帕金森病15型基因突變攜帶者行胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測助孕成功一例

王志強(qiáng)，倪亞莉，安錦霞，王同光，張風(fēng)霞

帕金森?。≒arkinson's disease）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其中遺傳性帕金森病的發(fā)生率為5%～10%[1]。目前已有20多個(gè)基因明確定位，其中帕金森病15型的致病基因是FBXO7（F-box only protein 7）基因，其基因突變呈常染色體隱性遺傳。引起單基因遺傳性帕金森病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變。常染色體隱性遺傳性帕金森病多為青少年起病。一般父母雙方都是致病基因攜帶者，生育患兒的概率理論上達(dá)25%，但實(shí)際發(fā)生率可能更高。本文報(bào)告1例具有FBXO7基因突變并通過胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disorders，PGT-M）技術(shù)助孕成功妊娠的病例。

1 對象與方法

1.1 研究對象夫婦雙方因生育2個(gè)男孩且2孩均于5個(gè)月時(shí)出現(xiàn)相似疾病癥狀，懷疑遺傳學(xué)相關(guān)疾病，于2018年9月19日帶大男就診于甘肅省婦幼保健院（我院）。就診時(shí)女方28歲，男方28歲，雙方均為初婚，女方既往孕4產(chǎn)2，2013年和2017年均于孕40～50 d藥物流產(chǎn)1次，終止妊娠原因不詳。分娩史如下：2012年足月順產(chǎn)一男孩（大男，先證者），在其5個(gè)月大時(shí)出現(xiàn)肌肉張力和肢體僵硬程度增加，無法獨(dú)立坐下?，F(xiàn)6歲不能獨(dú)立行走，不能正常說話，并且智力發(fā)育遲緩。該患兒2015年4月于外院被診斷為腦癱并進(jìn)行相關(guān)康復(fù)治療，但未取得令人滿意的結(jié)果。女方于2016年12月31日再次足月順產(chǎn)第2個(gè)男孩（小男），小男于5個(gè)月齡時(shí)出現(xiàn)了和哥哥同樣的癥狀，肌肉張力增強(qiáng)，認(rèn)知能力下降，2017年6月7日于外院就診時(shí)對小男行全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）未發(fā)現(xiàn)異常，最終于2017年6月20日因嚴(yán)重的肺部感染夭折。經(jīng)相關(guān)診治后初步推斷，小男與先證者大男相關(guān)癥狀與體征均可能與帕金森-錐體束綜合征（Parkinsonianpyramidal syndrome，PPS）發(fā)作有關(guān)。就診于我院時(shí)經(jīng)患者及家屬知情同意后，對夫婦雙方及二子前次行WES的剩余擴(kuò)增樣本再次行WES重新尋找遺傳病因，發(fā)現(xiàn)先證者大男和小男均為FBXO7基因的復(fù)合雜合突變攜帶者（NM_012179.3）：c.402G＞A和c.872-1G＞A。c.402G＞A遺傳自父親，而c.872-1G＞A來自母親。對患者夫婦進(jìn)行充分遺傳咨詢和知情同意后，為患者制定了詳細(xì)的PGT-M助孕方案。該研究得到我院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 家系預(yù)實(shí)驗(yàn)分析采集夫妻雙方及先證者肘正中靜脈血5 mL，對先證者FBXO7基因的突變位點(diǎn)c.402G＞A和c.872-1G＞A進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。結(jié)果如圖1和圖2所示：FBXO7基因（OMIM:605648）存在錯(cuò)義突變，確定了先證者和弟弟均為FBXO7基因的復(fù)合雜合突變（NM_012179.3）：c.402G＞A和c.872-1G＞A。c.402G＞A遺傳自父親，而c.872-1G＞A遺傳自母親。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南介紹，c.402G＞A為無義突變，可導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；c.872-1G＞A為剪切突變，可導(dǎo)致蛋白剪切發(fā)生變化，均為致病突變，分別遺傳自父母雙方。同時(shí)，對該家系的基因組DNA（genomic DNA，gDNA）樣本在FBXO7基因上下游2 Mb范圍內(nèi)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）多重?cái)U(kuò)增，進(jìn)行家系SNP單體型分析，區(qū)分先證者致病攜帶的單體型為后續(xù)胚胎SNP連鎖分析奠定基礎(chǔ)。

圖1 FBXO7基因家系圖譜

圖2 FBXO7基因家系一代驗(yàn)證結(jié)果

1.2.2 卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）及PGT-M治療為患者制定控制性卵巢刺激方案，采用卵泡期短效長方案，最終獲卵15枚，ICSI后正常受精9枚，于第5天獲得可活檢囊胚5枚，對擴(kuò)張期囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行活檢。并將活檢樣本參照基因測序通用樣本處理（XK-028，Yikon Genomics）試劑盒說明（ChromSwiftTM）進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）。

取20 ng WGA產(chǎn)物應(yīng)用轉(zhuǎn)座酶試劑盒（KT100801924，Yikon Genomics）進(jìn)行片段化建庫，文庫大小為200～500 bp，Illumina Nextseq 550平臺測序0.04×深度，分析胚胎染色體非整倍性。取120 ng WGA產(chǎn)物為模板，利用FBXO7基因上下游的SNP引物行多重?cái)U(kuò)增，后續(xù)利用基因測序文庫（XK-038，Yikon Genomics）試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，文庫大小約為250 bp，測序深度為100×。染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）分析時(shí)將原始讀長（reads）去掉重復(fù)，以1 Mb大小的單元（bin）比對到基因組上，在整個(gè)基因組范圍進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用循環(huán)二元分割算法（circular binary segmentation，CBS）對≥4 Mb的胚胎CNV進(jìn)行報(bào)告，并應(yīng)用R語言程序?qū)?4條染色體的每個(gè)單元的CNV進(jìn)行可視化畫圖[2]。SNP位點(diǎn)分析時(shí)將高通量測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組（hg19），進(jìn)一步分析家系及檢測樣本全基因組SNP位點(diǎn)，在致病基因上下游1～2 Mb內(nèi)挑選SNP位點(diǎn)。最終，根據(jù)胚胎突變基因的SNP位點(diǎn)連鎖分析結(jié)果、基因點(diǎn)突變位點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果以及胚胎的染色體整倍性結(jié)果綜合考慮，出具檢測報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 家系預(yù)實(shí)驗(yàn)基因分析家系預(yù)實(shí)驗(yàn)基因分析結(jié)果示：父母雙方均為FBXO7基因相應(yīng)位點(diǎn)的突變攜帶者，先證者攜帶分別遺傳自父母的FBXO7基因突變位點(diǎn)，為復(fù)合雜合突變。見圖3、圖4。

圖3 父母及先證者SNP連鎖分析

圖4 父母及先證者基因分析結(jié)果

2.2 活檢樣本檢測結(jié)果及移植結(jié)果5枚囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢后均成功擴(kuò)增，基因突變位點(diǎn)及SNP檢測結(jié)果見表1和圖5。5枚囊胚中有2枚（P2018052_1和P2018052_4）僅攜帶父源突變且染色體為正常二倍體，2枚胚胎染色體存在異常，1枚胚胎患病。遺傳咨詢后對患者行凍融胚胎移植，經(jīng)內(nèi)膜準(zhǔn)備后將編號為P2018052_1（形態(tài)學(xué)評分為5BB）的活檢后囊胚移植到母體，獲得成功妊娠。妊娠期經(jīng)過胎兒頸項(xiàng)透明層厚度（nuchal translucency，NT）、系統(tǒng)B超和羊水穿刺三聯(lián)篩查驗(yàn)證胎兒與前期胚胎PGT-M遺傳學(xué)檢測結(jié)果完全一致，未發(fā)現(xiàn)其他異常。該患者于2020年4月3日成功分娩一名僅攜帶父源突變、無發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的健康男嬰，出生體質(zhì)量3 360 g。

圖5 5枚囊胚SNP檢測結(jié)果

表1 5枚囊胚活檢樣本CNV檢測結(jié)果

3 討論

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病[1]，其特征為靜止性震顫、肌肉痙攣、運(yùn)動遲緩和體位不穩(wěn)等，嚴(yán)重者亦有記憶障礙和癡呆[3]。家族性帕金森病在所有帕金森病患者中僅占10%[4]，其可通過常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或罕見的X連鎖遺傳[5]，其中FBXO7基因突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳方式。常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森?。╝utosomal recessive early-onset Parkinsonism，AREP）是一種早發(fā)性、發(fā)病年齡一般≤40歲的帕金森病，除有帕金森病的特征性臨床表現(xiàn)外，還有其自身特點(diǎn)，如癥狀常于睡眠休息后減輕、晨輕暮重、早期對小劑量多巴胺反應(yīng)敏感和肌張力障礙等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，編碼FBXO7蛋白的FBXO7基因突變可引起罕見的常染色體隱性遺傳性神經(jīng)退行性疾病——帕金森病15型[7]，該病又稱為PPS或蒼白球-錐體束?。╬allido-pyramidal disease，PPD）?；加羞@種疾病的患者主要表現(xiàn)為錐體束疾病伴發(fā)的帕金森病的早期發(fā)作，并常表現(xiàn)出精神運(yùn)動遲緩、腱反射亢進(jìn)、舞蹈癥和其他非典型癥狀[8]。帕金森病15型屬于青少年起病的帕金森病，多在幼年和成人早期發(fā)病，該病進(jìn)展迅速，可有皮質(zhì)脊髓體征，部分家庭早發(fā)性帕金森病伴有運(yùn)動遲緩。目前國際上已有20例早發(fā)性帕金森病家族中FBXO7基因突變的病例報(bào)道，部分突變類型已被鑒定[8-9]。Wei等[9]報(bào)道了中國首例由FBXO7基因復(fù)合雜合突變引起的少年型帕金森病。

本家系中先證者和其弟均為FBXO7基因的復(fù)合雜合突變（NM_012179.3）：c.402G＞A和c.872-1G＞A。無義突變c.402G＞A遺傳自父親，而剪切突變c.872-1G＞A遺傳自母親。通過在千人基因組計(jì)劃、人類外顯子數(shù)據(jù)庫（ExAC）和SNP數(shù)據(jù)庫（dbSNP）中檢索，并且在突變數(shù)據(jù)庫ClinVar、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）和HGMD（Human Gene Mutation Database）中檢索，均沒有發(fā)現(xiàn)本家系中檢出的2個(gè)基因突變的記錄。c.402G＞A突變使色氨酸密碼子（UGG）轉(zhuǎn)換為終止密碼子（UGA），使蛋白質(zhì)翻譯提前終止（p.Trp134*），并導(dǎo)致FBXO7功能喪失。c.872-1G＞A突變是剪切位點(diǎn)突變，位于IVS5-1位置，導(dǎo)致6號外顯子剪切發(fā)生變化并產(chǎn)生異常蛋白。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南，將新的無義突變c.402G＞A加權(quán)為非常強(qiáng)致病性證據(jù)（PVS1），中等致病性證據(jù)（PM2和PM4），并提供致病性支持（PP）；剪切突變c.872-1G＞A的權(quán)重為PVS1、PM2、PM3和PP。根據(jù)致病標(biāo)準(zhǔn)，將這兩個(gè)變異歸類為致病性。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳病有7 000多種，大部分單基因遺傳病具有致死性、致殘性或致畸性，且多數(shù)至今尚無有效治療手段，對患者家庭及社會造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。PGT-M技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胚胎植入前的單基因病檢測，在妊娠之前即對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，避免遺傳學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)的胚胎種植，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育[10]。本例帕金森病遺傳方式為常染色體隱性遺傳，夫妻雙方分別攜帶致病雜合變異基因，后代有25%的概率患病，50%的概率為致病變異攜帶者，25%的概率為正常人。經(jīng)用PGT-M技術(shù)，通過多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）進(jìn)行單基因擴(kuò)增及高通量測序，對囊胚進(jìn)行篩查，選擇不同時(shí)攜帶母源以及父源致病位點(diǎn)的非致病性胚胎進(jìn)行移植獲得活產(chǎn)，成功阻斷了帕金森病在該家系的垂直傳遞。

PGD-M技術(shù)已經(jīng)成為解決單基因遺傳病的一級預(yù)防手段之一。在生殖臨床和生殖遺傳的常規(guī)臨床工作中，必須將臨床表現(xiàn)和遺傳學(xué)檢查結(jié)合起來，提高對遺傳性疾病的辨別力和洞察力，才能在實(shí)際的臨床工作中及時(shí)發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，從而通過相應(yīng)的治療手段提前進(jìn)行干預(yù)，切實(shí)通過技術(shù)手段達(dá)到預(yù)防出生缺陷、提高人口素質(zhì)的目的。