新型氨基酸類(lèi)衍生物的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究

郭易華 黃志勇 王福東 李龍 李榮東

〔摘要〕 目的 將氨基酸引入喹唑啉母核，探究含喹唑啉結(jié)構(gòu)的氨基酸衍生物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。方法 以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和3-氨基-3-苯基丙酸為原料合成關(guān)鍵中間體，與喹唑啉母核連接合成一系列4-苯氨基喹唑啉衍生物。采用CCK-8法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）的抗增殖活性。通過(guò)LeDock軟件測(cè)試目標(biāo)化合物與EGFR蛋白的結(jié)合效果。結(jié)果 合成了21個(gè)新型4-苯氨基喹唑啉衍生物，經(jīng)1H NMR、LC-MS確證其結(jié)構(gòu)。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)化合物12u與12o的抗腫瘤活性與陽(yáng)性對(duì)照藥吉非替尼相當(dāng)。LeDock軟件測(cè)試結(jié)果與體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論 新型4-苯氨基喹唑啉衍生物具有抗非小細(xì)胞肺癌的作用，為進(jìn)一步探究含喹唑啉的氨基酸抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 氨基酸衍生物;喹唑啉;非小細(xì)胞肺癌;A549;細(xì)胞增殖;化學(xué)合成

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R284.3 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.011

〔Abstract〕 Objective To introduce amino acids into the quinazoline core to explore the anti-tumor cell proliferation activity of amino acid derivatives containing quinazoline structure. Methods DL-phenylalanine， L-phenylalanine， D-phenylalanine and 3-amino-3-phenylpropionic acid were used as raw materials to synthesize key intermediates， which were connected to the quinazoline core to synthesize a series 4-phenylaminoquinazoline derivatives. The CCK-8 method was used to test the anti-proliferative activity of the target compound on non-small cell lung cancer cells （A549）. LeDock software was used to test the binding effect of the target compound and EGFR protein. Results 21 novel 4-phenylaminoquinazoline derivatives were synthesized， and their structures were confirmed by 1H NMR and LC-MS. The results of in vitro anti-tumor experiments showed that the antitumor activity of compound 12u and 12o was equivalent to that of the positive control drug gefitinib. The LeDock software test results were consistent with the results of in vitro anti-tumor experiments. Conclusion The novel 4-phenylaminoquinazoline derivatives have anti-non-small cell lung cancer effects， which lay the foundation for further exploration of quinazoline containing amino acid anti-tumor drugs.

〔Keywords〕 amino acid derivatives; quinazoline; non-small cell lung cancer; A549; cell proliferation; chemical synthesis

肺癌是嚴(yán)重病威脅人們生命的惡性腫瘤之一[1]。隨著表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor rece？鄄

ptor， EGFR）、漸變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase， ALK）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶（neurotrophin receptor kinase， NTRK）等幾種酪氨酸激酶抑制劑的發(fā)展，肺癌患者的存活率略有改善[2-4]。喹唑啉是重要的雜環(huán)衍生物，具有抗腫瘤活性[5-7]。吉非替尼為第一代可逆性EGFR抑制劑，在2003年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）患者的單一治療藥物[8]。此外，埃羅替尼和阿法替尼也是用于治療非小細(xì)胞肺癌的EGFR抑制劑[9-10]，且他們都是含喹唑啉結(jié)構(gòu)的上市抗腫瘤藥物。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，具有良好的生物相容性和親和性，將其引入藥物分子，可提高抗腫瘤活性以及代謝穩(wěn)定性，增加藥物的溶解性，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的吸收，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性，為尋求高效、低毒的抗腫瘤藥物開(kāi)辟途徑[11-14]。本文以喹唑啉環(huán)為母核，將修飾后的氨基酸與喹唑啉4位連接，并對(duì)喹唑啉環(huán)6位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計(jì)合成了21個(gè)新型含喹唑啉的氨基酸衍生物，并測(cè)試其對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549的抗增殖活性。

1 儀器與試藥

Water Xevo G2-XS TOf型質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司）;核磁共振波譜儀AVANCE Ⅲ HD 600 MHz（布魯克科技有限公司）;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）;DFY-10L型低溫恒溫反應(yīng)浴槽（鞏義市予華儀器有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）;ZNCL-DL-G2智能磁力攪拌器（愛(ài)博特科技有限公司）;DB-2BC型真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限公司）;Multiskan MK3型多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）;人肺癌細(xì)胞株A549由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予;吉非替尼PS180501（河南普賽化工產(chǎn)品有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售化學(xué)純或分析純，所有試劑使用前都未作處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 ?目標(biāo)化合物的合成

目標(biāo)化合物12a～12u的合成方案如圖1所示，合成路線分為兩部分。第一部分，以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸以及3-氨基-3-苯基丙酸為起始原料，經(jīng)乙?；⑾趸?、酯化和還原，得到重要中間體5a～5d。第二部分以6-羥基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮為原料，經(jīng)乙酰化保護(hù)羥基，氯化亞砜氯化得到7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉，然后與第一部分重要中間體對(duì)接，脫保護(hù)得到重要中間體10a～10d，再對(duì)6位羥基進(jìn)行修飾，得到目標(biāo)化合物12a～12u。

2.1.1 ?（S）-2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（2a）[15]的制備 ?L-苯丙氨酸（15 g，0.091 mol）和水（200 mL）室溫?cái)嚢?0 min，緩慢滴加飽和NaOH水溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值至苯丙氨酸全溶，緩慢滴加乙酸酐（15 mL）。乙酸酐滴加過(guò)程中，由于pH值的改變，L-苯丙氨酸析出，滴加飽和NaOH水溶液維持反應(yīng)液的弱堿性環(huán)境（pH=8.0）。室溫反應(yīng)3 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，滴加鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至2，產(chǎn)物完全析出，抽濾，干燥得白色固體16.6 g，收率：88.2%。

目標(biāo)化合物2b～2d的合成方法參照上述方法。

2.1.2 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸（3a）[16]的制備 ?在250 mL燒瓶中緩慢加入98%硫酸 （9.6 mL）和67%硝酸（8.0 mL），控溫-20 ℃攪拌0.5 h，取出，置于冰浴中攪拌，分批加（S）-2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（10 g，0.048 mol）。18 h后停止反應(yīng)，將反應(yīng)液倒入200 mL冰水中，攪拌，產(chǎn)物析出，抽濾，干燥得白色固體6.9 g，收率：56.7%。

目標(biāo)化合物3b～3d的合成方法參照上述方法。

2.1.3 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸甲酯（4a）[17]的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸（6 g，0.024 mol）溶于甲醇（60 mL），85 ℃攪拌0.5 h，緩慢滴加98%濃硫酸（0.84 mL），回流反應(yīng)7 h，停止反應(yīng)，冷卻至室溫。減壓蒸除甲醇，加乙酸乙酯（100 mL）提取，滴加飽和Na2CO3溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，水相用乙酸乙酯（50 mL×2）萃取，合并有機(jī)相，加水（50 mL×2）洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥有機(jī)相4 h。過(guò)濾，濾液減壓濃縮，得黃色固體5.8 g，收率：91.6%。

目標(biāo)化合物4b～4d的合成方法參照上述方法。

2.1.4 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-氨基苯基）丙酸甲酯（5a）[18]的制備 ?還原鐵粉（11.1 g，0.199 mol）、氯化銨（0.68 g，0.013 mol）、乙醇（56 mL）、水（14 mL）和冰醋酸（3.4 mL），90 ℃機(jī)械攪拌1.5 h，加入（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸甲酯（5.1 g，0.019 mol）繼續(xù)反應(yīng)3 h。趁熱抽濾，濾液減壓濃縮，加二氯甲烷（150 mL）提取，加水（50 mL×2）洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥有機(jī)相4 h。過(guò)濾，濾液減壓濃縮，得黃白色固體3.4 g，收率：75.2%。

目標(biāo)化合物5b～5d的合成方法參照上述方法。

2.1.5 ?7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（8）[19]的制備 ?6-羥基-7-甲氧基-4-酮喹唑啉（10 g，0.052 mol）、乙酸酐（108 mL）和吡啶（22.4 mL），100 ℃攪拌1 h，加入4-二甲氨基吡啶（1.4 g，0.012 mol），繼續(xù)攪拌4 h，停止反應(yīng)。冷卻至室溫，倒入冰水（500 mL）攪拌，抽濾，濾餅烘干，得黃白色固體。將其溶于氯化亞砜（107 mL），80 ℃攪拌0.5 h，滴加DMF（4.6 mL，0.059 mol）。4 h后停止反應(yīng)，冷卻至室溫，減壓回收氯化亞砜，倒入冰水?dāng)嚢?，抽濾，烘干濾餅，得灰白色固體10.5 g，收率：80.0%。

2.1.6 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（9a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-氨基苯基）丙酸甲酯（3.7 g，0.016 mol）溶于異丙醇（37 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（4.8 g，0.014 mol）。4 h后趁熱抽濾，烘干濾餅，得白色固體5.0 g，收率：70.6%。熔點(diǎn)：199.9～201.2 ℃。HRMS（ESI）m/z： 453.1791 [M+H]+。

目標(biāo)化合物9b～9d的合成方法參照上述方法。

2.1.7 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（10a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（3 g，0.007 mol）溶于甲醇（20 mL），70 ℃攪拌0.5 h，加入氨水（5.2 mL）。5 h后冷卻至室溫，反應(yīng)液減壓濃縮，得黃色油狀物。加入乙酸乙酯（30 mL）攪拌，出現(xiàn)黃色固體，抽濾，烘干濾餅，得黃色固體2.5 g，收率：91.9%。熔點(diǎn)：197.5～198.8 ℃。HRMS（ESI） m/z： 411.1613 [M+H]+。

目標(biāo)化合物10b～10d的合成方法參照上述方法。

2.1.8 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.8 g，0.007 mol）溶于DMF（14 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.2 g，0.009 mol）、碘化鉀（0.02 g）和N，N-二甲基-3-氯丙胺（1.5 mL，0.011 mol）。繼續(xù)反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。冷卻至室溫，加入冰水（70 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶于甲醇（10 mL）攪拌，緩慢滴加鹽酸，有白色固體產(chǎn)生，抽濾，烘干濾餅，得白色固體1.6 g，收率：47.3%。

目標(biāo)化合物12b～12l的合成方法參照上述方法。

2.1.9 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-氯丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（11a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.5 g，0.006 mol）溶于DMF（10 mL），75 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.0 g，0.007 mol）、碘化鉀（0.02 g）和1，3-溴氯丙烷（0.78 mL，0.008 mol）。繼續(xù)反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。冷卻至室溫，加冰水（50 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產(chǎn)品，加丙酮洗滌，烘干濾餅，得黃色固體2.3 g，收率：77.4%。熔點(diǎn)：130.2～131.7 ℃。HRMS（ESI） m/z： 487.1737 [M+H]+。

目標(biāo)化合物11b～11d的合成方法參照上述方法。

2.1.10 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12m）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-氯丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.3 g，0.005 mol）溶于DMF（10 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.04 g，0.008 mol）、碘化鉀（0.02 g）和二乙胺（0.8 mL，0.007 mol）。繼續(xù)反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。冷卻至室溫，加冰水（50 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶于甲醇（10 mL），緩慢滴加鹽酸，有白色固體產(chǎn)生，抽濾，烘干濾餅，得黃白色固體1.2 g，收率：48.8%。

目標(biāo)化合物12n～12u的合成方法參照上述方法。

2.2 ?目標(biāo)化合物的圖譜數(shù)據(jù)

2.2.1 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12a） ?白色固體，收率：41.6%。熔點(diǎn)：165.1～167.5 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.51 （s， 1H）， 7.88 （s， 1H）， 7.61 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.22 （s， 1H）， 4.49-4.44 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.63-3.60 （m， 2H）， 3.24-3.19 （m， 2H）， 3.08-3.00 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.27 （s， 6H）， 0.90-0.87 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3410 [M+H]+。

2.2.2 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12b） ?白色固體，收率：38.9%。熔點(diǎn)：153.3～154.5 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.58 （s， 1H）， 7.90 （s， 1H）， 7.63 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.31 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 4.75-4.71 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.73 （s， 3H）， 3.33 （s， 6H）， 3.30-3.25 （m， 2H）， 3.24-3.18 （m， 2H）， 3.04-2.95 （m， 2H）， 2.48-2.34 （m， 2H）， 1.95 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3407 [M+H]+。

2.2.3 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12c） ?白色固體，收率：47.3%。熔點(diǎn)：171.7～174.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.53 （s， 1H）， 7.93 （s， 1H）， 7.63 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.49-4.45 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.68-3.62 （m， 2H）， 3.23-3.18 （m， 2H）， 3.07-3.01 （m， 2H）， 1.98 （s， 6H）， 1.29-1.25 （m， 2H）， 1.21 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3421 [M+H]+。

2.2.4 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12d） ?白色固體，收率：47.3%。熔點(diǎn)：145.7～146.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.65 （s， 1H）， 8.18 （s， 1H）， 7.73 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.45 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.26 （s， 1H）， 5.39 （t， J=7.4 Hz， 1H）， 4.42 （t， J=4.9 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.66 （s， 3H）， 3.47-3.41 （m， 4H）， 3.00 （s， 6H）， 2.43-2.33 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.2431 [M+H]+。

2.2.5 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12e） ?白色固體，收率：36.7%。熔點(diǎn)：168.0～170.2 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.22 （s， 1H）， 7.69 （d， J=7.9 Hz， 2H）， 7.61 （s， 1H）， 7.34 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 4.53-4.40 （m， 1H）， 4.08 （s， 3H）， 4.04-3.98 （m， 2H）， 3.51-3.41 （m， 4H）， 3.35 （s， 3H）， 3.30-3.16 （m， 4H）， 3.06 （dt， J=13.8， 6.9 Hz， 2H）， 2.52-2.40 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.20 （t， J=7.0 Hz， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2517 [M+H]+。

2.2.6 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12f） ?白色固體，收率：41.6%。熔點(diǎn)：153.0～155.2 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.59 （s， 1H）， 8.23 （s， 1H）， 7.70 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.63 （s， 1H）， 7.34-7.27 （m， 2H）， 4.46 （t， J=5.6 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.99 （t， J=12.2 Hz， 2H）， 3.74 （s， 3H）， 3.46 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 3.34 （t， J=1.6 Hz， 4H）， 3.24-3.16 （m， 4H）， 3.08-2.99 （m， 2H）， 2.50-2.42 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2521 [M+H]+。

2.2.7 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12g） ?白色固體，收率：33.7%。熔點(diǎn)：171.0～172.9 ℃。1H NMR（600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.24 （s， 1H）， 7.70 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.56 （s， 1H）， 7.31 （d， J=7.0 Hz， 2H）， 4.46 （t， J=5.2 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 4.01 （t， J=12.1 Hz， 4H）， 3.75 （s， 3H）， 3.45 （t， J=7.2 Hz， 2H）， 3.37-3.33 （m， 4H）， 3.24-3.15 （m， 2H）， 3.09-3.04 （m， 2H）， 2.47 （t， J=6.5 Hz， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2553 [M+H]+。

2.2.8 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12h） ?白色固體，收率：41.6%。熔點(diǎn)：148.5～150.1 ℃。1H NMR（600 MHz， CD3OD） δ 8.60 （s， 1H）， 8.20 （s， 1H）， 7.72 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.47 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 5.41 （t， J=7.1 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.95 （t， J=12.3 Hz， 2H）， 3.69-3.60 （m， 4H）， 3.46 （t， J=6.7 Hz， 2H）， 3.34 （s， 3H）， 2.89 （s， 2H）， 2.88-2.78 （m， 2H）， 2.53-2.36 （m， 4H）， 2.00 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2518 [M+H]+。

2.2.9 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12i） ?白色固體，收率：46.2%。熔點(diǎn)：180.4～182.1 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.60 （s， 1H）， 8.29 （s， 1H）， 7.72 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.66 （s， 1H）， 7.31 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 4.46 （t， J=5.0 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.74 （s， 3H）， 3.45 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 3.34 （t， J=1.6 Hz， 4H）， 3.24-3.17 （m， 2H）， 3.09-3.01 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.84-1.70 （m， 4H）， 1.53-1.40 （m， 4H）， 1.29-1.23 （m， 2H）， 1.04 （t， J=7.3 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3360 [M+H]+。

2.2.10 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12j） ?白色固體，收率：46.2%。熔點(diǎn)：171.9～173.8 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.32 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.31 （d， J=8.8 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.46 （t， J=6.3 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.47-3.44 （m， 2H）， 3.24-3.22 （m， 4H）， 3.20-3.19 （m， 2H）， 2.43-2.38 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.82-1.74 （m， 4H）， 1.64-1.61 （m， 2H）， 1.51-1.44 （m， 4H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3364 [M+H]+。

2.2.11 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12k） ?白色固體，收率：51.2%。熔點(diǎn)：184.2～186.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.63 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.32 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.28 （s， 1H）， 4.44 （t， J=5.5 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.73 （s， 3H）， 3.49-3.41 （m， 2H）， 3.35-3.30 （m， 4H）， 3.25-3.18 （m， 2H）， 3.07-2.99 （m， 2H）， 2.42-2.32 （m， 2H）， 1.96 （s， 3H）， 1.82-1.71 （m， 4H）， 1.52-1.39 （m， 4H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3368 [M+H]+。

2.2.12 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12l） ?白色固體，收率：43.3%。熔點(diǎn)：152.6～153.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.64 （s， 1H）， 8.21 （s， 1H）， 7.74 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.45 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 5.40 （t， J=7.4 Hz， 1H）， 4.43 （s， 3H）， 4.14-4.09 （m， 2H）， 4.08 （s， 3H）， 3.46 （t， J=7.7 Hz， 2H）， 2.90-2.80 （m， 2H）， 2.40-2.35 （m， 4H）， 1.98 （s， 3H）， 1.51-1.43 （m， 8H）， 1.22 （t， J=7.1 Hz， 2H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z：580.3367 [M+H]+。

2.2.13 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12m） ?白色固體，收率：40.4%。熔點(diǎn)：176.3～177.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.43 （s， 1H）， 7.79 （s， 1H）， 7.51 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.24 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.09 （s， 1H）， 4.48 （t， J=4.9 Hz， 1H）， 3.97 （s， 3H）， 3.44-3.38 （m， 2H）， 3.38 （s， 3H）， 3.34-3.27 （m， 4H）， 3.23-3.18 （m， 2H）， 3.10-3.01 （m， 2H）， 2.56-2.48 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.41 （t， J=7.3 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2720 [M+H]+。

2.2.14 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12n） ?黃白色固體，收率：48.8%。熔點(diǎn)：179.9～181.8 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.51 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.66 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.22 （s， 1H）， 4.81-4.73 （m， 1H）， 4.16-4.08 （m， 2H）， 4.06 （s， 3H）， 3.39 （s， 3H）， 3.30-3.23 （m， 4H）， 3.10-3.04 （m， 2H）， 2.57 （t， J=6.2 Hz， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.31-1.24 （m， 6H）， 0.93-0.80 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2716 [M+H]+。

2.2.15 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12o） ?白色固體，收率：40.4%。熔點(diǎn)：166.6～168.3 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.41 （s， 1H）， 7.85 （s， 1H）， 7.64 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.39 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.11 （s， 1H）， 5.41-5.35 （m， 1H）， 4.50 （t， J=5.9 Hz， 2H）， 4.03 （s， 3H）， 3.97 （s， 3H）， 3.45-3.44 （m， 2H）， 2.87-2.77 （m， 4H）， 2.53-2.49 （m， 2H）， 2.02-1.97 （m， 6H）， 1.41 （t， J=7.2 Hz， 2H）， 1.28 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2868 [M+H]+。

2.2.16 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12p） ?白色固體，收率：45.4%。熔點(diǎn)：186.3～188.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.41 （s， 1H）， 7.80 （s， 1H）， 7.52 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.25 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.10 （s， 1H）， 4.64-4.61 （m， 1H）， 4.48 （t， J=4.8 Hz， 2H）， 3.96 （s， 3H）， 3.38 （s， 3H）， 3.35-3.33 （m， 16H）， 3.22-3.18 （m， 2H）， 3.07-3.01 （m， 2H）， 2.50 （t， J=5.9 Hz， 4H）， 1.97-1.96 （m， 6H）， 1.95-1.93 （m， 2H）， 1.28 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4132 [M+H]+。

2.2.17 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12q） ?白色固體，收率：40.5%。熔點(diǎn)：191.1～193.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.58 （s， 1H）， 8.12 （s， 1H）， 7.64 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.34 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.20 （s， 1H）， 4.75-4.72 （m， 1H）， 4.54 （t， J=5.9 Hz， 2H）， 4.08 （s， 3H）， 4.04 （s， 3H）， 3.89-3.82 （m， 2H）， 3.35-3.31 （m， 16H）， 3.30-3.19 （m， 4H）， 3.02-3.00 （m， 2H）， 1.95 （s， 3H）， 1.28 （t， 6H）， 0.95-0.87 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4010 [M+H]+。

2.2.18 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12r） ?白色固體，收率：48.5%。熔點(diǎn)：191.3～192.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.61 （s， 1H）， 8.22 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.43 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 5.57-5.17 （m， 1H）， 4.55 （t， J=5.5 Hz， 2H）， 4.04 （s， 3H）， 3.67 （s， 3H）， 3.66-3.60 （m， 4H）， 3.35-3.31 （m， 8H）， 3.00-2.76 （m， 10H）， 1.99 （s， 3H）， 1.41-1.33 （m， 2H）， 1.19 （t， J=7.0 Hz， 6H）， 0.93 （t， J=6.9 Hz， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4010 [M+H]+。

2.2.19 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12s） ?白色固體，收率：43.3%。熔點(diǎn)：202.6～204.1 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.43 （s， 1H）， 7.82 （s， 1H）， 7.54 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.10 （s， 1H）， 4.69-4.65 （m， 1H）， 4.50 （s， 3H）， 3.98 （s， 3H）， 3.46-3.44 （m， 2H）， 3.36-3.31 （m， 24H）， 3.24-3.18 （m， 2H）， 3.08-3.00 （m， 4H）， 2.55-2.44 （m， 2H）， 1.98-1.94 （m， 6H）， 1.28 （s， 3H）， 0.96-0.77 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 692.4746 [M+H]+。

2.2.20 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12t） ?白色固體，收率：44.5%。熔點(diǎn)：206.0～208.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.20 （s， 1H）， 7.90 （s， 1H）， 7.75 （d， J=7.6 Hz， 2H）， 7.64 （d， J=7.4 Hz， 2H）， 7.54 （s， 1H）， 4.16-4.14 （m， 1H）， 4.11-4.08 （m， 2H）， 3.74 （s， 3H）， 3.57 （s， 3H）， 3.46-3.43 （m， 2H）， 3.39-3.33 （m， 24H）， 3.22-3.21 （m， 4H）， 2.70 （s， 2H）， 1.30-1.25 （m， 6H）， 0.89 （s， 3H）， 0.87-0.86 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 692.3880 [M+H]+。

2.2.21 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12u） ?白色固體，收率：43.2%。熔點(diǎn)：199.7～201.4 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.39 （s， 1H）， 7.81 （s， 1H）， 7.63 （d， J=7.8 Hz， 2H）， 7.39 （d， J=7.5 Hz， 2H）， 7.11 （s， 1H）， 5.38-5.34 （m， 1H）， 4.48 （s， 3H）， 3.96 （s， 3H）， 3.33 （s， 24H）， 3.03-2.98 （m， 2H）， 2.90-2.85 （m， 2H）， 2.82-2.73 （m， 4H）， 2.53-2.48 （m， 2H）， 2.01-1.95 （m， 6H）， 1.32-1.24 （m， 2H）， 0.88 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 692.4747 [M+H]+。

2.3 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法測(cè)定目標(biāo)化合物12a～12u對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的體外抗腫瘤增殖實(shí)驗(yàn)，以吉非替尼為陽(yáng)性對(duì)照藥物。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549癌細(xì)胞消化種于96孔板中（8×104個(gè)·mL-1），置于37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基。設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組以及藥物組，按照濃度梯度0.5、1、5、10、25、50、100 μmol/L給藥（每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔），每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（一塊96孔板測(cè)定1個(gè)目標(biāo)化合物，且每塊板均有陽(yáng)性對(duì)照物）。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8

10 μL培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值，并計(jì)算各化合物的IC50值。IC50值見(jiàn)表1。

2.4 ?目標(biāo)化合物的分子對(duì)接

查閱文獻(xiàn)并從RCSB[20]蛋白庫(kù)網(wǎng)站（https：//www.rcsb.org/）獲取EGFR蛋白的X-衍射晶體結(jié)構(gòu)（PDB編號(hào)為2ITY[21]），利用LeDock軟件對(duì)目標(biāo)化合物和EGFR進(jìn)行分子對(duì)接。（1）利用Chemdraw 3D軟件對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，并保存為mol2格式。（2）根據(jù)下載的EGFR蛋白分子的配體的位置確定對(duì)接盒子的對(duì)接參數(shù)。（3）通過(guò)LeDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得出目標(biāo)化合物與EGFR蛋白分子的最低結(jié)合自由能（表2）。（4）通過(guò)Pymol軟件展示和分析目標(biāo)化合物與EGFR蛋白分子對(duì)接的具體情況。對(duì)接結(jié)果表明，大部分目標(biāo)化合物都是與氨基酸殘基ASP-855和LYS-745形成氫鍵，少部分與氨基酸殘基ASP-800、LYS-716和LYS-728形成氫鍵。L構(gòu)型的目標(biāo)化合物的最低結(jié)合自由能△G（kcal·mol-1）普遍比DL構(gòu)型和D構(gòu)型的目標(biāo)化合物高。其中目標(biāo)化合物12u的最低結(jié)合自由能最小△G=-9.13 kcal·mol-1，它能很好地插入蛋白的結(jié)合口袋并與不同的氨基酸發(fā)生相互作用，主要為疏水作用和氫鍵作用（圖2A-B）。12u結(jié)構(gòu)中乙?；糠值牡脱醴謩e與ASP-855和LYS-745形成氫鍵，碳鏈和苯環(huán)部分與VAL-726、LEU-718和LEU-792形成疏水作用。與活性最差的目標(biāo)化合物12q相比，盡管目標(biāo)化合物12u/吉非替尼（圖2C）與目標(biāo)化合物12q/吉非替尼（圖2D）對(duì)接疊合的整體結(jié)構(gòu)相似，但苯環(huán)上側(cè)鏈之間的相對(duì)位置略有變化，12u/吉非替尼對(duì)接疊合比12q/吉非替尼對(duì)接疊合更緊密，能更加嚴(yán)密地鑲嵌在靶點(diǎn)中。LeDock軟件對(duì)接結(jié)果與體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本符合，推測(cè)目標(biāo)化合物的作用靶點(diǎn)為EGFR蛋白。

3 討論

本文以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和3-氨基-3-苯基丙酸為原料，經(jīng)乙?；?、硝化、酯化和還原，得到4個(gè)重要中間體，通過(guò)氨基將中間體引入7-甲氧基-6-乙酰氧基-4氯喹唑啉的4位，并對(duì)喹唑啉6位羥基脫保護(hù)后進(jìn)行修飾得到21個(gè)目標(biāo)化合物，經(jīng)1H NMR、LC-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

CCK-8法體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與DL構(gòu)型和D構(gòu)型目標(biāo)化合物相比，L構(gòu)型目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性更好，這可能是因?yàn)長(zhǎng)構(gòu)型的目標(biāo)化合物是由L-苯丙氨酸合成的，而L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸。通過(guò)對(duì)比L構(gòu)型目標(biāo)化合物的IC50，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤效果12e>12i>12p>12a>12m、12s，其C-6位的取代基分別為3-嗎啉丙氧基、3-二丁胺丙氧基、3-二己胺丙氧基、3-二甲胺丙氧基、3-二乙胺丙氧基、3-二辛胺丙氧基。而由3-氨基-3-苯基丙酸合成的目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性與L構(gòu)型目標(biāo)化合物恰好相反，其抗腫瘤效果12u>12o>12d>12r>12l、12h，其6位的取代基分別為3-二辛胺丙氧基、3-二乙胺丙氧基、3-二甲胺丙氧基、3-二己胺丙氧基、3-二丁胺丙氧基、3-嗎啉丙氧基。其中12u和12o的抗腫瘤活性與陽(yáng)性對(duì)照藥吉非替尼相當(dāng)。分子對(duì)接結(jié)果表明21個(gè)目標(biāo)化合物與EGFR蛋白均有較好的結(jié)合效果，目標(biāo)化合物最低結(jié)合自由能與體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)、合成了一系列含喹唑啉的氨基酸抗腫瘤衍生物，通過(guò)喹唑啉與氨基酸衍生物連接，并對(duì)喹唑啉結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾得到21個(gè)目標(biāo)化合物，通過(guò)1H NMR、LC-MS認(rèn)證其結(jié)構(gòu)。通過(guò)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物12u和12o的抗腫瘤活性與陽(yáng)性對(duì)照藥吉非替尼相當(dāng)，分子對(duì)接結(jié)果與體外抗腫瘤活性基本一致，為開(kāi)發(fā)新型含喹唑啉結(jié)構(gòu)的氨基酸抗腫瘤藥物提供新思路。

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