黏膜免疫佐劑研究進展

張一幟，張 媛，李 建，王秀麗，劉元杰，辛凌翔，任小俠，彭國瑞，宋佳誠，李俊平

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

黏膜是機體應對外源病原體的第一道免疫系統(tǒng)防線[1]，能夠激發(fā)持久有效的黏膜免疫反應對于防御病原體感染大有裨益。然而目前黏膜免疫系統(tǒng)局部保護機制的相關信息還較為匱乏[2-3]，且通過黏膜途徑免疫的抗原相對來說產(chǎn)生的免疫反應強度較低[3]。要產(chǎn)生強力而持久的免疫反應，適配于黏膜免疫且安全有效的佐劑就至關重要。一般來講，佐劑的作用取決于其結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)、與細胞互作以及抗原類型[4-5]。黏膜免疫佐劑可以根據(jù)其功能分為兩類：抗原載體型及免疫刺激型?？乖d體型佐劑能夠在黏膜表面保護抗原抵抗艱難條件及巨噬細胞的清除作用，如病毒樣顆粒、脂質(zhì)體、古菌體等。免疫刺激型佐劑能夠通過直接激活先天性免疫，進一步促進持續(xù)性的免疫反應，如LT、CT、TLR受體，以及細胞因子等[6]。

目前通過FDA批準的佐劑主要為鋁佐劑，鋁佐劑因其穩(wěn)定的成分結(jié)構(gòu)和較低的免疫原性獲得了衛(wèi)生部門的批準，然而這種傳統(tǒng)佐劑無法誘導產(chǎn)生理想的黏膜免疫反應[7]。因此亟需研發(fā)新的、安全性良好的、能夠承載抗原或激發(fā)特定免疫反應的黏膜免疫佐劑，本文整理匯總了目前黏膜免疫佐劑的發(fā)展并討論了部分佐劑發(fā)揮其功能的內(nèi)在原因。

1 抗原載體型佐劑

1.1 病毒樣顆粒（VLPs）病毒樣顆粒是由重組表達的單個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組裝成衣殼，再進一步整合形成的多樣復合物[8-9]。安全性方面，在顆粒整合過程中沒有內(nèi)部病毒RNA折疊于其中，因而沒有感染或增殖的風險，同時將病毒整合酶刪除以保證其無法重組或插入宿主細胞的基因組。有效性方面，VLPs作為黏膜免疫佐劑，除自身顆粒蛋白能夠額外表達或包裹抗原外（如病原體表位蛋白、共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)蛋白、免疫活性小分子、多肽及多糖類分子等）[8,10-12]，VLPs重復有序的表面特殊結(jié)構(gòu)還能通過PAMPs識別機制激發(fā)先天性免疫及抗體的產(chǎn)生[11,13]（圖1-1）。有研究使用TLR7和TLR9激動劑作為諾如病毒VLP疫苗的佐劑，經(jīng)口服或鼻內(nèi)給藥小鼠，都在黏膜局部產(chǎn)生了特異性免疫反應[14]。在預防性HIV疫苗研究中，VLPs佐劑疫苗黏膜免疫后使豚鼠產(chǎn)生特異性抗體。值得關注的是，該研究在VLP中插入了膜錨鞭毛蛋白序列，相較于等量可溶性鞭毛蛋白和常規(guī)VLPs組，插入了膜錨鞭毛蛋白序列的VLP作為佐劑能產(chǎn)生更為強力的免疫反應[15]。

1.2 脂質(zhì)體與VLPs類似，脂質(zhì)體也是納米粒子的一種，兩者均為自組裝磷脂雙層包水相，不同點在于脂質(zhì)體能夠形成單層或多層脂質(zhì)體[8,16]。脂質(zhì)體類納米粒子作為疫苗佐劑前景十分廣闊，其優(yōu)勢在于能夠?qū)⑺幬锵鄬Ψ忾]，減少藥物降解，能夠運輸?shù)腿芙庑运幬?，通過包被作用將藥物運送到靶組織減少了毒性藥物對機體的危害[16-17]。脂質(zhì)體通過內(nèi)吞作用被抗原遞呈細胞吸收，包括其中的抗原、免疫調(diào)節(jié)分子以及Toll樣受體等，激活并增強特異性免疫反應。Christensen等[18]使用脂質(zhì)體CAF01作為流感疫苗佐劑鼻內(nèi)給藥，小鼠脾臟檢測到大量IFN-γ表達，血清中檢測到了高水平的特異性IgG，并且發(fā)現(xiàn)CAF01脂質(zhì)體能顯著提高黏膜甘露醇單分子層轉(zhuǎn)運并增強抗原融合，同時不影響單分子層的活性和完整性。Henderson等[19]以陽離子脂質(zhì)體聯(lián)合非編碼質(zhì)粒DNA佐劑（cationic liposome-plasmid DNA complexes,CLDC）作為黏膜免疫佐劑接種小鼠，發(fā)現(xiàn)CDLC能夠增強卵清蛋白（Ovalbumin, Ova）在唾液和肺部灌洗液中IgA和血清中IgG1、IgG2的分泌，并且在肺部灌洗液、血液及肺組織中都檢測到了持續(xù)的抗原特異性CD8+T細胞反應。之后用熱滅活類鼻疽伯克氏菌疫苗驗證CLDC的佐劑作用，將佐劑疫苗和疫苗分別鼻內(nèi)給藥小鼠，攻毒后40 d，疫苗組5/9存活，佐劑疫苗組9/9存活；攻毒后60 d，疫苗組0/9存活，佐劑疫苗組5/9存活。目前脂質(zhì)體類黏膜免疫佐劑待解決的問題，主要包括脂酶敏感、包封效率低、抗原泄漏以及低pH環(huán)境下穩(wěn)定性較差（影響經(jīng)胃腸道途徑接種的有效性）等[8,20]。

1.3 古菌體古菌體，即古細菌極化脂質(zhì)體，為異戊二烯鏈（通過醚鍵連接至甘油主鏈）的支鏈5碳重復序列[20]。這些顆粒在溶液中形成單層、雙層或混合物，具體取決于其中古細菌酚（雙層區(qū)域）和卡他古醇（單層區(qū)域）的脂質(zhì)組成[21]。這些納米粒子的獨特結(jié)構(gòu)賦予其多種優(yōu)勢，如耐氧化，磷脂酶抗性、膽汁鹽抗性、溫度變化穩(wěn)定及低pH穩(wěn)定[20]。Li等[22]使用Cy5.5聯(lián)合OVA口服接種小鼠，分別使用脂質(zhì)體佐劑或古菌體佐劑包封Cy5.5-OVA抗原，所用古菌體由嗜酸熱硫化葉菌純化而得。結(jié)果顯示，相較于脂質(zhì)體佐劑，古菌體佐劑能夠顯著延長抗原在體內(nèi)存在時間，古菌體佐劑還具備誘導更強的體液免疫反應和細胞免疫反應的能力。在Patel等[23]的研究中，以土拉弗朗西斯菌提取物為抗原，分別以古菌體、霍亂毒素作為佐劑免疫小鼠。結(jié)果顯示土拉弗朗西斯菌提取物與古菌體佐劑共免疫組能夠產(chǎn)生強力的特異性細胞免疫反應和體液免疫反應。在鼻腔攻毒試驗中，土拉弗朗西斯菌提取物與古菌體佐劑共免疫組比其他組的保護效果都好。這些研究證明了古菌體的功效及其在黏膜疫苗中的應用，還需進一步的研究闡明其增強體內(nèi)免疫反應的分子機制，以及評估古菌體對于動物的毒性和免疫原性。

1.4 納米凝膠納米凝膠通常由合成聚合物或生物聚合物組成。納米凝膠的直徑不一，能夠?qū)⑦m應的抗原包被于載體系統(tǒng)中。Nochi等[24]開發(fā)了由陽離子型膽固醇基支鏈淀粉組成的納米凝膠。將肉毒梭狀芽胞桿菌的無毒亞基包被于納米凝膠佐劑鼻內(nèi)給藥小鼠，誘導了血清中強特異性IgG和分泌型IgA的抗體應答。另外，鼻內(nèi)給藥疫苗并未導致疫苗于嗅球或大腦中積累，而且該疫苗能夠誘導針對破傷風類毒素的強烈特異性全身和黏膜免疫應答。有研究者使用納米凝膠載體系統(tǒng)開發(fā)了肺炎鏈球菌候選疫苗，通過鼻內(nèi)給藥和肺炎鏈球菌攻毒試驗，在鼠模型上評估疫苗的保護效果。納米凝膠佐劑疫苗對致死劑量肺炎鏈球菌的攻擊具有保護作用，并在小鼠上、下呼吸道中減少了細菌的定植和侵入，同時，也檢測到了免疫組小鼠血清中廣泛的特異性IgG，鼻和支氣管分泌物中的IgA[25]。目前來說，對于納米凝膠研究證明了該技術作為黏膜免疫佐劑的良好前景，而制劑配方和給藥劑量等重要參數(shù)是該技術的突破點，同時還需要更多的研究來評估納米凝膠在人體中的功效和安全性。

1.5 納米乳劑納米乳劑載體系統(tǒng)近年來在黏膜疫苗領域引起了極大的關注，納米乳劑可以認為是水包油乳劑的納米級形態(tài)，將恰當?shù)妮d體有機物經(jīng)過特殊工藝乳化后形成納米級微粒，再被水相分子所包裹，制成口服乳劑。Das等[26]開發(fā)了水包油納米乳劑流感候選疫苗，給動物鼻內(nèi)接種并評估其免疫原性和保護效力。在免疫小鼠中檢測到了廣泛的免疫原性，即流感病毒特異性IgG和IgA，以及高滴度的血凝抑制反應。攻毒后，免疫小鼠肺和鼻甲中的病毒載量均少于對照組。目前納米乳劑的免疫機制研究還不是很深入。Bielinska等[27]鼻內(nèi)接種水包油納米乳劑W805EC能夠激活先天性免疫，并通過TLR2和TLR4途徑激活NF-κB通路。這種激活機制又不同于傳統(tǒng)TLR激動劑，該納米乳佐劑還能夠激活MHCⅡ，CD80和CD86共刺激分子，從而促進樹突狀細胞激活。在一項臨床Ⅰ期研究中，對199名健康成人志愿者鼻內(nèi)給藥后評估了納米乳劑黏膜佐劑與流感抗原結(jié)合的安全性和免疫原性，在受試個體中未觀察到任何不良反應。此外，鼻內(nèi)給藥后也檢測到良好的全身免疫和黏膜免疫效果（鼻洗液IgA）[28]。目前來看納米乳劑安全有效，具備良好的應用前景，但該載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性、劑量、顆粒大小還需要更多的研究完善。

2 免疫刺激型佐劑

2.1 LT/CT大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素（heat—labde entemtoxin, LT）和霍亂毒素（cholera toxin,CT）被報道作為疫苗佐劑有著增強免疫反應的作用[29-31]。這些毒素高度相似，都能夠核糖基化Gs蛋白，促進腺苷環(huán)化，產(chǎn)生cAMP9。一般來說，野生型的LT/CT等毒素直接作為佐劑應用是有毒性的，需要進行特定的改造[32-33]。Mutsch等[34]報道，LT作為佐劑的黏膜免疫流感疫苗可能引起受者患貝爾氏麻痹。2009年，Lewis等[35]報道稱在結(jié)核菌素佐劑人免疫缺陷病毒黏膜免疫途徑疫苗Ⅰ期臨床安全及有效性驗證中，25名受試者中2名出現(xiàn)了貝爾氏麻痹。而目前的解剖學研究也無法徹底排除此類佐劑疫苗黏膜免疫與LT衍生物之間的相關性，新一代的LT和CT佐劑通過位點指向性同源重組等方式進行基因改造[36]，而大多數(shù)突變體嘗試轉(zhuǎn)移走毒性的同時或多或少影響到突變體促進免疫反應的效果。

LTK63被報道在動物體內(nèi)能夠具有佐劑活性而不展現(xiàn)出酶學活性和毒性[37]。2008年，Brynjolfsson等[38]報道鼻內(nèi)接種LTK63作為佐劑的腦膜炎球菌（MenC-CRM197）疫苗相比于未添加佐劑組，佐劑疫苗組的新生小鼠產(chǎn)生了更高水平的IgG，并且佐劑疫苗組小鼠血清殺菌效果也有顯著提高。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)相較于皮下注射方式，該佐劑疫苗通過鼻內(nèi)接種所獲得的血清殺菌效果更為出色。2011年，Barrette等[39]發(fā)現(xiàn)使用LT63和LTR72（LTR72保留了最低限度的必要酶活性）作為佐劑與口蹄疫病毒TCA肽抗原對豬進行黏膜免疫，豬所產(chǎn)生的血清中抗TCA IgG和IgA水平均顯著高于鋁佐劑疫苗組。在CT作為免疫佐劑的研究中，由于CT對于人毒性較大，因此首先就是將CT活躍功能位點進行突變以降低毒性。Nedrud等[40]利用CT衍生物CTA1-DD作為佐劑與幽門螺旋菌亞單位疫苗鼻內(nèi)給藥小鼠，之后進行攻毒，佐劑免疫組取得了良好的免疫效果。Elisason等[41]將非毒性皂素片段插入免疫刺激復合物片段（immunostimulating complex, ISCOMS）再與CTA1-DD整合，制備成安全有效的黏膜免疫佐劑載體，再將流感病毒M2基質(zhì)蛋白中的M2e肽段插入該載體中構(gòu)建成為DNA疫苗。經(jīng)黏膜免疫一定天數(shù)后攻毒，結(jié)果顯示CTA1-3Me-DD/ISCOMS免疫小鼠組有100%的流感病毒保護率，劑量依賴性的顯著提升T細胞和B細胞反應，免疫反應效果強于ISCOM或CTA1-DD單獨免疫組?？梢灶A見未來將會有更多的類LT或CT黏膜免疫佐劑被開發(fā)出來，關鍵點在于產(chǎn)生強力免疫反應的同時限制或移除毒性作用。

2.2 模式識別配體（pattern recognition ligand, PRL）在免疫應答的過程中，抗原遞呈細胞（如DC）依靠自身表面的模式識別受體結(jié)合外來病原體，激活相應信號通路，表達細胞因子進一步激發(fā)相應的免疫反應（圖2）[13,42]。哺乳動物的模式識別受體包括Toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs）、C型凝集素受體（C-type lectin receptors, CLRs）、NOD樣受體（NOD-like receptors, NLRs）、RIG-I樣受體（RIGI-like receptors, RLRs）和AIM2樣受體（AIM2-like receptors, ALRs）等[42-43]。這些模式識別受體能夠結(jié)合外源病原體上的特異性分子，即為模式識別配體（pattern recognition ligands，簡稱PRL）。

圖2 模式識別受體與配體結(jié)合后引起信號通路的激活[13]Fig.2 Binding of TLR and TRL causes signal pathway activation[13]

近年來TLR配體因其能夠結(jié)合受體激發(fā)先天性免疫和持續(xù)的適應性免疫受到了廣泛的關注，篩選恰當?shù)腡RL作為疫苗佐劑是近年來的研究熱點。部分PRL能夠激活刺激多個TLR進而引起多種細胞因子上調(diào)并促進免疫細胞的分化成熟。Domingos等[44]使用CpG-ODN（TLR9激動劑）或poly-(I:C)（TLR3激動劑）作為佐劑與HPV E6/E7治療性疫苗通過系統(tǒng)黏膜和生殖道黏膜免疫途徑接種小鼠，引起了特異性的細胞免疫反應，體現(xiàn)了該佐劑促進免疫反應的效果和作為黏膜免疫佐劑的潛力。2014年，Hjelm等[14]使用諾瓦克病毒VLR與一系列TLR激動劑（TLR3、5、7、7/8和9）通過鼻腔和口腔途徑接種動物，在免疫動物的呼吸系統(tǒng)、腸道系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中都產(chǎn)生了特異性的功能抗體。Buffa等[45]使用一系列TLR配體和殼聚糖作為黏膜免疫佐劑在小鼠上進行試驗，經(jīng)舌下腺、鼻腔、陰道黏膜以及腸道外的途徑分別進行免疫，結(jié)果因免疫途徑不同而異。經(jīng)舌下腺黏膜途徑免疫的TLR4激動劑抑制了系統(tǒng)性免疫反應，而經(jīng)鼻腔和陰道黏膜途徑免疫的TLR4激動劑增強了小鼠的免疫反應。此外，TLR9激動劑經(jīng)舌下腺黏膜和鼻腔黏膜增強了免疫反應，而對于非黏膜途徑免疫無影響。而陸晨陽等[46]以CpG-ODN為佐劑對鴨坦布蘇弱毒活疫苗無明顯的免疫增強效果，并且滯后了抗體產(chǎn)生時間。目前還未有用于人佐劑的TLR激動劑相關研究，而以上臨床前研究對于TLR配體作為黏膜免疫佐劑有著重要的參考價值，所激發(fā)的特定免疫反應類型、免疫方式、免疫劑量將是TLR配體作為佐劑需要著重考慮的。

2.3 FLT3配體FLT3是屬于酪氨酸激酶受體家族的細胞因子受體。FLT3配體在許多人類組織上均有表達，骨髓中也會產(chǎn)生FLT3配體。目前，F(xiàn)LT3配體在疫苗臨床和臨床前研究中均有使用，Evans等[47]將重組人FLT3配體作為乙型肝炎疫苗佐劑接種健康成年人，結(jié)果顯示佐劑疫苗組中單細胞及WBCs數(shù)量均有增長，但乙肝抗體水平并沒有顯著變化。2011年，F(xiàn)ukuyama等[48]使用表達FLT3配體和CpG-ODN的重組質(zhì)粒作為肺炎鏈球菌疫苗佐劑通過鼻內(nèi)給藥小鼠，能特異性夠激發(fā)黏膜免疫反應，分泌大量保護性IgA。

2.4 細胞因子細胞因子由多種免疫細胞分泌產(chǎn)生，種類多樣，功能多元，能夠刺激靶細胞產(chǎn)生相應的免疫反應。參與黏膜免疫的細胞因子能夠提高局部的淋巴殺傷性T細胞反應（cytotoxic T lymphocyte,CTL）以及特異性的IgA和IgG的水平。有臨床前研究使用IL-1、IL-2、IFN-γ以及GM-CSF作為佐劑均取得了不錯的結(jié)果。值得關注的是IL-1家族細胞因子，Kayamuro等[49]將IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-23作為重組流感病毒H抗原疫苗佐劑鼻內(nèi)給藥小鼠，能顯著提升小鼠鼻腔IgA和抗rHA IgG，并且佐劑疫苗組在攻毒試驗中存活率要顯著高于無佐劑疫苗組小鼠。2002年，Bradney等[50]報道，IL-1α、IL-12和IL-18作為佐劑與HIV包膜合成肽疫苗鼻內(nèi)給藥BALB/c小鼠，相較于疫苗單免組，佐劑疫苗組產(chǎn)生了更高水平的血清IgG，排泄物IgA和IgG1。2014年，Khan等[10]以IL-12和IL-23作為流感疫苗的佐劑黏膜接種小鼠，產(chǎn)生了病毒特異性的鼻腔IgA，并且在攻毒后佐劑疫苗組病毒載量顯著低于疫苗單免組。

值得注意的是，鼻腔和胃腸道作為黏膜免疫最常用的靶器官，需要比傳統(tǒng)的皮下免疫方式在運輸佐劑載體、成本以及整體安全性等方面有更多的考量。Huber等[51-52]報道，人IL-12作為佐劑的臨床試驗被撤回，因發(fā)現(xiàn)其對于部分免疫個體有一定毒性，注射IL-12可能會增加IFN-γ的分泌，這會進一步加劇IL-12的毒性反應[53]。2008年，van Herpen等[54-55]報道，在頭頸部鱗狀細胞癌患者中使用重組IL-12能有效活化局部淋巴系統(tǒng)并誘導產(chǎn)生自然殺傷性細胞針對癌細胞的殺傷作用。因而將細胞因子應用于黏膜免疫佐劑的過程中，需要謹慎精確地控制好免疫反應的類型及強度，盡量減少免疫反應過激等影響。

3 展望

黏膜免疫途徑的特點是抗原免疫原性較弱，因此需要開發(fā)適于黏膜免疫的佐劑來提升抗原產(chǎn)生的免疫應答。在現(xiàn)代疫苗制劑產(chǎn)業(yè)中，佐劑被認為是先天性免疫和適應性免疫之間的橋梁。一種優(yōu)秀的佐劑能夠通過增加特定細胞因子的產(chǎn)生、誘導產(chǎn)生抗體、免疫類型轉(zhuǎn)換、免疫組織表面?zhèn)鬟f或更易被抗原遞呈細胞攝取來提升疫苗的免疫效果。如前文介紹，近年來有多種納米粒子和免疫刺激分子作為黏膜疫苗佐劑應用的研究和臨床試驗，其中部分佐劑因能激發(fā)良好的免疫應答而被看好，但將其從研究轉(zhuǎn)化為應用最大的障礙在于專家和管理部門對于此類佐劑復雜性、不穩(wěn)定性和毒性的擔憂。同時，黏膜途徑免疫還存在其他問題，比如性別差異導致的不同，男性和女性泌尿生殖道的體液免疫反應的獨特性可能會影響佐劑的效力；鼻內(nèi)免疫可能會因疫苗本身成分和個體差異導致嗅覺神經(jīng)或鼻上皮損傷；胃腸道中極端條件對于口服或頰含藥物及其佐劑的穩(wěn)定性也是巨大的考驗。雖然近年來納米粒子技術已經(jīng)取得了長足的進步以應對上述挑戰(zhàn)，但該技術還需根據(jù)具體情況和應用途徑對于組分的配方、載體系統(tǒng)、給藥劑量、測試及應用的動物類型等方面進一步開展研究評估。