蒙藥三子散HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別研究

劉妍妍 張慧文 白云霞 劉宏 夏慧敏 久欣 王煥蕓

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）03-0319-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.03.11

摘 要 目的 建立蒙藥三子散高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，通過化學(xué)模式識(shí)別方法綜合評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。方法 采用HPLC法，以京尼平苷色譜峰為參照峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》繪制15批三子散的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，標(biāo)定并指認(rèn)共有峰。結(jié)合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)15批三子散的指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，篩選影響其質(zhì)量的差異性標(biāo)志物。結(jié)果 15批三子散中共有29個(gè)共有峰，相似度均不低于0.952，表明15批三子散的化學(xué)組成一致性較好;共指認(rèn)了訶子次酸、沒食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷A、安石榴苷B、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸13個(gè)共有峰。聚類分析與主成分分析均可將15批三子散分為4類，且分類結(jié)果一致，表明15批三子散的質(zhì)量存在一定差異;結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析篩選出導(dǎo)致批次間質(zhì)量差異的14個(gè)差異性標(biāo)志物（訶子次酸、沒食子酸、鞣花酸等）。結(jié)論 建立的HPLC指紋圖譜分析方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析可用于三子散的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 三子散;高效液相色譜法;指紋圖譜;相似度評(píng)價(jià);化學(xué)模式識(shí)別;聚類分析;主成分分析;正交偏最小二乘法-判別分析;質(zhì)量控制

Study on HPLC fingerprint and chemical pattern recognition of Mongolian medicine Sanzisan

LIU Yanyan1，ZHANG Huiwen1，BAI Yunxia2，LIU Hong1，XIA Huimin1，JIU Xin1，WANG Huanyun1（1. School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China; 2. Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Inner Mongolia Baotou 014010， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish the HPLC fingerprint of Mongolian medicine Sanzisan， and to evaluate its internal quality by chemical pattern recognition technique comprehensively. METHODS HPLC method was used. Using geniposide as reference， HPLC fingerprints of 15 batches of Sanzisan were drawn with Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2012 edition）. Similarity evaluation and common peaks identification were conducted. Combined with cluster analysis （CA）， principal component analysis （PCA）， and orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA）， the quality of 15 batches of Sanzisan was evaluated， and the differential markers that affected its quality were screened. RESULTS There were 29 common peaks in 15 batches of Sanzisan， and the similarity was no less than 0.952， indicating that the chemical composition of the 15 batches of Sanzisan had good consistency. A total of 13 common peaks were identified， which were chebulic acid， gallic acid， punicalin， punicalagin A， punicalagin B， jasminoside B， caffeic acid， corilagin， geniposide， chebulagic acid， 1，2，3，4，6- O-galloylglucose， chebulinic acid， ellagic acid. Both CA and PCA could divide 15 batches of Sanzisan into four categories， and the classification results were consistent， indicating that the quality of 15 batches of Sanzisan had certain differences. Fourteen differential markers （chebulic acid， gallic acid， ellagic acid， etc） that lead to the quality difference between batches were screened out by OPLS-DA. CONCLUSIONS Established HPLC fingerprint analysis method is simple and stable. Combined with chemical pattern recognition analysis， it can be used for the quality control of Sanzisan.

KEYWORDS? ?Sanzisan; HPLC; fingerprint; similarity evaluation; chemical pattern recognition; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; quality control

三子散系2020年版《中國(guó)藥典》（一部）收載的少數(shù)蒙古族驗(yàn)方之一，由訶子、梔子、川楝子等比例組成，具有清熱涼血、解毒的功效，主治溫?zé)?、血熱、新久熱[1]。三子散始載于《四部醫(yī)典》[2]，主治新舊血熱、血熱性目赤、正常血與病血混合、未成熟熱、搏熱，希拉熱等癥[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究報(bào)道，三子散能夠降低全血黏度，增加血流量[4-6];能治療高脂血癥，提示其對(duì)血栓形成、防治心腦血管疾病有重要參考意義[7];還能防止血小板聚集、抗凝血、提高免疫力和抗炎、抗菌[8]等。

三子散臨床療效顯著，使用歷史久遠(yuǎn)?，F(xiàn)行的質(zhì)控方法多以單指標(biāo)測(cè)定有效成分梔子苷、沒食子酸、川楝素、還原糖的含量[9-14]表征復(fù)方質(zhì)量，難以體現(xiàn)制劑的整體特性和內(nèi)在品質(zhì)。本課題組前期已通過一測(cè)多評(píng)法測(cè)定三子散中活性成分，如沒食子酸、羥異梔子苷、京尼平龍膽二糖苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ和訶黎勒酸的含量，建立了三子散的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[15-16]?；诖?，為了更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)三子散質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立了15批三子散指紋圖譜，并對(duì)共有峰進(jìn)行標(biāo)定、指認(rèn)與歸屬，同時(shí)在指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，首次結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析方法比較15批三子散的質(zhì)量差異，篩選影響三子散質(zhì)量的差異性標(biāo)志物，旨在為其質(zhì)量控制提供依據(jù)，同時(shí)為更多蒙古族驗(yàn)方質(zhì)量控制方法的建立提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-2030C 3D型HPLC儀、AP135W型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu公司），MS205DU型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司），JJ224BC型萬分之一電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），WK-1000A型小型高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

對(duì)照品訶子次酸（批號(hào)M30GB150105，純度≥95%）、石榴皮鞣素（批號(hào)M23J11S119104，純度≥98%）、安石榴苷（批號(hào)Y11S11Y124050，純度≥98%）、柯里拉京（批號(hào)P25A11S122217，純度≥98%）、訶子鞣酸（批號(hào)M29GB143373，純度≥98%）、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖（批號(hào)P16M11F113433，純度≥99%）、訶子林鞣酸（批號(hào)P24J9F53640，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;對(duì)照品沒食子酸（批號(hào)D2016091，純度99%）、咖啡酸（批號(hào)I2002097，純度98%）、京尼平苷（批號(hào)J2027132，純度≥98%）、鞣花酸（批號(hào)K1813148，純度96%）均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司;對(duì)照品jasminoside B（批號(hào)P16A9F58571，純度≥98%）購(gòu)自北京譜析科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、磷酸為分析純，水為純凈水。

購(gòu)買訶子、梔子、川楝子單味藥飲片各15批，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室張慧文博士鑒定，訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實(shí)，梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，川楝子為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)，均符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)。將各批次單味藥飲片隨機(jī)取樣組合得15批三子散樣品（編號(hào)S1～S15），各單味藥飲片來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate? LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，1%B→5%B;5～10 min，5%B→13%B;10～24 min，13%B→23%B;24～56 min，23%B→35%B;56～78 min，35%B→47%B;78～90 min，47%B→85%B;90～100 min，85%B→90%B;100～105 min，90%B→100%B）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取訶子次酸、沒食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，制備成混合對(duì)照品貯備液。取混合對(duì)照品貯備液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為訶子次酸0.094 mg/mL、沒食子酸0.050 mg/mL、石榴皮鞣素0.019 mg/mL、安石榴苷0.206 mg/mL、Jasminoside B 0.264 mg/mL、咖啡酸0.031 mg/mL、柯里拉京0.108? ? mg/mL、京尼平苷0.360 mg/mL、訶子鞣酸0.574 mg/mL、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖0.090 mg/mL、訶子林鞣酸0.522 mg/mL、鞣花酸0.110 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 稱取各單味藥飲片適量，分別粉碎成粗粉，過40目篩。按2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定的三子散驗(yàn)方比例（等比），精密稱取各單味藥飲片粉末10.0 g，混勻，即得三子散樣品。精密稱取上述三子散樣品1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（40 kHz，500 W）提取30 min，放至室溫后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，4 ℃條件避光保存;進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 缺味陰性對(duì)照溶液 按2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定的三子散驗(yàn)方比例，以1.2 g為處方總量，分別配制不含川楝子或梔子或訶子的缺味陰性樣品處方，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得各缺味陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 單味藥飲片溶液 按2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定的三子散驗(yàn)方比例，以1.2 g為處方總量，計(jì)算各單味藥飲片的質(zhì)量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得各單味藥飲片溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取三子散（S14）樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以京尼平苷色譜峰（其色譜峰較穩(wěn)定、分離度良好且保留時(shí)間、峰面積適中）為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%，表明所用儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取三子散（S14）樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以京尼平苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取三子散（S14）樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以京尼平苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.00%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%，表明供試品溶液于室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 指紋圖譜的建立 按“2.2.2”項(xiàng)下方法，分別制備S1～S15三子散樣品的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》處理色譜圖，設(shè)定S1樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度0.1 min，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正后Mark峰匹配生成15批三子散的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)定了29個(gè)共有峰，詳見圖1、圖2。

2.4.2 共有峰的指認(rèn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)混合對(duì)照品溶液和三子散（S1）供試品溶液進(jìn)樣分析。通過將混合對(duì)照品溶液和三子散（S1）供試品溶液HPLC圖進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出13個(gè)共有峰，分別為：峰1（訶子次酸）、峰2（沒食子酸）、峰3（石榴皮鞣素）、峰6（安石榴苷A）、峰8（安石榴苷B）、峰11（jasminoside B）、峰13（咖啡酸）、峰14（柯里拉京）、峰16（京尼平苷）、峰20（訶子鞣酸）、峰22（1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖）、峰23（訶子林鞣酸）、峰24（鞣花酸），詳見圖3。以峰16（京尼平苷）為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表2、表3。

2.4.3 共有峰的歸屬 分別按“2.2.2” “2.2.3” “2.2.4”項(xiàng)下方法制備三子散全方溶液、缺味陰性對(duì)照溶液和單味藥飲片溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖4。將三子散全方、缺味陰性對(duì)照、單味藥飲片的HPLC圖進(jìn)行比較，對(duì)29個(gè)共有峰進(jìn)行藥材歸屬。其中，峰1～峰9、峰11、峰12、峰14、峰15、峰17～峰24、峰26、峰28、峰29為訶子專屬峰，峰10、峰13、峰16、峰25、峰27為梔子專屬峰;川楝子主要成分紫外吸收較弱，在當(dāng)前檢測(cè)條件下響應(yīng)較低，未貢獻(xiàn)峰。

2.4.4 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)15批三子散的HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜（R）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度為0.952～0.994，可見15批三子散相似度較高，詳見表4。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

為了進(jìn)一步區(qū)分差異性樣品，尋找差異性標(biāo)志物，在該指紋圖譜分析結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究引入化學(xué)模式識(shí)別分析方法，結(jié)合兩種分析方法，以求更加客觀全面地評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量。

2.5.1 聚類分析 將15批三子散HPLC指紋圖譜在254 nm波長(zhǎng)下的29個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入MeV-4.9.0軟件，進(jìn)行聚類分析（cluster analysis，CA）與熱圖繪制，詳見圖5。由圖5可知，15批三子散聚為4類：S7樣品單獨(dú)聚為一類，S3～S5、S9、S13樣品聚為一類，S1、S2、S6、S8、S10～S12樣品聚為一類，S14、S15樣品聚為一類。

2.5.2 主成分分析 將15批三子散HPLC指紋圖譜在254 nm波長(zhǎng)下的29個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。從29個(gè)變量中提取出6個(gè)變量，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.03%，提示該模型的預(yù)測(cè)能力較好[17]。提取前2個(gè)主成分作PCA得分圖，詳見圖6。結(jié)果表明，15批三子散聚為4類：S7樣品單獨(dú)聚為一類，S3～S5、S9、S13樣品聚為一類，S1、S2、S6、S8、S10～S12樣品聚為一類，S14、S15樣品聚為一類。該結(jié)果與CA結(jié)果相互印證。

PCA載荷圖中的點(diǎn)代表各共有峰，其距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明其權(quán)重越大，對(duì)樣品質(zhì)量差異影響越大[18]，結(jié)果見圖7。由圖7可知，對(duì)第1主成分影響較大的有峰11（jasminoside B）、峰24（鞣花酸）、峰2（沒食子酸）、峰15、峰23（訶子林鞣酸）、峰29，對(duì)第2主成分影響較大的有峰8（安石榴苷B）、峰9、峰18、峰14（柯里拉京）、峰6（安石榴苷A）、峰1（訶子次酸）、峰5。

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別分析 為進(jìn)一步分析樣品的批間差異性，在CA和PCA聚類的情況下，將15批三子散HPLC指紋圖譜在254 nm波長(zhǎng)下的29個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。分析結(jié)果顯示，OPLS-DA模型參數(shù)R2X為0.863，R2Y為0.936，Q2為0.332，說明該模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好[19-20]。為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的有效性，利用SIMCA 14.1軟件對(duì)其進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見圖8，所有Q2均在R2之下，且Q2的回歸直線與y軸的交點(diǎn)在負(fù)半軸，說明該模型有效。由OPLS-DA得分圖可以看出，15批樣品被很好地區(qū)分為4類，詳見圖9。

OPLS-DA載荷圖中的點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明對(duì)應(yīng)變量權(quán)重值越大[21]。OPLS-DA載荷圖見圖10，可知對(duì)第1主成分影響較大的有峰2（沒食子酸）、峰24（鞣花酸）、峰23（訶子林鞣酸）、峰29、峰27，對(duì)第2主成分影響較大的有峰1（訶子次酸）、峰8（安石榴苷B）、峰9、峰6（安石榴苷A）、峰3（石榴皮鞣素）、峰11（jasminoside B）、峰4、峰18、峰14（柯里拉京）。提取的29個(gè)變量中，變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）值大于1，說明該變量對(duì)整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平，可作為篩選具有顯著貢獻(xiàn)變量的標(biāo)準(zhǔn)[22]。OPLS-DA VIP值圖見圖11，可知VIP值>1且誤差線不超過原點(diǎn)的變量有14個(gè)，排列順序?yàn)榉?（訶子次酸）>峰2（沒食子酸）>峰8（安石榴苷B）>峰9>峰6（安石榴苷A）>峰24（鞣花酸）>峰3（石榴皮鞣素）>峰11（jasminoside B）>峰4>峰18>峰23（訶子林鞣酸）>峰29>峰14（柯里拉京）>峰27。兩種方法的結(jié)果結(jié)合，可作為判定標(biāo)準(zhǔn)篩選差異性標(biāo)志物。

3 討論

3.1 提取條件的考察

在供試品溶液制備過程中，分別考察了超聲、加熱回流2種提取方法，甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、水5種不同提取溶劑，15、30、45 min 3種不同提取時(shí)間對(duì)三子散有效成分提取的影響。綜合色譜峰數(shù)量、響應(yīng)值和實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性等因素考慮，確定采用甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min作為供試品溶液的處理方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在指紋圖譜方法研究過程中，分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液等流動(dòng)相進(jìn)行考察。綜合實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性、色譜圖基線平穩(wěn)水平和基線分離程度，最終確定甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，并對(duì)洗脫梯度條件進(jìn)行優(yōu)化。依次考察了25、30、35、40 ℃柱溫，結(jié)果表明柱溫變化對(duì)色譜峰的峰形、保留時(shí)間影響較小，根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[23]，最終選擇柱溫為30 ℃。

采用全波長(zhǎng)掃描，通過色譜峰數(shù)目和響應(yīng)值大小進(jìn)行篩選，分析發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長(zhǎng)條件下，三子散HPLC指紋圖譜基線較平穩(wěn)，共有峰數(shù)量較多且具有較高的響應(yīng)值，故選擇254 nm為HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 指紋圖譜研究

中藥材成分復(fù)雜，受不同生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)期、采收期以及加工、炮制方法等多方面的影響，其內(nèi)在質(zhì)量會(huì)有很大差異。本實(shí)驗(yàn)在生成對(duì)照指紋圖譜時(shí)采用中位數(shù)法，可彌補(bǔ)用平均數(shù)法易受個(gè)別超常樣本影響的缺點(diǎn)，使生成的對(duì)照?qǐng)D譜更具代表性[24]。

本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及劉昌孝院士等[25]提出的“中藥質(zhì)量標(biāo)志物”概念基礎(chǔ)上，從化學(xué)成分特有性、傳統(tǒng)功效和化學(xué)成分可測(cè)性等方面對(duì)三子散質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選擇與中藥質(zhì)量特性密切相關(guān)的標(biāo)志物，建立三子散HPLC指紋圖譜，確定29個(gè)共有峰，并指認(rèn)出其中的訶子次酸、沒食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷A、安石榴苷B、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸13個(gè)化學(xué)成分。15批三子散各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.021%～0.680%，表明其化學(xué)組成一致性較好;各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為15.793%～70.853%，提示15批三子散的某些共有化學(xué)成分含量有所差異。各批次樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果均不低于0.952，表明各批次三子散化學(xué)組成一致性較好。

經(jīng)與各缺味陰性對(duì)照、單味藥飲片HPLC圖比對(duì)，訶子、梔子的色譜峰得到較充分表征，但川楝子并未貢獻(xiàn)色譜峰。這是由于三子散為各單味藥飲片等比配比的復(fù)方制劑，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，相比于訶子、梔子，川楝子主要成分為檸檬苦素型三萜類化合物，多為弱紫外吸收或無紫外吸收，響應(yīng)低、干擾大，很難達(dá)到理想的基線分離[26]。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，本研究對(duì)于三子散的質(zhì)量控制仍存在不足，本課題組后期將在此研究基礎(chǔ)上兼顧質(zhì)量標(biāo)志物，通過液質(zhì)聯(lián)用或其他多種檢測(cè)器串聯(lián)的測(cè)定方法建立相對(duì)全面的三子散指紋圖譜或其他質(zhì)控方法，不斷完善三子散質(zhì)量控制研究。

3.4 化學(xué)模式識(shí)別

CA與PCA結(jié)果一致，均可將15批三子散聚為4類，即S7樣品單獨(dú)聚為一類，S3～S5、S9、S13樣品聚為一類，S1、S2、S6、S8、S10～S12樣品聚為一類，S14、S15樣品聚為一類，表明15批三子散的質(zhì)量存在差異。OPLS-DA結(jié)果篩選出14個(gè)導(dǎo)致批次間質(zhì)量差異的差異性標(biāo)志物，現(xiàn)已指認(rèn)出酚酸類化合物沒食子酸（峰2），鞣質(zhì)類化合物訶子次酸（峰1）、安石榴苷A（峰6）、安石榴苷B（峰8）、鞣花酸（峰24）、石榴皮鞣素（峰3）、訶子林鞣酸（峰23）、柯里拉京（峰14）與單萜苷類化合物jasminoside B（峰11）。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物如沒食子酸具有抗氧化、抗炎及降糖調(diào)脂等作用[27];鞣質(zhì)類化合物具有抗炎、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[28];同時(shí)，相關(guān)訶子研究報(bào)道也從訶子化學(xué)成分、藥理作用、植物親緣學(xué)及化學(xué)成分特有性、傳統(tǒng)功效、藥性、新臨床用途和藥動(dòng)學(xué)等方面分析論證，預(yù)測(cè)沒食子酸、鞣花酸和訶子酸可能是訶子質(zhì)量標(biāo)志物[29]。相關(guān)梔子研究基于化學(xué)成分的可測(cè)性，預(yù)測(cè)單萜苷類成分是梔子質(zhì)量標(biāo)志物的重要選擇[30]。以上研究報(bào)道皆與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證，提示在三子散生產(chǎn)過程中應(yīng)著重關(guān)注以上差異性標(biāo)志物的變化，從而控制藥品質(zhì)量。然而峰4、峰5、峰7、峰9、峰10、峰12、峰15、峰17～峰19、峰21、峰25～峰29暫未指認(rèn)，后期研究擬采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)對(duì)未識(shí)別的成分進(jìn)行鑒定，以期更系統(tǒng)、全面地對(duì)三子散進(jìn)行質(zhì)量控制。

綜上所述，本研究所建立的三子散HPLC指紋圖譜分析方法高效、穩(wěn)定，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可用于三子散的質(zhì)量控制，同時(shí)為更多蒙古族驗(yàn)方質(zhì)量控制方法的建立提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：512-513.

[ 2 ] 宇妥·元丹貢布.四部醫(yī)典：蒙古文版[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1978：1005.

[ 3 ] 《蒙古學(xué)百科全書》編輯委員會(huì).蒙古學(xué)百科全書：醫(yī)學(xué)[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2012：287-288.

[ 4 ] 都格爾，瑞圖雅.三籽湯對(duì)微型白細(xì)胞比例和數(shù)量的影響[J].中國(guó)蒙醫(yī)藥（蒙），2008，3（2）：59-60.

[ 5 ] 都格爾，金花.三子湯對(duì)平均紅細(xì)胞體積的影響[J].中國(guó)蒙醫(yī)藥（蒙），2008，3（3）：68-69.

[ 6 ] 吳哈達(dá)，都格爾，金花.蒙藥三子湯的研究進(jìn)展與展望[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2015，21（9）：49-51.

[ 7 ] 陳呼格吉勒?qǐng)D，金花.蒙藥-三子湯治療高脂血癥的研究概況[J].中國(guó)蒙醫(yī)藥雜志，2010，5（12）：17-20.

[ 8 ] 金花，都格爾.放血療法前服三子湯對(duì)血液流變學(xué)影響的臨床研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，7（2）：124-131.

[ 9 ] 李艷春，胡志忠，羅素琴，等.蒙藥三子散中還原糖的含量測(cè)定[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（6）：551-553.

[10] 劉素梅，方忠意，韓立，等.三子散中川楝子的鑒別及梔子苷的含量測(cè)定[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47（3）：38-40.

[11] 那順白乙拉，孟和，王蘇寧. HPLC-MS法測(cè)定三子散中川楝素的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2017，26（6）：23-24.

[12] 王思文，娜仁圖雅，籍學(xué)偉. HPLC法測(cè)定蒙成藥三子散中沒食子酸的含量[J].北方藥學(xué)，2021，18（1）：21-24.

[13] 張建平，王棟，周雪梅，等.高效液相色譜法測(cè)定蒙成藥三子散中川楝素含量[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2021，27（2）：38-42.

[14] 杜文亞，云冠群，張建平. HPLC-ELSD法測(cè)定蒙成藥“三子散”中川楝素含量[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2021，27（5）：38-41.

[15] 何春龍，白玉琴，雷露靜，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蒙成藥三子散中4種成分的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（5）：805-809.

[16] 劉宏，雷露靜，白玉琴，等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定蒙藥三子散中7種指標(biāo)成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（18）：58-63.

[17] 徐鋒，楊瀾，成婷婷，等.地瓜藤的UPLC指紋圖譜建立及聚類分析、主成分分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（24）：3388-3392.

[18] 張欣舒，董金香，楊凈堯，等.經(jīng)典名方保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜及多指標(biāo)量值傳遞研究[J].藥物分析雜志，2021，41（2）：345-358.

[19] 閆凱莉，尹程程，劉夢(mèng)瑤，等.芩連潤(rùn)肺湯的HPLC指紋圖譜建立、含量測(cè)定及多元統(tǒng)計(jì)分析[J].中國(guó)藥房，2021，32（16）：1956-1963.

[20] 陳樸，于燕波，黃賤英，等.運(yùn)動(dòng)員與體力勞動(dòng)者代謝組學(xué)判別模型的建立[J].波譜學(xué)雜志，2016，33（3）：395-405.

[21] 管詠梅，萬鑫浩，吳文婷，等.經(jīng)典名方桂枝加葛根湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2021，52（18）：5535-5542.

[22] 賈小舟，楊小龍，盧曉瑩，等.基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法比較白芥子炒制前后的化學(xué)成分[J].中國(guó)藥房，2021，32（22）：2731-2735.

[23] 夏慧敏，張慧文，白云霞，等. HPLC指紋圖譜技術(shù)結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法評(píng)價(jià)不同批次訶子質(zhì)量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2020，37（12）：1448-1453.

[24] 肖蓉，張志斐，袁志芳，等.河北道地藥材黃芩指紋圖譜的研究[J].藥物分析雜志，2007，27（7）：1018-1023.

[25] 劉昌孝，陳士林，肖小河，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）：中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念[J].中草藥，2016，47（9）：1443-1457.

[26] 張春泥，王英姿，孫欣光，等. HPLC-CAD結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的川楝子飲片指紋圖譜研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（3）：456-461.

[27] 王晨曉.基于高內(nèi)涵分析技術(shù)的絨毛訶子肝毒性及毒性物質(zhì)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2020.

[28] 朱萱萱，白璐，劉曉謙，等.近十年來中藥鞣質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2021，46（24）：6353-6365.

[29] 趙鹿，廖翠萍，楊秀娟，等.訶子的研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)[J].中草藥，2020，51（10）：2732-2744.

[30] 史永平，孔浩天，李昊楠，等.梔子的化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析[J].中草藥，2019，50（2）：281-289.

（收稿日期：2021-09-21 修回日期：2021-12-07）

（編輯：曾海蓉）

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2021GG0176）;內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2019MS08157）;內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（No.NJZZ19089）

碩士研究生。研究方向：中蒙藥質(zhì)量控制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：lyyybyq@qq.com

通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中蒙藥質(zhì)量控制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：0471-6653169。E-mail：whuanyun999@163.com