謝 勇,鄭佳穎,孫 昕,林 瑾
(閩江師范高等??茖W(xué)校, 福建 福州 350108)
茉莉花茶是我國(guó)的一種特種茶?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,茉莉花茶香可改善人的情緒、能使人集中精神、降壓提神、提高工作效率[1]。茶多酚是茉莉花茶中一種主要的活性物質(zhì)[2],它具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抑制癌細(xì)胞活性等多種活性[3]。從茉莉花茶中高效提取茶多酚已成為花茶產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。高含量茶多酚提取物可用于加工花茶飲品或固體飲料。然而,現(xiàn)有提取茶多酚的方法主要有高溫提取法、低溫萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、酶解法等。高溫法提取導(dǎo)致茶葉中的有效成分損失較大,能耗大,生產(chǎn)效率低,而低溫浸提的提取時(shí)間長(zhǎng),水浸提取率低,且茶湯后續(xù)需要進(jìn)行濃縮處理[4]。超臨界液體萃取和超聲輔助萃取具有較高的活性成分浸出率,速度較快,但設(shè)備費(fèi)用昂貴,投資成本較高[5-6]。生物酶提取法已成為茶葉提取技術(shù)的一種新技術(shù)手段[7],可一定程度彌補(bǔ)高溫或低溫浸提法的不足之處。
茶葉屬雙子葉植物,其細(xì)胞壁由果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成,細(xì)胞壁強(qiáng)度主要取決于初生及次生壁層[8]。如果水解細(xì)胞壁的初生和次生壁層中的纖維素,能使植物的細(xì)胞壁分解,從而細(xì)胞內(nèi)活性成分可以有效釋放出來[9-10]。外源生物酶可以使茶葉中的有效成分得到更好的擴(kuò)散和浸出,進(jìn)而提高浸出物得率。同時(shí),外源生物酶具有酶解條件溫和,無環(huán)境污染,催化效率高的優(yōu)點(diǎn)[11]。本試驗(yàn)以茉莉花茶為試材,采用纖維素酶,考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間、茶湯的pH等因素對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的影響,并利用響應(yīng)面法優(yōu)化茉莉花茶酶解工藝,以得到茉莉花茶多酚提取的最佳參數(shù)條件,為茉莉花茶的開發(fā)與資源利用、茉莉花茶有效物質(zhì)的研發(fā)提供參考。
茉莉花茶樣品由福建春倫集團(tuán)有限公司提供。
主要試劑:纖維素酶(綠色木霉)(400 U·mg-1)購(gòu)自上海源葉生物有限公司;無水檸檬酸(分析純)和檸檬酸鈉購(gòu)自阿拉丁試劑 (上海) 有限公司;硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、十二水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。
主要儀器:電子分析天平(AR224CN)購(gòu)自?shī)W豪斯儀器(上海)有限公司;pH計(jì)(PHS-3E)購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6S)購(gòu)自拓赫機(jī)電科技(上海)有限公司;可見分光光度計(jì)(UV-6100A)購(gòu)自上海佑科儀器儀表有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A)購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
1.3.1茉莉花茶酶解方法 準(zhǔn)確稱取茉莉花茶葉1 g,按單因素設(shè)定條件添加一定比例的蒸餾水;調(diào)整茶湯的pH,并添加一定量的纖維素酶進(jìn)行酶解,水浴溫度保持不變,酶解結(jié)束后快速過濾出茶湯樣品,待檢測(cè)茶多酚含量。
1.3.2茶多酚含量的測(cè)定 參考酒石酸亞鐵比色法[12]并做略微修改,取2 mL茶湯注入25 mL的具塞試管內(nèi),加水至5 mL,再準(zhǔn)確移取5 mL的酒石酸亞鐵溶液于試管內(nèi),倒入pH 7.5的磷酸鹽緩沖液至刻度線,迅速搖勻,保持5 min的靜置時(shí)間。同時(shí)配置試劑空白溶液。將待測(cè)液移入1 cm的比色皿內(nèi),用試劑空白溶液調(diào)零,在30 min內(nèi),540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值,并利用公式算出茶多酚提取率(%)。
1.3.3單因素條件對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的影響 選擇纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比和pH值等單因素條件(表1),按1.3.1方法酶解,并測(cè)定茶多酚含量。
表1 不同單因素酶解條件Table 1 Different single factor enzymatic hydrolysis conditions
1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇酶解時(shí)間90 min、酶解溫度50℃試驗(yàn)條件,以酶添加量(A)、液料比(B)、pH值(C)為考查變量,以茶多酚提取率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見表2。
表2 Box-Behnken Design的因素水平及編碼Table 2 Box-Behnken Design factor level and coding
以上各指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次,采用Excel和SPSS19進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。
由圖1(a)可知,隨著纖維素酶添加量的增大,茶多酚提取率逐漸上升。在纖維素酶添加量達(dá)20 mg時(shí),茶多酚提取率達(dá)到最高值,之后提高酶用量,提取率呈下降趨勢(shì)。因此,纖維素酶添加量對(duì)茉莉花茶中茶多酚的提取效率,在一定水平會(huì)達(dá)到最高值。由圖1(b)可知,隨著酶解時(shí)間的增加,茉莉花茶茶多酚提取率逐漸上升,在條件為90 min時(shí)達(dá)到最高值。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,并沒有明顯提高茶多酚的提取率。由圖1(c)可知,隨著酶解溫度的升高,茉莉花茶茶多酚提取率持續(xù)上升,且無明顯下降趨勢(shì);即溫度越高,茶多酚的提取率越高,且沒有拐點(diǎn)。這可能與高溫有利于花茶中固形物溶出有關(guān)。但隨著提取溫度的提高,會(huì)對(duì)茉莉花茶的香氣造成損失[13]。且酶解溫度高于最佳溫度會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的分子空間被改變,使纖維素酶變性失活,部分酶或者是全部酶變性,從而使酶解反應(yīng)受到抑制[14]。由圖1 (d)可知,隨著液料比的增加,茶多酚提取率逐漸升高。在液料比為80∶1時(shí),茶多酚提取率達(dá)到最高值。這也驗(yàn)證水加速了茶多酚從茶葉到萃取溶劑水的擴(kuò)散,從而提高茶多酚提取率。當(dāng)液料比為100∶1時(shí)茶多酚提取率出現(xiàn)回落,表明茉莉花茶中的茶多酚被提取完全,過多溶劑會(huì)導(dǎo)致因酶促反應(yīng)速度減緩引起的茶多酚提取率回落現(xiàn)象。由圖1(e)可知,隨著pH值的增大,茶多酚提取率在pH值為4.5時(shí)便達(dá)到了提取率的最高值,在pH 4.5之后茶多酚提取率開始逐漸下降。本試驗(yàn)所用的纖維素酶是從綠色木霉提取,其屬于酸性酶。在高pH值的條件下,茶多酚極易被氧化,且茶葉酶解液顏色會(huì)呈變暗且茶多酚含量明顯下降[15]。
注:(a)不同酶添加量對(duì)茉莉花茶多酚提取率的影響;(b)不同酶解時(shí)間對(duì)茉莉花茶多酚提取率的影響;(c)不同酶解溫度對(duì)茉莉花茶多酚提取率的影響;(d)不同料液比對(duì)茉莉花茶多酚提取率的影響;(e)不同pH值對(duì)茉莉花茶多酚提取率的影響圖1 不同酶解單因素條件對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of different single factor conditions of enzymatic hydrolysis on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea
確認(rèn)了采用三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)時(shí),因此需要進(jìn)行17組試驗(yàn)得出其結(jié)果,得出單因素變量及試驗(yàn)結(jié)果,17組設(shè)計(jì)的茶多酚含量見表3。
表3 Box-Behnken Design方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果Table 3 Box-Behnken Design scheme and the data processing results
利用軟件對(duì)表4進(jìn)行多元的回歸擬合,得到酶添加量(A)與液料比(B)、pH(C) 對(duì)茶多酚提取率(R)的回歸模型為:
R=15.50+0.081A+0.16B+0.050C+0.12AB+0.12AC+0.025BC-0.23A2+0.041B2-0.14C2
回歸模型中的系數(shù)絕對(duì)值能反映出各因素對(duì)茶多酚提取率的影響,其中正負(fù)號(hào)代表影響方向。通過觀察一次項(xiàng)系數(shù)的數(shù)值可以得出各因素對(duì)該茶多酚提取率的影響程度。數(shù)據(jù)表明,茶多酚提取率(R)受影響的程度為:液料比(B)>酶添加量(A)>pH(C)。
為對(duì)多元回歸擬合方程進(jìn)行有效性檢驗(yàn),以顯著性、多元回歸模型方差等進(jìn)行分析,結(jié)果見表4。
表4 茉莉花茶茶多酚提取率回歸模型針對(duì)方差的分析Table 4 Analysis on the variance of regression model for the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea
響應(yīng)面等高線曲線圖可以很好地反映出兩個(gè)因子之間的相互作用,在等高線為圓形時(shí),這兩個(gè)因子相互作用不明顯;在等高線為橢圓或馬鞍形時(shí),這兩個(gè)因子之間的相互作用明顯。而響應(yīng)面的三維曲線上的彎曲度與其對(duì)反應(yīng)值的影響呈正相關(guān),傾斜度越高,坡度越陡,就說明對(duì)R的影響程度更大,若曲線平滑則說明兩個(gè)因素的交互作用對(duì)R影響并不明顯。
由圖2可知,茉莉花茶茶多酚提取率會(huì)直接受到酶添加量、液料比的影響,在三維的響應(yīng)面上表現(xiàn)出明顯的斜坡,在響應(yīng)面的等高線曲線圖可以看出等高線間更緊密、呈馬鞍形,即兩者相互作用對(duì)茉莉茶多酚的提取率有很大的影響。
圖2 酶添加量和液料比對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.2 Interaction between the amount of enzyme added and the ratio of liquor to material on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea
由圖3可得出相似的結(jié)果,在響應(yīng)面的等高線曲線圖可以看出等高線間更緊密、近似橢圓,即酶添加量和pH值對(duì)茉莉茶多酚的提取率有很大的影響。
圖3 酶添加量和pH值對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.3 Interaction of the amount of enzyme added and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea
由圖4可知,茉莉花茶茶多酚提取率會(huì)直接受到液料比、pH的影響。液料比與pH對(duì)茶多酚提取率的影響相較于酶添加量與液料比、酶添加量與pH對(duì)茶多酚提取率的影響程度較小。與上述的顯著性結(jié)果一致。
圖4 液料比和pH對(duì)茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.4 Interaction between the ratio of liquor to material and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea
通過Design-Expert軟件對(duì)3種較優(yōu)檢驗(yàn)變量的結(jié)合對(duì)結(jié)果影響的研究,得到了最佳的工藝參數(shù):酶添加量33.8 mg、液料比100∶1、pH 4.8,此時(shí)的茉莉花茶茶多酚提取率為15.77%,經(jīng)過3次平行試驗(yàn)得出茉莉花茶茶多酚提取率為15.89%,試驗(yàn)結(jié)果和理論計(jì)算值吻合較好,誤差較小。本研究結(jié)果表明,可以利用該數(shù)學(xué)模型對(duì)酶解法的茉莉花茶茶多酚含量進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。
酶提取是一種綠色、環(huán)保、有效的提取技術(shù)。本研究中使用的纖維素酶能夠破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁,促進(jìn)茶多酚從茶內(nèi)的滲透[16]。在一定范圍內(nèi),酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間或pH值均可能影響酶解效果。加大纖維素酶添加量可提高提取率,纖維素酶與底物發(fā)生反應(yīng)的機(jī)會(huì)就越多,酶的催化效率就慢慢提升[17],結(jié)合纖維素酶在體系中的作用效果,本研究中茶多酚的提取率慢慢升高。當(dāng)酶用量為20 mg時(shí),茉莉花茶茶多酚提取率可達(dá)到15.37%。但是過多的酶添加,則不利于有效成分的溶出,這與前人的結(jié)果一致。研究結(jié)果表明,茶葉中蛋白可與茶多酚相互結(jié)合,二者形成聚合沉淀,間接導(dǎo)致茶多酚提取率回落[18]。
從酶反應(yīng)進(jìn)程看,茶多酚提取率在提取初期隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。這與初期纖維素酶活性高有關(guān),會(huì)促其積極與底物發(fā)生反應(yīng),但隨著酶解反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行,所得的產(chǎn)物會(huì)堆積,當(dāng)產(chǎn)物到一定濃度時(shí),則會(huì)抑制了酶的活力及酶解反應(yīng)的進(jìn)行。長(zhǎng)時(shí)間對(duì)茶葉進(jìn)行浸泡使得茶葉及茶水收到空氣對(duì)茶多酚的氧化作用增大,容易發(fā)生褐變導(dǎo)致出現(xiàn)茶多酚含量降低的情況[19]。另外,茶葉中含有的一些酚類單寧和花色素也是纖維素酶的一種天然的抑制劑,如果酶在水里過量,會(huì)抑制酶的分解。長(zhǎng)時(shí)間對(duì)茶葉進(jìn)行浸提也會(huì)導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出,茶多酚的析出也就不再明顯。因此,需要尋找一個(gè)適合提取茶多酚的時(shí)間。
pH值對(duì)酶的活性有很大的影響,各酶具有最佳的酸堿度,一旦超過最佳酸堿度,都會(huì)導(dǎo)致酶的活力下降甚至消失。對(duì)最佳pH值的微小偏差,使酶活性部位的基團(tuán)顆粒發(fā)生變化,使酶活力下降;當(dāng)pH值偏差過大時(shí),酶就會(huì)發(fā)生變性。由試驗(yàn)結(jié)果可知該纖維素酶的最適pH為4.5。在最適pH下,有利于發(fā)揮酶的最大活力值,在最適條件下,利用纖維素酶可以使茉莉茶的細(xì)胞壁發(fā)生損傷,使其傳遞阻力減小,有利于茶多酚的提取[20]。pH值太高或pH太低,對(duì)酶在體系內(nèi)的反應(yīng)都存在著不利影響。
在優(yōu)化試驗(yàn)工藝時(shí),本研究選擇的方法為響應(yīng)面法,用響應(yīng)面軟件輔助完成試驗(yàn)的優(yōu)化。在優(yōu)化茉莉花茶酶解工藝研究中,以茶多酚提取率為檢測(cè)因子,使用纖維素酶(綠色木霉) 400 U·mg-1,酶添加量33.8 mg,液料比為100∶1,pH值在4.8,50℃條件下時(shí)酶解90 min。在此操作條件下,經(jīng)過3次平行試驗(yàn)得出茉莉花茶提取率的實(shí)際提取率為15.89%,模型的預(yù)測(cè)值、實(shí)際值二者具有很好的一致性,利用該模型分析酶法提取茉莉花茶茶多酚可靠度高。
本研究選擇纖維素酶提取茉莉花茶中的茶多酚,在一定的提取條件下,酶可破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁,促使茶多酚更有效溶出,同時(shí)利用響應(yīng)面方法優(yōu)化并預(yù)測(cè)最優(yōu)提取工藝,在此工藝條件下茶多酚提取率為15.89%,接近模型預(yù)測(cè)值。