胚胎反復(fù)種植失敗的子宮內(nèi)膜免疫因素及其研究進展

臧朝雯，代彩鳳，高景悅，鄧曉惠

胚胎反復(fù)種植失?。╮ecurrent implantation failure，RIF）是影響體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）后臨床妊娠率提高的重要限制因素。目前RIF的定義國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標準，Coughlan等[1]提出，40歲以下不孕患者至少經(jīng)歷3個新鮮或凍融周期、累計至少移植4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能實現(xiàn)臨床妊娠即可診斷為RIF。而Polanski等[2]對119篇相關(guān)文獻進行薈萃分析后提出，RIF應(yīng)被定義為在連續(xù)兩次移植質(zhì)量良好、發(fā)育階段適宜的胚胎而未能實現(xiàn)臨床妊娠，且累計移植胚胎數(shù)不少于4個，累計移植囊胚數(shù)不少于2個。在接受IVF/卵細胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的患者中，RIF的發(fā)生率可高達10%[3]。子宮內(nèi)膜免疫因素與胚胎著床的關(guān)系近年來備受關(guān)注。大量研究表明，子宮內(nèi)膜中的免疫細胞和細胞因子對胚胎黏附、滋養(yǎng)細胞侵入、血管重構(gòu)和免疫耐受的影響，是決定胚胎植入和發(fā)育的重要因素?，F(xiàn)就子宮內(nèi)膜免疫環(huán)境與RIF關(guān)系的研究進展進行綜述。

1 免疫細胞

子宮內(nèi)膜中存在多種免疫細胞，包括自然殺傷細 胞（nature killer cell，NK細 胞）、巨 噬 細 胞（macrophage，Mφ）、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和T細胞等，除T細胞外，其他免疫細胞的數(shù)量均隨著月經(jīng)周期呈現(xiàn)周期性變化。這些免疫細胞在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入中發(fā)揮重要作用。

1.1 NK細胞NK細胞是先天性淋巴細胞家族成員之一，是一種細胞毒性天然淋巴細胞，通過分泌細胞因子和殺傷靶細胞，在自然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。人類NK細胞典型表型為CD3-CD56+，根據(jù)CD56表達水平，分為CD56bright亞群和CD56dim亞群。正常妊娠期間，大部分子宮自然殺傷細胞（uterine nature killer cell，uNK細胞）具有較弱的細胞毒性，表現(xiàn)為CD56brightNK細胞。既往大量研究表明，uNK細胞CD56bright亞群和CD56dim亞群的失衡可能導(dǎo)致種植失敗。在所有主要子宮內(nèi)膜免疫細胞群中，uNK細胞在排卵后表現(xiàn)出的增殖水平最高。Strunz等[4]研究發(fā)現(xiàn)，分化程度較低的KIR-CD39-uNK細胞具有更強的促炎能力，能夠產(chǎn)生γ干擾素（interferon γ，IFNγ）、趨化因子3（chemokines 3，CCL3）、CCL4和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），其在月經(jīng)周期中的卵泡期占優(yōu)勢；而KIR+CD39+uNK細胞則與免疫耐受和增強血管生成有關(guān)，其產(chǎn)生的半乳糖凝集素1（galectin-1）可誘導(dǎo)耐受性樹突狀細胞（tDC）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），產(chǎn)生的Tim-3配體galectin-9對1型輔助性T細胞（helper T cell 1，Th1）免疫應(yīng)答起負性調(diào)節(jié)作用，使Th1/Th2比例降低，有利于胚胎植入。Babayeva等[5]通過免疫組織化學(xué)證實，RIF患者黃體期uNK細胞的減少與反復(fù)種植失敗有關(guān)。目前臨床?；贜K細胞水平異常而給予RIF患者免疫治療。Woon等[6]的一項薈萃研究認為，基于NK細胞數(shù)量異常而選擇的免疫治療對RIF患者的妊娠結(jié)局可能是有益的，但在這方面缺乏高質(zhì)量的研究，沒有明確的高級別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，仍需要進一步研究。

1.2 MφMφ在黃體期子宮內(nèi)膜中數(shù)量顯著增加，在妊娠后約占人類蛻膜白細胞的20%～30%，其數(shù)量在人類蛻膜的白細胞群中位居第二。蛻膜Mφ具有高度可塑性，其分化取決于局部微環(huán)境因素，可分化為許多不同的中間型亞型，M1型Mφ即經(jīng)典激活型，表現(xiàn)為促炎效應(yīng)，M2型Mφ即交替激活型，表現(xiàn)為抗炎效應(yīng)，這兩種亞型是Mφ極化的兩種極端亞型，M1型Mφ和M2型Mφ之間的極化平衡在滋養(yǎng)層侵襲和遷移中起重要作用。大量研究表明，在異常妊娠失敗的蛻膜中，Mφ常呈現(xiàn)異常極化狀態(tài)，表現(xiàn)為M1型Mφ比例升高或M2型Mφ比例下降[7]。Ding等[8]發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細胞分泌白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）誘導(dǎo)Mφ分化為M2型Mφ，而分化的M2型Mφ分泌粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/extracellular signal-regulated kinase1/2，PI3K/AKT/ERK1/2）信號通路，推動滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷移，促進胚胎著床。而M1型Mφ衍生的細胞外囊泡通過轉(zhuǎn)運微小RNA146a-5p（miR146a-5p）和miR146b-5p，在轉(zhuǎn)錄水平抑制TNF受體相關(guān)因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）的表達，從而抑制滋養(yǎng)層間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移，導(dǎo)致胚胎著床失敗或流產(chǎn)[9]。

1.3 DCDC是免疫應(yīng)答啟動和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，作為免疫系統(tǒng)中最有效的抗原提呈細胞，DC不僅參與原發(fā)性免疫應(yīng)答的啟動，而且在誘導(dǎo)免疫耐受和調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面也有重要作用。在以G-CSF、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、IL-4、IL-10和 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β（transforming growth factor-β，TGF-β）為主的細胞因子環(huán)境中，DC能夠在吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的誘導(dǎo)下獲得tDC的表型，并能夠驅(qū)動原始Th向Treg分化，從而維持免疫耐受，有利于胚胎植入[10]。DC還可以影響Th1/Th2平衡，在人類妊娠早期，DC能產(chǎn)生較低水平的Th1傾斜細胞因子IL-12p70，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，維持Th2主導(dǎo)狀態(tài)，進而維持正常妊娠[11]。研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者黃體期外周血和子宮內(nèi)膜中的免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄本4（immunoglobulin-like transcript 4，ILT-4）+DC均減少，并推測ILT4+DC通過誘導(dǎo)叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）+Treg有助于維持人類妊娠免疫耐受[12]。而ILT4+DC誘導(dǎo)FOXP3+Treg的分子機制目前尚未明確，有待更深入的研究。

1.4 T細胞在妊娠早期，人類蛻膜中約10%～20%的白細胞是T細胞，30%～45%是CD4+T細胞，45%～75%是CD8+T細胞，其中約5%的CD4+T細胞是具有免疫抑制特性的Treg，這些百分比在整個妊娠過程中保持相對不變。

1.4.1 Th1和Th2細胞Th細胞參與母體妊娠免疫的形成，Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，介導(dǎo)細胞免疫，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；Th2細胞分泌IL-4、IL-10和IL-13等細胞因子，表現(xiàn)為抗炎作用。正常妊娠著床窗口期，由于胎盤分泌孕酮等促進Th2反應(yīng)的細胞因子，子宮內(nèi)膜免疫的改變通常會使Th1/Th2細胞平衡向Th2偏移，Th2細胞增多[13]。研究表明，RIF患者外周血中Th1細胞因子的表達高于Th2細胞因子，表現(xiàn)為促炎狀態(tài)[14]，說明Th1/Th2失衡主要通過改變細胞因子的表達造成RIF的發(fā)生。郭玲等[15]的一項研究也顯示，在著床窗口期，RIF患者外周血中的Th1細胞因子明顯高于Th2細胞因子，而第一次接受IVF/ICSI助孕即成功獲得妊娠的患者Th1/Th2平衡向Th2偏移。反復(fù)暴露于半同種異體胚胎可誘導(dǎo)全身免疫排斥反應(yīng)，并分泌促炎性Th1細胞因子，使Th1細胞因子升高，從而破壞Th1/Th2平衡，影響胚胎著床。當抗原入侵免疫系統(tǒng)，CD4+T細胞增加，產(chǎn)生Th1細胞，而抗原進一步暴露超過閾值會導(dǎo)致CD4+T細胞的部分耗竭，造成Th1細胞增多[16]，這可以在一定程度上解釋為什么RIF患者的子宮內(nèi)膜中Th1/Th2比例失衡。研究表明，對RIF患者使用羥氯喹[17]和他克莫司[18]等藥物可以降低Th1/Th2比值，從而改善ET結(jié)局。而最近有研究表明，多次流產(chǎn)和胚胎植入失敗可能會增加心理壓力，應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮通過增加促炎性Th1細胞因子的產(chǎn)生和減少抗炎性Th2細胞因子的分泌，促進免疫反應(yīng)[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏可使Th1/Th2比值升高，導(dǎo)致RIF的發(fā)生[20]。因此，在ET前補充維生素D可能通過改變Th1/Th2比值提高子宮內(nèi)膜容受性，從而對預(yù)防RIF的發(fā)生有一定益處。

1.4.2 Treg細胞Treg細胞曾被稱為抑制性T細胞，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、維持對自身抗原的耐受性和預(yù)防自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，在妊娠早期到妊娠中期蛻膜組織中數(shù)量逐漸增加，在胚胎植入、妊娠維持中不可或缺。Treg細胞的數(shù)量和功能異常與RIF有關(guān)。RIF患者黃體期子宮內(nèi)膜組織中的Treg細胞密度和免疫抑制功能均降低[21]。Ghanavatinejad等[22]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)血干細胞（menstrual blood stromal stem cell，MenSC）能夠產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的IL-6，誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）介導(dǎo)的T細胞產(chǎn)生IL-10，進一步誘導(dǎo)Treg細胞的分化，MenSC還能夠增加Treg/CD4+IL-17+T細胞比例，有利于妊娠。

1.4.3 Th17細胞在Th細胞亞群中，產(chǎn)生IL-17的Th17細胞屬于促炎性Th亞群，產(chǎn)生標志性細胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22。Th17細胞與感染性免疫有關(guān)，健康人群的外周血中Th17細胞較少，而蛻膜中的Th17細胞密度高于外周血。RIF患者外周血中的Th17細胞比例高于正常生育者，對RIF患者應(yīng)用強的松可以使Th17/Treg平衡向Treg偏移，改善妊娠結(jié)局[23]。MenSC能夠抑制Th17細胞的分化，對妊娠產(chǎn)生有利影響[22]。羥氯喹可通過改變維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoic acid-related nuclear orphan receptor γt，RORγt）和FOXP3 mRNA的表達來降低RORγt/FOXP3比值，從而降低Th17/Treg比值，提高RIF患者的胚胎植入率[24]。

2 細胞因子

2.1 IL-6IL-6在非免疫細胞和免疫細胞之間的相互作用中發(fā)揮重要作用，非免疫細胞中增強的IL-6信號，一方面通過增加活化的T細胞如Th17細胞導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，另一方面通過IL-6/STAT3通路加強激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路，促進其他促炎因子的表達。在RIF患者的內(nèi)膜組織中，IL-6呈高水平表達，且STAT3水平也高于正常生育者，而作為阻斷Treg細胞發(fā)育并誘導(dǎo)Th17細胞分化的關(guān)鍵細胞因子，IL-6的高表達使Th17細胞增多，可造成不良妊娠結(jié)局[25]。Zhou等[26]發(fā)現(xiàn)，孕酮誘導(dǎo)阻斷因子1（progesterone-induced blocking factor 1，PIBF1）可能通過IL-6/p-STAT3通路在RIF的發(fā)生中發(fā)揮作用，PIBF1在RIF患者黃體期子宮內(nèi)膜組織間質(zhì)中的表達明顯低于上皮細胞，PIBF1的減少可以通過IL-6/p-STAT3通路抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（human endometrial stromal cell，hESC）的增殖和蛻膜化，對胚胎著床產(chǎn)生負面影響，而RIF患者黃體期子宮內(nèi)膜PIBF1下調(diào)的原因還有待進一步研究。

2.2 IL-10IL-10是一種抗炎性細胞因子，由多種免疫細胞表達，如適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的Th1、Th2、Th17、Treg細胞和CD8+T細胞，以及固有免疫系統(tǒng)的DC、Mφ和NK細胞等。IL-10對T細胞有直接作用，抑制Th17和Th1細胞，刺激Treg細胞和CD8+T細胞。IL-10水平與著床率呈顯著正相關(guān)，正常生育者分泌期子宮內(nèi)膜的IL-10水平比RIF患者高[27]。而近年來一些研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞（regulatory B cell，Breg）通過誘導(dǎo)免疫耐受在維持妊娠中發(fā)揮重要作用。Koushaeian等[28]發(fā)現(xiàn)RIF患者產(chǎn)生IL-10的B細胞數(shù)量減少，IL-10表達下調(diào)可能在RIF的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。他克莫司可以顯著提高RIF患者子宮內(nèi)膜中的IL-10表達，降低IFN-γ/IL-10比值，從而提高胚胎植入率[18]。

2.3 IL-15IL-15是一種促炎因子，同時在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞中表達，大多數(shù)情況下，其在上皮細胞中的表達高于基質(zhì)細胞，但在蛻膜化后的基質(zhì)細胞中表達增加，黃體中期是月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜IL-15表達最高的時期。IL-15是NK細胞增殖的強誘導(dǎo)劑，直接參與排卵后uNK細胞的募集和成熟，對充足的Th2細胞因子的產(chǎn)生至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15介導(dǎo)NK細胞數(shù)量的增加及其激活狀態(tài)的增強[29]，為RIF的治療提供了新的方向。

2.4 IL-17IL-17由Th17細胞產(chǎn)生，IL-17通過誘導(dǎo)編碼促炎細胞因子（TNF、IL-1、IL-6、G-CSF和GM-CSF）、趨化因子（CXCL1、CXCL5、IL-8、CCL2和CCL7）及抗菌肽（防御素和S100蛋白）的基因表達，參與炎癥的發(fā)生。RIF患者外周血中IL-17升高，其黃體期子宮內(nèi)膜中IL-17的表達顯著增加，外周血和內(nèi)膜高水平的IL-17可能提示異常的局部或全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胚胎著床失敗，而外周血IL-17升高還可能預(yù)示隨后輔助生殖技術(shù)周期失敗的風(fēng)險增加[30]。羥氯喹可以顯著降低RIF患者的IL-17水平，升高IL-10水平，降低IL-17/IL-10比值，從而提高胚胎植入率[24]。

2.5 TNF-αTNF-α最初作為一種抗癌因子被發(fā)現(xiàn)，后來被證實與多種炎癥及免疫性疾病有關(guān)，主要通過NF-κB發(fā)揮其致癌、致炎作用。研究證實，TNFα升高提示免疫系統(tǒng)過度活躍，可增加植入失敗的風(fēng)險，并且與不孕相關(guān)，大多數(shù)RIF患者存在TNF-α的過度表達，從而使子宮內(nèi)膜容受性降低；此外，外周血TNF-α/IL-10比值升高與RIF的發(fā)生相關(guān)[31]。Santiago等[32]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)膜準備過程中對RIF患者使用TNF-α拮抗劑依那西普可以改善其IVF結(jié)局，推測TNF-α與RIF的發(fā)生相關(guān)。

2.6 IFN-γIFN-γ是一種由NK細胞和Th1細胞產(chǎn)生的糖基化蛋白，Th1細胞能夠產(chǎn)生IFN-γ，Th2細胞則對IFN-γ產(chǎn)生應(yīng)答，使其增殖受到抑制。IFN-γ在著床期血管重塑中起重要作用，可以增加絨毛外細胞滋養(yǎng)層（extravillous trophoblast，EVT）凋亡并降低蛋白酶活性，進而調(diào)節(jié)EVT侵襲，從而在早期胎盤形成和滋養(yǎng)細胞侵襲過程中發(fā)揮作用。IFN-γ還具有強大的促炎作用，增加天然免疫細胞中人類白細胞抗原（HLA）Ⅰ類和Ⅱ類抗原及Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）的表達，促進同型轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)分泌趨化因子，激活Mφ并增強其吞噬作用[33]。RIF患者子宮內(nèi)膜中IFN-γ表達水平較高，有研究表明降低IFN-γ水平有利于胚胎植入[18]。

2.7 G-CSFG-CSF是一種造血特異性細胞因子，主要由骨髓細胞、基質(zhì)細胞、成纖維細胞和Mφ產(chǎn)生，一些非造血細胞，如內(nèi)皮細胞、胎盤細胞、滋養(yǎng)細胞和顆粒葉黃素細胞也表達G-CSF受體。G-CSF主要幫助干細胞的動員、遷移和分化，在子宮內(nèi)膜中通過促進血管生成促進子宮內(nèi)膜再生，降低凋亡活性，減少細胞死亡，同時通過對淋巴細胞、Mφ和Th2細胞的作用暫時抑制免疫反應(yīng)，促進胚胎著床和維持妊娠。近年來，關(guān)于G-CSF應(yīng)用于RIF患者的研究也廣泛開展起來。Kalem等[34]的一項隨機對照研究認為，子宮內(nèi)膜厚度正常的RIF患者宮腔灌注G-CSF對于子宮內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率和活產(chǎn)率的改善沒有明顯益處。而Jiang等[35]薈萃分析表明，宮腔灌注和皮下注射G-CSF，尤其是皮下注射時，RIF患者的胚胎植入率和臨床妊娠率均有提高。然而，對于宮腔灌注或皮下注射G-CSF的不良反應(yīng)鮮有報道，因此其用于治療RIF的安全性和必要性仍有待進一步研究。

3 其他

3.1 NF-κBNF-κB蛋白家族與逆轉(zhuǎn)錄病毒癌蛋白v-Rel在結(jié)構(gòu)上具有同源性，可以選擇性與B細胞κ輕鏈增強子結(jié)合，調(diào)控許多基因的表達。NF-κB位于細胞質(zhì)中，調(diào)節(jié)包括子宮內(nèi)膜在內(nèi)許多組織的免疫和炎癥反應(yīng)，NF-κB在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）-TLR4通路引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，NF-κB的激活可調(diào)節(jié)炎癥基因的表達，并促進IL-1β、IL-6和IL-8等細胞因子的釋放[36]。RIF患者子宮內(nèi)膜NF-κB的表達水平顯著升高[37]，這可能提示子宮內(nèi)膜容受性受損。研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律基因Reverbα的激活可以通過抑制TLR4-NF-κB活化減少NF-κB驅(qū)動的炎性細胞因子在hESC中產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，從而有利于胚胎著床[38]，這一研究發(fā)現(xiàn)為RIF患者的治療提供了新的思路。

3.2 細胞毒性顆粒NK細胞和細胞毒性T細胞表達較少的細胞毒性顆粒，如穿孔素（Pfr）和顆粒酶B（GrB），在妊娠維持過程中表現(xiàn)出有限的細胞毒性。近年部分學(xué)者逐漸發(fā)現(xiàn)細胞毒性顆粒在胚胎種植方面可能發(fā)揮一定的作用。γδ-T細胞是由表達γ鏈和δ鏈的T細胞受體（TCR）組成的非常規(guī)T細胞的一部分，既往研究證實其可以通過分泌細胞毒性顆粒和細胞因子在許多免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39]。在正常妊娠期間，γδ-T細胞表達較低水平的GrB[40]。Huang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠失敗的RIF患者外周血中的GrB+γδ-T細胞比例明顯高于成功妊娠的RIF患者，因而推測表達GrB的γδ-T細胞可以作為RIF患者臨床妊娠失敗的預(yù)測因子。細胞毒性顆粒與RIF關(guān)系尚未明確，缺乏高質(zhì)量的研究，仍需進一步研究。

4 結(jié)語

RIF是輔助生殖領(lǐng)域亟待解決的重要問題，其發(fā)病機制尚不完全明確，目前大量研究表明，子宮內(nèi)膜免疫失衡在RIF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，臨床上一些經(jīng)驗性免疫治療也取得了一定的療效，但目前對于RIF患者是否應(yīng)使用免疫治療尚無高級別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。因此，未來仍需要對RIF子宮內(nèi)膜免疫機制進行深入研究以及更多高質(zhì)量隨機對照研究，以期為臨床治療提供更安全有效的個體化治療方案。