選擇性HDAC6抑制劑4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羥基苯甲酰胺的合成

楊 建,石海龍,劉 鋼,盧曉霞*

(1.中國科學(xué)院 成都生物研究所,四川 成都 610041;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一種調(diào)節(jié)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及信號分子等多種蛋白質(zhì)乙?；降拿?與多種疾病如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、自身免疫疾病等密切相關(guān)[1-5]。目前,國際上已有5種非選擇性或部分選擇性的HDAC抑制劑批準上市。然而已上市藥物因選擇性不高而導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、心臟毒性等副作用。因此,選擇性HDAC抑制劑的研發(fā)成為重點[6-10]。

HDAC6抑制劑靶標選擇性高,在機體內(nèi)表現(xiàn)出低毒性,因此以HDAC6為靶標的抑制劑的研究成為了當今科學(xué)界研究的熱點[11-14]。陳基旺等[15]報道了一類喹唑啉-2,4-二酮基羥肟酸用于治療非小細胞肺癌,其中化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羥基苯甲酰胺(1)表現(xiàn)出最強效的抑制活性,IC50=4 nM,有望成為新的選擇性HDAC6抑制劑。

在文獻[15]方法基礎(chǔ)上,本課題組以靛紅酸酐(2)為起始原料,經(jīng)2-苯乙胺開環(huán)、氯甲酸乙酯關(guān)環(huán)、氮上4-溴甲基苯甲酸乙酯的烷基化、酯的氨解及脫芐基生成異羥肟酸等多步反應(yīng)生成化合物1。在此合成路線中,存在以下問題:反應(yīng)過程中需要使用微波反應(yīng)且需要高溫回流,容易造成能源浪費且反應(yīng)不容易放大;在最后一步脫保護基的反應(yīng)中,除了脫掉芐基外還可能脫掉芐氧基,反應(yīng)總收率降低為50%。

鑒于此,本文重新設(shè)計了如下合成路線(Scheme 1):經(jīng)逆合成分析后,以價格便宜易得的靛紅酸酐(2)為起始原料,與4-溴甲基苯甲酸甲酯制備4-((2,4-二氧基-2H-苯并[d][1,3]惡嗪-1(4H)-基)甲基)苯甲酸甲酯(3);不經(jīng)分離,加入2-苯乙胺一鍋反應(yīng)開環(huán)得到化合物4-((2-(苯乙基氨甲?；?苯基)氨基)甲基)苯甲酸甲酯(4);隨后4與三光氣(BTC)在50 ℃反應(yīng),關(guān)環(huán)得到化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)基)甲基)苯甲酸甲酯(5);最后5與鹽酸羥胺反應(yīng)得到目標化合物4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羥基苯甲酰胺(1)。新設(shè)計的合成路線簡潔、反應(yīng)條件溫和、后處理簡單,目標產(chǎn)物總收率高達83.8%。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 400 MHz 型超導(dǎo)核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標);Waters XevoTQ MS型高分辨質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)4-((2,4-二氧基-2H-苯并[d][1,3]惡嗪-1(4H)-基)甲基)苯甲酸甲酯(3)的合成

在干燥的燒瓶中加入21.00 g(6.13 mmol)和干燥的DMF 10 mL,依次加入碳酸銫3.00 g(9.20 mmol)、四丁基碘化銨226.40 mg(0.613 mmol),室溫反應(yīng)30 min至反應(yīng)完全,加入5 mL水攪拌5 min,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有機相,用飽和氯化銨(2×10 mL)以及飽和氯化鈉溶液(2×10 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮后用混合溶劑[V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]打漿得到白色固體71.83 g,收率96.0%;m.p.178～180 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.05(d,J=7.8 Hz,1H),7.92(d,J=8.2 Hz,2H),7.73(t,J=7.3 Hz,1H),7.58(d,J=8.2 Hz,2H),7.32(t,J=7.6 Hz,1H),7.20(d,J=8.4 Hz,1H),5.38(s,2H),3.84(s,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:166.41,159.32,148.79,141.71,141.48,137.47,130.05,129.91,129.23,127.36,124.28,115.44,112.65,52.60,47.94;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C17H13NO5Na{[M+Na]+}334.0691,found 334.0690。

(2)4-((2-(苯乙基氨甲?；?苯基)氨基)甲基)苯甲酸甲酯(4)的合成

方法一:在干燥的燒瓶中加入71.70 g(5.46 mmol)和6 mL 二氯甲烷,攪拌下加入2-苯乙胺694.40 mg(5.73 mmol),室溫反應(yīng)30 min至反應(yīng)完全,二氯甲烷(3×10 mL)萃取,合并有機相,用飽和氯化鈉溶液(2×10 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮后用乙酸乙酯打漿得到白色固體82.08 g,收率98.0 %;方法二:當化合物2反應(yīng)完全后無需純化,攪拌下加入2-苯乙胺780.40 mg(6.44 mmol),室溫反應(yīng)30 min至反應(yīng)完全,二氯甲烷(3×10 mL)萃取,合并有機相,用飽和氯化鈉溶液(2×10 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮后得到用乙酸乙酯打漿得到白色固體82.14 g,一鍋法收率90.0%;m.p.102 ～ 104 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.47(t,J=5.36 Hz,1H),8.32(t,J=5.9 Hz,1H),7.93(d,J=8.2 Hz,2H),7.52(d,J=6.8 Hz,1H),7.47(d,J=8.2 Hz,2H),7.33-7.16(m,6H),6.55(dd,J=14.1 Hz,7.4 Hz,2H),4.54(d,J=5.9 Hz,2H),3.84(s,3H),3.47(dd,J=14.1 Hz,6.8 Hz,2H),2.86(t,J=2.86 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:169.53,166.57,149.19,146.23,140.05,132.57,129.77,129.15,128.80,128.67,126.54,116.09,115.10,111.94,52.50,46.22,40.61,35.55;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C24H25N2O3{[M+H]+}389.1865,found 389.1860。

(3)4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)基)甲基)苯甲酸甲酯(5)的合成

在干燥的燒瓶中加入81.90 g(4.89 mmol)和10 mL THF,然后加入無水碳酸鉀3.38 g(24.45 mmol)攪拌5 min后,冰浴下分批加入三光氣(2.18 g,7.34 mmol),氮氣保護,溫度升至50 ℃反應(yīng)8 h至反應(yīng)完全,冷卻至室溫,用氨水(2×10 mL)把pH調(diào)至10,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有機相,用飽和氯化鈉溶液(2×10 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮后用乙酸乙酯打漿,得到白色固體101.93 g,收率95.0%;m.p.130 ～ 132 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.09(dd,J=7.8 Hz,1.1 Hz,1H),7.92(d,J=8.2 Hz,2H),7.65(t,J=8.0 Hz,1H),7.38(d,J=8.4 Hz,2H),7.32～7.21(m,7H),5.44(s,2H),4.25(t,J=7.1 Hz,2H),2.96(t,J=7.6 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:166.39,161.37,151.10,142.42,139.93,139.00,135.73,129.99,129.19,129.11,128.89,128.53,127.22,126.78,123.49,115.62,115.24,52.58,46.66,42.97,33.62;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C25H23N2O4{[M+H]+}415.1658,found 415.1650。

(4)4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羥基苯甲酰胺(1)的合成[16]

在干燥的燒瓶中加入101.80 g(4.34 mmol)和甲醇13 mL,然后加入一水氫氧化鋰1.27 g(30.38 mmol)攪拌5 min,接著分批加入鹽酸羥胺1.21 g(17.36 mmol)室溫反應(yīng)3 h。旋掉甲醇,殘余物加入8 mL水攪拌5 min,用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有機相,用飽和氯化鈉溶液(2×10 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮后用乙酸乙酯打漿得到白色固體11.77 g,HPLC檢測純度99.7%,收率98.0%;乙酸乙酯打漿,m.p.146～148 ℃(m.p.99～101 ℃);V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/40打漿,m.p.104～ 106 ℃(m.p.99～101 ℃);1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:11.21(br,1H),9.06(br,1H),8.09(d,J=7.4 Hz,1H),7.63-7.72(m,3H),7.30～7.22(m,9H),5.40(s,2H),4.25(t,J=7.0 Hz,2H),2.97(t,J=7.40 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:164.34,161.40,151.12,139.95,138.99,135.70,132.30,129.22,128.89,128.51,127.72,126.90,126.82,123.45,115.61,115.29,46.55,42.96,33.60;HR-MS(ESI)m/z:Calcd C24H21N3O4Na {[M+Na]+}438.1430,found 438.1429。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成3的反應(yīng)條件優(yōu)化

(1)反應(yīng)溫度

在合成化合物3的過程中,合適的反應(yīng)溫度有利于提高產(chǎn)物收率及純度,因此在其他條件不變的情況下,考察了溫度對反應(yīng)的影響。由表1可知,溫度對反應(yīng)影響較大,45 ℃下雖然反應(yīng)較快但是有雜點生成導(dǎo)致收率降低,25 ℃以及35 ℃下反應(yīng)得到單一的產(chǎn)物點且收率相同,但綜合考慮最終確定最佳反應(yīng)溫度為25 ℃。

表1 溫度對反應(yīng)收率的影響Table 1 Effect of temperature on yield

(2)堿

堿的種類及強弱對反應(yīng)的進行以及產(chǎn)物收率及純度均有一定的影響,堿性太弱反應(yīng)不發(fā)生或者反應(yīng)很慢,堿性過強會導(dǎo)致雜點生成。因此在其他條件不變的情況下,對堿的類型進行了考察。如表2所示,其中碳酸銫作堿時收率最高,碳酸鉀作堿時收率略有降低,氫化鈉為堿時反應(yīng)收率最低,且雜點較多。因此最終確定碳酸銫為最優(yōu)堿。

表2 堿對反應(yīng)收率的影響Table 2 Effect of base type on the yield of the reaction

2.2 合成4的反應(yīng)條件優(yōu)化

對于有溶劑存在的反應(yīng)來說,一般溶劑會對反應(yīng)產(chǎn)生較大影響。在合成化合物4的過程中,對反應(yīng)溶劑進行了考察。如表3所示,以非質(zhì)子型極性溶劑DMF為反應(yīng)溶劑時的反應(yīng)收率低于DCM但高于醚類溶劑THF?；诖?最終確定DCM為最優(yōu)反應(yīng)溶劑。此外,可由化合物2一鍋法法合成得到化合物4,此時溶劑為合成化合物3所用到的DMF。因此,如果分步得到化合物4,可選擇DCM為反應(yīng)溶劑(4步反應(yīng)總收率87.6%);如果一鍋法得到化合物4,可選擇DMF為反應(yīng)溶劑?？紤]到操作的方便,最終選擇一鍋法制備化合物4(3步反應(yīng)總收率83.8%)。

表3 溶劑類型對反應(yīng)收率的影響Table 3 Effect of solvent types on the yield of the reaction

2.3 合成5的反應(yīng)條件優(yōu)化

在合成化合物5的過程中,溫度會影響反應(yīng)的快慢以及收率的高低,溫度高反應(yīng)加快但是會造成三光氣部分損失,溫度低反應(yīng)粘度變大導(dǎo)致反應(yīng)速率變慢且原料反應(yīng)不完全,進而導(dǎo)致反應(yīng)收率降低。因此對反應(yīng)溫度進行考察,如表4所示,當在25 ℃下反應(yīng)時,反應(yīng)體系黏稠,磁力攪拌困難且反應(yīng)不完全,逐漸升高溫度,反應(yīng)加快,55 ℃反應(yīng)速率最快,但是三光氣損失損失較多,因此經(jīng)過摸索后得到最佳反應(yīng)溫度為50 ℃,保證了最大反應(yīng)速率以及最大收率的前提下三光氣損失最少。

表4 溫度反應(yīng)收率及速率的影響Table 4 Effect of temperature on yield and reaction rate

2.4 合成1的反應(yīng)條件優(yōu)化

在合成化合物1的過程中,堿性的強弱會影響反應(yīng)。最初,參照文獻[16]以氫氧化鈉作為堿,但是反應(yīng)經(jīng)TLC監(jiān)測發(fā)現(xiàn)有雜點,推測可能強氧化鈉堿性過強。于是對堿進行了簡單篩選,結(jié)果如表5所示。由表5可知,氫氧化鉀為堿時收率低于氫氧化鈉,而以堿性較弱的一水強氧化鋰作為堿,反應(yīng)得到單一的產(chǎn)物點,收率高。因此確定一水強氧化鋰為最優(yōu)堿。

表5 堿對反應(yīng)收率的影響Table 5 Effect of base type on the yield of the reaction

對選擇性HDAC6抑制劑4-((2,4-二氧基-3-苯乙基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-甲基)-N-羥基苯甲酰胺(1)的合成路線進行了重新設(shè)計。通過逆合成分析以及反應(yīng)的優(yōu)化,最終確定以靛紅酸酐(2)為起始原料,經(jīng)氮上烷基化、開環(huán)、關(guān)環(huán)以及酯的氨解生成異羥肟酸等3步簡單反應(yīng)合成了目標化合物1。新設(shè)計的合成路線簡潔、反應(yīng)條件溫和、后處理簡單,易于放大,避免了原路線的缺點,目標產(chǎn)物總收率可達83.8%。