黔北麻羊RARs基因在不同組織中的表達分析

吳壽堂，祝家秘，溫曉艷，周志楠，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊（Qianbei Ma goat）又名麻羊，主產(chǎn)于貴州省北部地區(qū)的遵義市仁懷市與習(xí)水縣等地，是基于貴州省較為獨特的喀斯特地貌而形成的具有獨特特性的地方山羊品種。身處云貴高原地區(qū)的黔北麻羊能較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂?、自然和地理環(huán)境。在生產(chǎn)性能方面，黔北麻羊體格較大、體質(zhì)結(jié)實、四肢粗壯，屬毛皮肉兼用型品種，皮膚大多為花色，因遺傳性能穩(wěn)定、抗逆性強、耐粗飼、繁殖力高而聞名，是寶貴的畜禽遺傳資源。

視黃醇（Retinol）是維生素A的化名，分子式為CHO，其具有維持正常視覺、促進生長發(fā)育、調(diào)節(jié)營養(yǎng)等重要功能，對哺乳動物的生長發(fā)育十分重要。早期研究表明，在體內(nèi)，視黃醇通過代謝演變?yōu)榛钚砸蜃右朁S酸（Retinoic Acid，RA）在體內(nèi)調(diào)控RNA與蛋白質(zhì)的表達豐度，進而影響哺乳動物生殖細胞的生長發(fā)育以及氨基酸的吸收和發(fā)揮。而RA的活性主要由視黃酸受體（Retinoic Acid Receptors，）和類視黃醇X受體（Retinoid X receptors，）所介導(dǎo)，進入體內(nèi)發(fā)揮作用。RARs是RA誘導(dǎo)的屬于類固醇和甲狀腺激素受體超家族的轉(zhuǎn)錄加強因子，也是RXRs的一種異二聚體，相對于，在多種信號通路中起到主要的調(diào)控作用。RARs具有和3種亞型。研究表明，在調(diào)節(jié)各種細胞的增殖發(fā)育、形態(tài)變化、代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等多個方面具有廣泛的生物學(xué)活性。最新數(shù)據(jù)顯示，家族基因中（）、（）和（）分別定位在山羊的第19號、第27號、第5號染色體上，染色體的不同定位證實了視黃酸受體家族基因功能的多樣性。此外，還有研究顯示基因在大白豬的性腺組織中也具有廣泛的表達，現(xiàn)如今，還被當(dāng)作是小尾寒羊（綿羊）高繁殖力的差異基因。

目前，家族基因在豬、牛、綿羊等動物組織表達中均有研究報道，但其在山羊不同組織中的表達研究尚未發(fā)現(xiàn)，故本實驗以貴州優(yōu)良地方山羊品種黔北麻羊為研究對象，探究家族基因在黔北麻羊不同組織中的表達量，以期為后續(xù)進一步研究家族基因功能以及對山羊繁殖性狀的調(diào)控機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黔北麻羊來自貴州省習(xí)水縣，選取健康、體況相近的母羊3頭，依據(jù)貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740-2017）進行屠宰，立即采集心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個組織進行相應(yīng)處理。于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑 紫外光分光光度計（Qubit 4，Thermo Fisher）；電泳儀（DYY-2C型，六一儀器廠）；PCR擴 增 儀（C1000 TouchTM，Thermo Fisher）、實時熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time System，Bio-Bad）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II，Bio-Bad）。TRIzol試劑、液氮、三氯甲烷、0.5×TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、西班牙瓊脂糖均購自貴州羅德宏信生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑2×Ts Master RT-qPCR Mix（擎科生物）；第一鏈cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)）。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的山羊（）基因序列（登錄號：XM_018065 032.1）、基因序列（登錄號：XM_013975483.2）、基因序列（登錄號：XM_018047691.1），運用軟件Primer 5.064設(shè)計熒光引物，以作為熒光定量的內(nèi)參基因。引物由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。詳細信息見表1。

表1 引物信息

1.4 RNA的提取及cDNA合成 按照TRIzol結(jié)合液氮研磨以提取黔北麻羊心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個組織的總RNA，隨后于超微量分光光度計下進行檢測，若圖像呈現(xiàn)單峰、曲線平滑并且D/D值在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)，則證明所提取的RNA沒有被污染，可用于進行下一步實驗研究。根據(jù)HiFi Script cDNA Synthesis Kit試劑盒（康為世紀(jì)）進行逆轉(zhuǎn)錄，超微量分光光度計下測定其濃度，合格的產(chǎn)物放置于-20°保存。

1.5 實時熒光定量PCR RT-qPCR反應(yīng)體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL、cDNA（1 000 ng/μL）1 μL、Primer sense（10 μmol/L）0.5 μL、Primer Anti-sense（10 μmol/L）0.5 μL、ddHO 3 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s、62.3℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，設(shè)置3個重復(fù)，取平均值，檢測與基因在黔北麻羊心臟、下丘腦、肝臟、垂體、脾臟、子宮、肺臟、輸卵管、腎臟以及卵巢10個組織的表達水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件預(yù)先處理實驗數(shù)據(jù)，然后使用2法分析黔北麻羊與基因在10個組織中的差異表達，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1與基因引物特異性檢測 使用PCR法擴增、基因的熒光引物序列，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測其特異性。結(jié)果顯示如圖1：與顯示出與目的片段一致的亮帶，且無非特異性擴增，證實引物特異性良好。

圖1 RARA、RARB與RARG基因擴增電泳結(jié)果

2.2 實時熒光定量PCR檢測R與基因特異性 如圖2～4所示，在各組織中與基因擴增曲線呈“S”形狀，整體趨勢一致。熔解曲線呈現(xiàn)單峰，且較為集中，無雙峰及雜亂條帶，證明與基因特異性較好。

圖2 RARA基因擴增曲線和熔解曲線

圖3 RARB基因擴增曲線和熔解曲線

圖4 RARG基因擴增曲線和熔解曲線

2.3 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達量分析 黔北麻羊基因在不同組織中均有表達（圖5）?；蛟谇甭檠虿煌M織中的表達量由大到小依次為肝>心>下丘腦>脾>垂體>肺>輸卵管>子宮>腎>卵巢，其中肝臟的表達量極顯著高于所有組織，心、脾、下丘腦及垂體中基因的表達量均顯著高于肺、腎、子宮和輸卵管，其余組織間均未達到差異顯著水平。

圖5 RARA基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達量

2.4 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達量分析基因在黔北麻羊的不同組織中均有表達（圖6），其中輸卵管表達量極顯著高于其他組織，其余組織之間則呈不顯著差異，黔北麻羊基因表達由高到低依次為輸卵管>下丘腦>子宮>卵巢>肝>心>肺>腎>垂體>脾。

圖6 RARB基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達量

2.5 黔北麻羊不同組織中基因mRNA表達量分析基因在黔北麻羊10個不同組織中也存在著不同程度的表達（圖7），基因的表達量由高到低依次為下丘腦>卵巢>輸卵管>肝>心>子宮>腎>肺>垂體>脾，且下丘腦中基因的表達量極顯著高于所有組織，基因在卵巢的表達量極顯著高于除下丘腦以外的其余組織，其余組織間差異不顯著。

圖7 RARG基因在黔北麻羊不同組織中的差異表達量

3 討 論

本實驗以黔北麻羊為對象，利用RT-qPCR技術(shù)，檢測在黔北麻羊的不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示與基因在黔北麻羊的不同組織中均有表達，說明這3個基因的表達具有廣譜性。

維生素A是畜牧行業(yè)的必需物質(zhì)，已被證實能夠調(diào)節(jié)動物機體上皮細胞的生長并維持動物機體的正常發(fā)育，故其在體內(nèi)的含量對哺乳動物的生長發(fā)育及繁殖十分重要。作為維生素A的代謝產(chǎn)物之一，RA對細胞增殖、分化、免疫反應(yīng)、視覺形成、精子形成等各方面均具有十分重要的作用，RA可以進入細胞核并與RARs結(jié)合以促進靶基因的轉(zhuǎn)錄，而作為RAR受體家族成員在調(diào)控RA生理功能方面具有重要作用?，F(xiàn)如今，已經(jīng)證實RARs對于腦、脊髓、心臟、眼睛、骨骼、肺等器官的早期發(fā)育十分重要。而本研究發(fā)現(xiàn)基因（）在黔北麻羊10個不同組織均具有廣泛的表達，這與視黃酸生理功能及維生素A在體內(nèi)的分布機制相符。此外，RARs家族基因?qū)Σ溉閯游锏姆敝硻C能十分重要。當(dāng)基因在動物脂肪組織中被切除后，能影響動物機體脂肪細胞的分化等其他性狀。本研究發(fā)現(xiàn)基因在黔北麻羊肝臟中的表達量最高，在肺和卵巢中的表達量較低，這與前人在180日齡與270日齡的大白豬中基因時空表達差異的研究結(jié)果類似，且其發(fā)現(xiàn)基因表達隨著日齡的升高而增加，在1日齡肝臟中的表達量較低，因本研究選用的黔北麻羊屠宰時約為36周齡（252日齡），故其在肝臟中的表達量相對較高可能是由于黔北麻羊的生長發(fā)育所致。卵巢基因表達量較低可能是由于羊自身生理狀態(tài)較差，進而使其消化、吸收能力減弱或卵巢卵泡退化或存在病理狀態(tài)所致。是不同于的另一種RARs，其可以通過信號通路誘導(dǎo)RARRES 1、2和3在子宮及胎盤中表達。本研究發(fā)現(xiàn)除垂體外，基因在黔北麻羊性腺組織中的表達量普遍高于非性腺組織，且在輸卵管中的表達量最高，這與前人使用免疫組化所檢測出的結(jié)果相似。楊國偉等人發(fā)現(xiàn)基因在大白豬中存在時空表達差異，在心、腎、卵巢中存在持續(xù)高表達，與本研究結(jié)果類似。故本研究推測基因在性腺中的高表達可能對調(diào)控黔北麻羊的繁殖性能存在一定影響。早在1995年，Look等人發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和人類中，基因在皮膚中高表達，在肺、脾與腎臟中表達量較低?；蚰軌蛟谪i的關(guān)鍵妊娠時期表達，也能夠控制豬的產(chǎn)仔性狀。此外，大量研究證明基因的遺傳變異與豬、綿羊的繁殖力高度相關(guān)?，F(xiàn)如今，也被認(rèn)為是母羊多胎性狀的候選基因。綿羊基因在心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、十二指腸、淋巴、下丘腦、垂體、肌肉、睪丸等12個組織中均有表達，證實了基因在綿羊中廣譜表達。此外，李俊等研究發(fā)現(xiàn)在從江香豬卵巢、輸卵管與子宮中均存在較高的表達。而本研究發(fā)現(xiàn)黔北麻羊基因在10個組織中均有表達，在下丘腦和卵巢中的表達量較高，極顯著高于其他組織，其次是輸卵管，在子宮、肺、脾、腎中的表達量相對較低，這與Look等與王維民等人的研究結(jié)果基本一致，但在子宮中的表達量較低與李俊等人的研究結(jié)果不符，推測可能是由于物種不同或其組織生理狀態(tài)不同所致。

4 結(jié) 論

本實驗采用RT-qPCR檢測了與基因在黔北麻羊10個組織中的表達水平，結(jié)果表明3個基因在黔北麻羊不同組織均有不同程度的表達，基因表達高于肝臟，基因表達高于輸卵管，而基因在下丘腦中的表達量最高。研究結(jié)果可為進一步探究其對山羊繁殖性狀的調(diào)控機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。