1種細(xì)菌纖維素基抗菌復(fù)合材料的制備及性能評價(jià)

林偉鈴，胡 丹，朱宏陽，林 勇，王金海

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院， 福建 福州 350101)

纖維素存在于植物細(xì)胞壁中，是自然界中能夠找到的最豐富的聚合材料之一[1]。目前，工業(yè)所需的纖維素主要來源是木材[2]，生產(chǎn)過程涉及森林的砍伐并且會造成環(huán)境污染[3-4]。與植物纖維素相比，由多種微生物產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC) 不含半纖維素和木質(zhì)素等雜質(zhì)，是最純的纖維素形式之一[5]。BC具有高安全性、低成本、高柔韌性和適應(yīng)性、親水性、透明性、生物相容性和生物可降解性等優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)[6]。BC在食品、醫(yī)療、化妝品、造紙及聲學(xué)器材等領(lǐng)域工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，特別是在食品方面除了作為食品添加劑，還可作為環(huán)保型食品外包裝材料[7-11]。 BC可與抗菌劑制備獲得抗菌材料，此類復(fù)合抗菌材料具備生物可降解性，還能夠較好地抑制微生物的生長，可用作醫(yī)用抗菌敷料，也可用作抗菌食品包裝材料。目前，在抗菌食品包裝材料上BC抗菌復(fù)合材料的研究主要集中于月桂酸/BC、姜黃素/BC、殼聚糖/BC等[12-14]。

ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由25～35個(gè)L-賴氨酸殘基組成的生物聚合物，可被機(jī)體完全消化為賴氨酸[15]。ε-PL具有廣譜抗菌能力，同時(shí)具備生物降解性、低毒性和低成本等特點(diǎn)，可應(yīng)用于果蔬保鮮、食品防腐以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上植物病害的防治等領(lǐng)域[16-18]。本課題將ε-PL與細(xì)菌纖維素復(fù)合制備新型抗菌敷料PLBC復(fù)合膜，并對PLBC復(fù)合膜進(jìn)行性能評價(jià)和抑菌性能考察，為今后PLBC復(fù)合膜在抗菌敷料及抗菌食品包裝領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

細(xì)菌纖維素由本課題組制備獲得，ε-聚賴氨酸由南京工業(yè)大學(xué)提供，菌種為大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [CMCC(B)26003]。

1.2 ε-聚賴氨酸-細(xì)菌纖維素(PLBC)復(fù)合膜制備

將若干BC膜片浸泡于100 mL一定濃度(0、0.5%、1.0%)的ε-PL溶液中，并將其置于超聲清洗器中超聲震蕩，使BC與ε-PL充分接觸吸附均勻，總吸附時(shí)間為1 h，分3次重復(fù)震蕩，間隔時(shí)間10 min。將吸附后的膜片放入濃度為15%甘油中，1～2 s后迅速取出，取出后瀝干表面多余液體，于60℃烘箱烘干至恒重供測試使用。

1.3 PLBC復(fù)合膜結(jié)構(gòu)和性能

1.3.1PLBC復(fù)合膜SEM微觀結(jié)構(gòu)觀察 使用S-3400N型掃描電子顯微鏡觀察PLBC復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)。具體參數(shù)為：使用電壓為10 kV，工作距離5 400～5 600 μm,將樣品固定在銅板上在離子濺射儀中真空噴金，然后觀察表面形貌。

1.3.2吸水率和脫水率測定 將1.0 g左右(具體稱重記為W1)的BC膜/PLBC復(fù)合膜在常溫下浸入蒸餾水中，每間隔2 h稱其重量，直至恒重。將樣品取出后離心分離，稱重記為W2，吸水率計(jì)算公式如下：

吸水率(%)=(W2-W1)/W2×100。將測定完稱重后的樣品置于平皿中37℃通風(fēng)干燥，每隔0.5～1 h稱重，至恒重，繪制脫水率曲線。

1.3.3PLBC復(fù)合膜的分子結(jié)構(gòu)紅外光譜分析 采用傅里葉紅外光譜儀測試PLBC復(fù)合膜的分子結(jié)構(gòu)。將制備好的膜樣品剪取2.5 cm×2.5 cm的方塊后，充分干燥，取一定樣品研碎后與KBr混合并倒入模具中壓片。取樣品進(jìn)行紅外光譜的測定，波長范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，結(jié)合紅外光譜數(shù)據(jù)庫對所得紅外光譜進(jìn)行分析。

1.3.4PLBC復(fù)合膜的分子結(jié)構(gòu)X射線衍射 用X射線衍射儀分析PLBC復(fù)合膜的分子結(jié)構(gòu)。具體參數(shù)為：采用Cu靶，加速電壓為40 kV，電流強(qiáng)度為200 mA，樣間隔0.02°，0.15°·s-1，范圍2～60°。

1.3.5PLBC復(fù)合膜力學(xué)性能測定

(1)PLBC復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度測定。利用質(zhì)構(gòu)儀對PLBC復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度進(jìn)行測定。將膜裁剪成8 cm×1 cm的長條，有效拉伸長度為50 mm，拉伸強(qiáng)度為5 mm·s-1，將復(fù)合膜系于拉伸探頭上，啟動儀器，使探頭慢慢向上拉至膜斷裂。記錄復(fù)合膜斷裂時(shí)的最大張力(F)、伸長距離(L)、應(yīng)力(σ)、應(yīng)變(ε)。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。按下列公式計(jì)算拉彈性模量：

E=σ/ε

其中，E表示楊氏模數(shù)，σ表示正向應(yīng)力，ε表示正向應(yīng)變。

(2)PLBC復(fù)合膜斷裂伸長率(BE)的測定。如上所述，記錄測試樣品模斷裂時(shí)的標(biāo)線之間的距離L和斷裂時(shí)膜被拉伸的長度ΔL。按下列公式計(jì)算：

BE(%)=ΔL/L×100

1.4 PLBC復(fù)合膜抑菌活性測定

1.4.1培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.4，121℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.4.2菌株活化 于超凈工作臺中用無菌接種環(huán)分別接1環(huán)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL體積)中，200 r·min-1、37℃振蕩培養(yǎng)12 h，備用。

1.4.3PLBC復(fù)合膜抑菌性能測定

(1)抑菌圈法。將BC膜及PLBC復(fù)合膜分別用打孔器打出φ8 mm的圓形膜，置于紫外燈下輻照30 min殺菌備用。取無菌培養(yǎng)皿若干套，每皿加入融化的20 mL LB固體培養(yǎng)基作為底層，凝固。將融化并冷卻至45℃左右的LB固體培養(yǎng)基(100 mL)加入50%葡萄糖液1 mL和活化好的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液3～5 mL，充分混勻，立即取5 mL均勻平鋪在已凝固的底層培養(yǎng)基上，凝固成為上層培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子將圓形膜分別放置于培養(yǎng)基上，輕輕將膜攤平，蓋上平皿蓋后，正置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)結(jié)束后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小。

(2)吸光度法。于超凈工作臺中取0.2 mL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液(預(yù)先培養(yǎng)至對數(shù)增長期，大約培養(yǎng)8～10 h)接入裝有20 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，分別放入經(jīng)紫外燈滅菌的BC膜及PLBC復(fù)合膜，37℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)液吸光度(A660)的變化，檢測抗菌膜對指示菌生長的抑制情況。

1.4.4PLBC復(fù)合膜的抑菌曲線 內(nèi)容物溶出試驗(yàn)：將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌培養(yǎng)過夜(8～12 h)，無菌生理鹽水洗滌2次，離心收集菌體，并重懸于無菌生理鹽水中，用無菌生理鹽水稀釋(A630約為0.6)，分別將0.5%(w/v)的BC膜及PLBC復(fù)合膜加入菌懸液中，培養(yǎng)過程中，分別用酶標(biāo)儀記錄吸光度(A260及A280)的變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLBC復(fù)合膜的制備

發(fā)酵獲得的BC(圖1A)用粉碎機(jī)粉碎后經(jīng)酸堿酸浸泡，漂白干凈后于烘箱烘干獲得純BC膜(圖1B)。將BC膜置于不同濃度的ε-PL溶液中，經(jīng)浸泡吸附并恒溫烘干后獲得PLBC復(fù)合膜(圖1C)。從圖2可知，加入ε-PL后，膜展現(xiàn)出良好的均一性， PLBC復(fù)合膜的色澤及表觀形態(tài)與BC膜相比未見明顯區(qū)別。

注：A為發(fā)酵獲得的BC；B為BC膜；C為PLBC復(fù)合膜圖1 BC、BC膜與PLBC復(fù)合膜表觀形態(tài)Fig.1 Morphology of BC, BC membrane and PLBC composite membrane

2.2 PLBC復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)和性能表征

2.2.1PLBC復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察 由圖2可知，BC膜具有明顯的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和孔隙結(jié)構(gòu)(圖2A)。對比不同ε-PL處理的PLBC復(fù)合膜可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ε-PL濃度為0.5%時(shí)，獲得的PLBC復(fù)合膜仍保持了與BC膜類似的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，網(wǎng)絡(luò)與孔隙結(jié)構(gòu)均明顯(圖2B)，當(dāng)ε-PL濃度提高時(shí)至1%時(shí)，BC膜吸附ε-PL的量明顯增加，ε-PL的結(jié)晶增多，獲得的復(fù)合材料的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和孔隙均變差(圖2C)，影響了材料的微觀結(jié)構(gòu)，因此本研究在制備PLBC復(fù)合膜試驗(yàn)中，ε-PL濃度選擇0.5%比較適宜。

注：A為BC膜；B為BC膜+0.5%ε-PL；C為BC膜+1%ε-PL圖2 BC和PLBC復(fù)合膜的SEM圖像Fig.2 SEM images of BC and PLBC composite membrane

2.2.2PLBC復(fù)合膜吸水率和脫水率分析 分別考察了純BC膜及PLBC復(fù)合膜的溶劑吸收率，吸收率分別為457.19%±5.62%、397.36%±4.77%。PLBC復(fù)合膜的溶劑吸收率低于純BC膜，可能由于ε-PL的吸附，占據(jù)了一定的BC膜空間，從而影響了溶劑的吸附，但PLBC復(fù)合膜仍然表現(xiàn)出優(yōu)良的吸收性能。由圖3可知，BC膜與PLBC復(fù)合膜均在2 h內(nèi)完成了脫水。

圖3 PLBC復(fù)合膜脫水速率Fig.3 Dry-down rate of PLBC composite membrane

2.2.3PLBC復(fù)合膜紅外光譜分析 由圖4可知，PLBC復(fù)合膜保留了BC膜的特征吸收峰，即3 341 cm-1處由-OH鍵伸縮振動引起的一個(gè)大的吸收帶，以及2 897 cm-1處由-CH-伸縮振動引起的吸收峰。而且，從圖4B可以看出，ε-PL與BC膜形成了新的氫鍵吸收峰位于3 341 cm-1處，光吸收強(qiáng)度變大，在1 558 cm-1處存在特征峰是由-NH2振動引起的，說明PLBC復(fù)合膜中存在-NH2，因此證明了PLBC復(fù)合膜的成功制備。

注： A為BC膜；B為PLBC復(fù)合膜圖4 BC膜與PLBC復(fù)合膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of BC membrane and PLBC composite membrane

注：A為BC膜；B為PLBC復(fù)合膜圖5 BC膜與PLBC復(fù)合膜X射線衍射分析圖譜Fig. 5 X-ray diffraction analysis map of BC membrane and PLBC composite membrane

2.2.5PLBC復(fù)合膜力學(xué)性能分析 由表1、圖6可知，PLBC復(fù)合膜的力學(xué)特性與BC膜相比較在應(yīng)力、應(yīng)變、彈性模量及斷裂伸長率方面均有了不同幅度的提高，這意味著ε-PL的加入使得BC膜的韌性及拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)，將有利于PLBC復(fù)合膜在抗菌食品包裝方面的應(yīng)用。

表1 BC膜與PLBC復(fù)合膜的力學(xué)性能Table 1 Mechanical properties of BC membrane and PLBC composite membrane

A：BC膜；B：PLBC復(fù)合膜圖6 BC膜與PLBC復(fù)合膜的彈性Fig.6 Elasticity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3 PLBC復(fù)合膜抑菌活性測定

2.3.1抑菌圈法 由圖7可知，在涂布E.coli的平板上，BC膜周圍無抑菌圈，揭開貼于瓊脂表面的BC膜，發(fā)現(xiàn)膜下方亦有細(xì)菌繁殖，說明純BC膜對E.coli無抑菌活性。PLBC復(fù)合膜周圍有明顯的抑菌圈，膜下方無細(xì)菌繁殖(圖7A)，說明PLBC復(fù)合膜對E.coli具有良好的抑菌活性。當(dāng)以S.aureus為抑菌活性測試菌種時(shí)，PLBC復(fù)合膜對S.aureus也具有良好的抑菌活性(圖7B)。

注：A為E.coli抑菌試驗(yàn)；B為S.aureus抑菌試驗(yàn)圖7 BC膜及PLBC復(fù)合膜抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3.2吸光度法 由圖8可知，空白試驗(yàn)中菌體生長曲線與添加BC膜的菌體生長曲線是幾乎重疊的，說明純BC膜對E.coli及S.aureus生長無抑制效果，這與2.3.1中抑菌圈法結(jié)果是一致的。PLBC復(fù)合膜吸光度曲線與0.5%純ε-PL吸光度曲線基本接近，說明PLBC復(fù)合膜中的ε-PL可以近似完全地釋放出來而發(fā)揮抑菌效果，也側(cè)面說明了BC膜吸附ε-PL后可以比較好地釋放從而產(chǎn)生抑菌作用，PLBC復(fù)合膜的抑菌活性來自ε-PL。從結(jié)果分析，PLBC復(fù)合膜對G+及G-菌都表現(xiàn)出良好的抑菌效果。

A為大腸桿菌；B為金黃色葡萄球菌圖8 吸光度法測定PLBC復(fù)合膜對E.coli及S.aureus的抑菌效果Fig.8 Determination of the antibacterial effect of PLBC composite membrane on E.coli and S.aureus by using the absorbance method

2.3.3PLBC復(fù)合膜對E.coli與S.aureus的抑菌機(jī)制 由圖9可知，當(dāng)分別向E.coli菌液中添加BC膜、PLBC復(fù)合膜、ε-PL時(shí)，PLBC復(fù)合膜、ε-PL組的A260及A280均明顯高于BC膜組及空白菌懸液試驗(yàn)組，以S.aureus作試驗(yàn)菌時(shí)，結(jié)果亦與E.coli菌相似。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，付萍等[20-21]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ε-PL對E.coli與S.aureus的抑菌機(jī)制主要為造成細(xì)胞膜的損傷。當(dāng)細(xì)胞膜損傷出現(xiàn)孔洞時(shí)，菌體中的內(nèi)容物核酸及蛋白質(zhì)便會釋放出來，通過測定菌液的A260及A280可以檢測菌體裂解后核酸及蛋白質(zhì)的釋放情況，反映抑菌試劑的抑菌效果。當(dāng)PLBC復(fù)合膜與ε-PL加入菌懸液后，A260及A280在短時(shí)間內(nèi)迅速上升，說明PLBC復(fù)合膜與ε-PL一樣具有良好的抑菌活性，也印證了PLBC復(fù)合膜對抑菌機(jī)制為損傷E.coli與S.aureus的細(xì)胞膜。

A為A260；B為A280圖9 PLBC復(fù)合膜的添加對A260及A280的影響Fig.9 Effect of the addition of PLBC composite membrane on A260及A280

3 討論與結(jié)論

本研究通過超聲震蕩使BC與ε-PL充分接觸吸附后制備出了PLBC復(fù)合膜。對PLBC復(fù)合膜的各項(xiàng)性能進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)PLBC復(fù)合膜的溶劑吸收率低于BC膜，脫水率則兩者相當(dāng)。觀察到ε-PL的結(jié)晶會影響PLBC復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)，ε-PL濃度選擇0.5%比較適宜。紅外光譜分析顯示PLBC復(fù)合膜保留了BC膜的特征峰，同時(shí)存在新的氫鍵吸收峰以及由-NH2振動引起的特征峰。XRD分析表明ε-PL沒有影響B(tài)C的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。在力學(xué)特性上，PLBC復(fù)合膜的應(yīng)力、應(yīng)變、彈性模量及斷裂伸長率均較BC膜有了不同幅度的提高。通過抑菌圈法與吸光度法考察了BC膜與PLBC復(fù)合膜對E.coli及S.aureus的抑菌作用，PLBC復(fù)合膜中的ε-PL可以近似完全地釋放出來而發(fā)揮抑菌效果。初步檢測分析了PLBC復(fù)合膜對E.coli與S.aureus的抑菌機(jī)制，結(jié)果表明PLBC復(fù)合膜與ε-PL的抑菌機(jī)制一致，可通過損傷細(xì)胞膜造成菌體凋亡。本課題制備所得的PLBC復(fù)合膜具有良好的性能及抑菌表現(xiàn)，在醫(yī)用敷料、食品的保鮮包裝等眾多領(lǐng)域中將具有廣泛的應(yīng)用潛力。