用極性較強(qiáng)或親水的樣品分子與反相柱中的固定相結(jié)合作用較弱而使溶質(zhì)較快流出，普遍適用于分離極性、非極性或離子型化合物，具有良好的選擇性。Ji W等[41]通過多步純化得到的超濾水解產(chǎn)物(AKH)在IEC和RP-HPLC技術(shù)分離下，得到六肽Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro，其IC50為(0.93±0.05) mg/mL。

4 ACE抑制肽的鑒定和分子模擬

分離純化后的多肽，通過對其多肽序列進(jìn)行鑒定，從而篩選出有ACE抑制作用的氨基酸序列；利用降血壓數(shù)據(jù)庫與序列進(jìn)行比對，將分子模擬技術(shù)進(jìn)一步運(yùn)用，找到與ACE具有高效相互作用的序列，通過計算機(jī)篩選、固相合成出序列，以進(jìn)行下一步的體外活性實(shí)驗(yàn)。

4.1 氨基酸序列的鑒定

氨基酸序列的鑒定方法包括質(zhì)譜、核磁共振、紅外/紫外光譜等技術(shù)[42]。其中，質(zhì)譜(Mass spectrometry，MS)是諸多鑒定蛋白質(zhì)和多肽序列結(jié)構(gòu)較為廣泛的方法，利用樣品去離子化后，以離子的質(zhì)荷比不同而實(shí)現(xiàn)分離，再根據(jù)離子譜峰的強(qiáng)度差異而達(dá)到分析的目的[43-44]。Abdel-Hamid M等[45]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對水牛乳肽進(jìn)行鑒定，分析質(zhì)譜結(jié)果得到QPPQ、IPPK、FPGPIPK和IVPN等4種新型ACE抑制肽。Kim H J等[46]通過多種純化技術(shù)，結(jié)合電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜儀，鑒定分析得到發(fā)酵魚醬中的4種ACE抑制肽，分別為 PK、GCK、NHP和DGGP。

4.2 多肽分子模擬

分子模擬是利用計算機(jī)以原子水平的分子模型為基礎(chǔ)，模擬出分子體系的物理、化學(xué)特性，應(yīng)用于多肽包括分子對接、分子動力學(xué)和構(gòu)效分析等[47]方面的研究。

4.2.1 分子對接

ACE分子對接運(yùn)用分子模擬軟件，主要研究ACE與ACE抑制劑分子間的相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系[30，48]。Shi L等[49]對ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK進(jìn)行分子對接，得出ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK可能對ACE的殘基Glu123、Glu403、Arg522、Glu376、Gln281和Asn285有抑制作用。Jalkute C B等[50]研究睪丸截短型ACE(tACE)與賴諾普利抑制劑的分子模擬，結(jié)果表明tACE的殘基Ala 354、Glu 376、Asp 377、Glu 384、His 513、Tyr 520和Tyr 523通過氫鍵相互作用穩(wěn)定作用于賴諾普利。王曉丹[51]將YS和INNQFLPYPY通過范德華力和靜電力與ACE發(fā)生結(jié)合，INNQFLPYPY與ACE中部的氨基酸殘基His365、Lys522和 His524發(fā)生氫鍵相互作用。

4.2.2 分子動力學(xué)

ACE抑制肽分子動力學(xué)反應(yīng)是基于多肽與酶發(fā)生催化作用，研究酶濃度與抑制肽的反應(yīng)速率。一般分為不可逆抑制和可逆抑制，可逆抑制進(jìn)一步細(xì)分為競爭性、非競爭性和反競爭性抑制[52]。Zhang B Y等[53]通過分離純化蛋清多肽，分析ACE抑制肽LAPYK的分子動力學(xué)特性，結(jié)果顯示LAPYK為競爭抑制劑。Zarei M等[54]在棕櫚仁蛋糕分離純化的三條ACE抑制肽，分別為YLLLK、WAFS和GVQEGAGHYALL，應(yīng)用ACE抑制肽分子動力學(xué)反應(yīng)分析3條抑制肽均為混合型抑制劑。

4.2.3 構(gòu)效分析

定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)利用計算機(jī)數(shù)理統(tǒng)計模型來研究抑制肽的生物活性與分子結(jié)構(gòu)的效應(yīng)關(guān)系以及抑制肽在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等生理性質(zhì)。Shu M等[48]利用偏最小二乘法對58個二肽、55個三肽和50個四肽進(jìn)行定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系模型表征，QASR的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.902、0.985和0.872，交叉驗(yàn)證(q2)分別為0.860、0.951和0.770，結(jié)果得出ACE抑制肽序列的疏水性和空間特性在生物活性上起著重要作用。雖然ACE的構(gòu)效分析并不完善，但ACE抑制肽的活性可能受其氨基酸含量影響，大部分研究也表明含疏水性的羧基端是導(dǎo)致ACE抑制活性的關(guān)鍵[55]。Qi C Y等[56]基于3D-QSAR與分子對接研究含有疏水性殘基苯丙氨酸C末端的ACE抑制肽的生物活性，構(gòu)建了CoMFA(q2= 0.773，r2= 0.992)和CoMSIA(q2= 0.664，r2= 0.990)模型，固相擬合了4種ACE抑制三肽GEF、VEF、VRF和VKF，通過體外活性得出IC50值分別為13、23、5和11 mmol/L，與預(yù)測值基本吻合。

5 ACE抑制肽在體內(nèi)及體外活性評價

檢驗(yàn)分離純化的ACE抑制肽是否具有生物活性，一方面是在體外研究多肽的ACE抑制率及穩(wěn)定性；另一方面通過構(gòu)建原發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR) )模型，在體內(nèi)進(jìn)行口服灌胃、尾部靜脈等實(shí)驗(yàn)，以血壓值、血清和肺組織中的ACE活性和Ang II含量為指標(biāo)，探究ACE抑制肽作用機(jī)制。

5.1 大鼠體內(nèi)活性評價

ACE抑制肽體內(nèi)活性研究多以SHR的血壓值為指標(biāo)，研究其降壓活性[57]。Girgih A T等[58]將鮭魚蛋白SPH進(jìn)行RP-HPLC分離，得到SF1～SF4組分，將30 mg/kg SF3組分經(jīng)大鼠口服給藥2 h后，結(jié)果表明其能降低大鼠血壓值(42.1 ± 3.4) mmHg。Lee J K等[29]分離純化出3個ACE抑制合成肽(Gly-Leu-Pro、Asn-Leu-Pro、Gly-Leu-Pro)，其中Gly-Leu-Pro在體內(nèi)活性和體外功能評價中均表現(xiàn)出降血壓的生理功能。張可佳等[59]等將牡蠣ACE抑制肽灌胃大鼠的28 d實(shí)驗(yàn)中，第21 天 ACE抑制肽的降壓效果顯著優(yōu)于灌胃同等質(zhì)量的生理鹽水，且具有良好的消化穩(wěn)定性。García-Tejedor A等[60]在牛乳鐵蛋白中提取ACE抑制肽，通過口服灌胃10 mg/kg多肽(DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP、KLRP、LRP和GILRP)進(jìn)行SHR血壓試驗(yàn)，并在藥理水平上研究ACE活性和Ang Ⅱ含量，結(jié)果顯示DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP和LRP均可有效降低血壓20～30 mmHg，灌胃DPYKLRP和LRP的ACE活性、Ang Ⅱ含量均降低。

5.2 體外功能活性評價

體外研究檢測相對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)操作簡單、可靠性強(qiáng)，研究方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法等[61]。根據(jù)反應(yīng)體系，ACE抑制劑與ACE酶的活性位點(diǎn)相結(jié)合，阻斷了Ang II 與失活片段的生成，以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)為Ang I的模擬物，HHL被ACE分解后生成馬尿酸(Hippuric acid，HA)和二肽(His-Leu，HL)，通過測定HA的含量分析ACE抑制肽的體外降壓活性。Cushuman D W等[61]利用紫外分光光度法，以HHL作為底物添加ACE和ACE抑制肽，通過在λ=228 nm下測定HHL的吸光值來檢測ACE抑制肽的活性。Wu J等[33]利用RP-HPLC分離技術(shù)，在C18柱上將抑制肽和HHL的反應(yīng)物通過三氟乙酸、乙腈和水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，定量地分析HHL和HA的峰面積。Wang Y T等[47]通過胃蛋白酶模擬體外消化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，分析5個ACE抑制肽的胃腸道穩(wěn)定性，其中3個二肽Gln-Trp、Cys-Tyr和Cys-Trp被消化吸收失去活性，另外2個多肽Cys-Met和Cys-Cys則可以抵抗酶的消化作用。趙玉菲等[62]研究體外環(huán)境對大海馬多肽蛋白PH- I活性的影響，將PH- I分離出PH- I1～ PH- I4結(jié)果表明溫度對PH-I3活性沒有影響，PH-I3多肽在中性和堿性的條件下具有良好的穩(wěn)定性，但在高糖、高鹽下易失活。一些食源性ACE抑制肽具有較高的抑制活性，但經(jīng)過人體腸胃消化分解后卻沒有體現(xiàn)出抑制作用，可能的原因之一是氨基酸序列的肽鍵易受外界腸胃模擬消化系統(tǒng)的蛋白酶水解而導(dǎo)致肽鏈斷裂，從而未形成與ACE有相互作用的肽段[63]。

6 展望

ACE抑制肽日趨成為研究的熱點(diǎn)，因其高效的降壓作用，可穩(wěn)定改善大鼠的高血壓癥狀，而受到廣泛關(guān)注。在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證ACE抑制肽具有安全有效、無毒副作用、易消化吸收、長期服用能穩(wěn)定降壓等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著我國高血壓人群數(shù)量在不斷攀升，開發(fā)食源性ACE抑制肽有利于改善服用化學(xué)合成抑制劑的高血壓患者的多種不良反應(yīng)。目前，ACE抑制肽在制備工藝、分離純化技術(shù)及構(gòu)效關(guān)系等領(lǐng)域研究較為完善，但仍有不足之處，混合肽制備降壓藥成本昂貴；分離純化過程中多肽損失較多；加工環(huán)境下多肽活性難以保留，且其在胃腸消化系統(tǒng)中不能穩(wěn)定被吸收。混合降壓肽開發(fā)成為天然高效的保健食品還有待進(jìn)一步探究。因此，鑒定出食源性多肽的氨基酸序列，通過ACE抑制肽與ACE的構(gòu)效關(guān)系分析出高效的純肽，在藥理水平和細(xì)胞水平上對純肽進(jìn)行降壓機(jī)理研究，但在保證最大程度地發(fā)揮其降壓效果等方面還有待進(jìn)一步研究。