禽網狀內皮組織增生病毒和A亞群禽白血病病毒共感染SPF雛雞誘導的免疫學反應

侯力丹，劉 丹，翟天舒，毛婭卿，王 嘉，孔冬妮，黃小潔，楊漢春，張亞文，趙 鵬，李俊平

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；3.山東農業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）和禽網狀內皮組織增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）兩種逆轉錄病毒是雞群中常見的垂直傳播性病毒，他們感染雞群后不僅會導致發(fā)生腫瘤，還常常引起免疫抑制，導致疫苗免疫失敗等時常發(fā)生。此前，多個流行病學調查報告顯示，REV與ALV的共感染在雞群中是一種典型的流行病學現象，共感染比單一感染對雞群造成的致病性更強，誘導更加嚴重的免疫抑制。人工致病性實驗結果也表明REV與ALV-J共感染具有顯著的協同致病作用[1-2]。

除了經典的致病性較強的ALV-J外，流行病學調查及在對種雞開展病毒分離鑒定的實踐中發(fā)現，A亞群ALV（ALV-A）是蛋雞中常見的流行亞群[3-4]，特別是蛋雞群中還會出現一定比例的REV與ALV-A共感染現象。作為雞群中最常見的兩種免疫抑制性病毒，單感染REV或ALV-A以及兩者共感染雞后免疫學相關指標的系統(tǒng)觀察，目前還未有系統(tǒng)的研究報道。為此本研究利用SPF雞通過人共感染的方式使其感染上述兩種病毒，后對試驗雞的多個免疫學相關的監(jiān)測指標進行了檢測和比較分析，觀察了REV與ALV-A各自單感染或者共感染后誘導SPF雞的免疫學反應及其差異。

1 材料與方法

1.1 細胞和毒株REV（MD-2株）分離自某污染的雞馬立克氏病疫苗中[5]，已完成其全基因組測序（GenBank登錄號：JX912710）；ALV-A野毒株SDAU09C1株分離自引進的白羽肉用型祖代雞[4]，由山東農業(yè)大學家禽腫瘤病研究室崔治中教授饋贈，已完成其全基因組測序（GenBank登錄號：HM452339）?？蓞^(qū)分內源性和外源性ALV的DF-1細胞購自美國菌種保藏中心（ATCC），用于病毒的增殖和定量。

1.2 抗體與檢測試劑盒針對REV的單克隆抗體MAb11B118由山東農業(yè)大學家禽腫瘤病研究室崔治中教授饋贈，間接免疫熒光的工作濃度為1∶2000；FITC標記的羊抗鼠IgG抗體購自美國Sigma公司；RPE標記的鼠抗雞CD8α抗體、FITC標記的鼠抗雞CD4抗體均購自美國SouthernBioteck公司；禽白血病p27群特異性抗原酶聯免疫（ELISA）檢測試劑盒購自北京愛德氏元亨生物科技有限公司；用于檢測雞白細胞介素（Interleukin, IL）1、2、4、5、10、12、18，雞腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）及雞γ干擾素（Interferon γ, IFN-γ）等多種細胞因子的商品化ELISA檢測試劑盒購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 動物實驗設計1日齡SPF雞共計160只，購自北京梅里亞維通試驗動物技術有限公司。隨機平均分為4組，分別隔離飼養(yǎng)于4臺負壓隔離器中。第1組每只經皮下注射無菌生理鹽水0.2 mL，作為空白對照組；第2組每只雞經皮下注射ALV-A SDAU09C1株1000 TCID50，作為ALV-A單獨攻毒組；第3組每只雞經皮下注射REV MD-2株1000 TCID50，為REV單獨攻毒組；第4組每只雞經皮下注射兩種病毒的混合液0.2 mL，分別含有兩種病毒500 TCID50，為REV和ALV-A共感染攻毒組。于攻毒后第2周對各組SPF雞無菌采集抗凝血接種DF-1細胞進行病毒分離，以確認REV和ALV-A感染成功。分別于攻毒后第2周、4周、6周、10周、12周、14周從每個實驗組各取6只SPF雞，無菌采血分別分離淋巴細胞和血清。

1.4 REV與ALV-A共感染對細胞因子含量的影響對1.3中不同時間節(jié)點采集的血清樣品，分別應用各種細胞因子ELISA檢測試劑盒，按照試劑盒使用說明書分別檢測雞IL-1、2、4、5、10、12、18，TNF-α和IFN-γ的濃度，相關數據使用t-test統(tǒng)計分析各組不同細胞因子濃度差異。

1.5 REV與ALV-A共感染對外周血T淋巴細胞分群的影響采集抗凝血，分離淋巴細胞并對其進行計數。按照流式細胞術的步驟將淋巴細胞處理為107個/mL的密度，分別以CD8α抗體和CD4+抗體對其進行染色，進行CD8+及CD4+細胞計數，并計算CD4+/CD8+比值，以t-test統(tǒng)計分析各組間數據差異。

1.6 REV與ALV-A共感染對外周血細胞部分Toll樣受體mRNA轉錄水平的影響參照NCBI上已公布的雞β-Actin及Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）的mRNA序列，使用Primer Version 5.00軟件（PREMIER Biosoft international，3786 Corina Way，Palo Atto，CA）分別設計和合成用于檢測β-Actin、chTLR2 type1、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR6、chTLR7、chTLR15等各受體基因的real-time PCR檢測引物（表1），以上述引物擴增各基因片段后構建的克隆質粒為模板，繪制熒光定量檢測標準曲線。對提取的外周血淋巴細胞總mRNA首先以d18T為引物進行反轉錄擴增，然后以各相關引物對cDNA進行real-time PCR檢測。統(tǒng)計分析各組間Toll樣受體mRNA轉錄水平的差異。

表1 熒光定量 PCR引物列表Table 1 Primers of real-time PCR

2 結果

2.1 REV與ALV-A病毒分離結果REV單感染和共感染后2周，對REV感染后的雞采血接種DF-1細胞，接種細胞后第7 d時以細胞固定液固定，然后以REV的單克隆抗體MAb11B118進行間接免疫熒光檢測，所有細胞樣品均顯示出典型的染色特征（圖略），判定為存在REV感染，證實人工攻毒實驗成功，血液中REV分離陽性率均為100%。ALV-A單感染和共感染后2周，對ALV-A感染后的雞采血接種DF-1細胞，接種細胞后7 d時取細胞上清液，所有上清液以禽白血病p27群特異性抗原酶聯免疫（ELISA）檢測試劑盒按照試劑盒說明書檢測，均為陽性（S/P數值略），判定為存在ALV感染，證實人工攻毒實驗成功，血液中ALV-A分離陽性率均為100%。

2.2 REV與ALV-A共感染對細胞因子變化的影響以ELISA方法檢測各組雞不同時間點IL-1等9種細胞因子的含量。如表2所示，各感染組IL-1濃度與空白對照組差異不顯著，表明不管是REV與ALV-A單感染還是兩者共感染對IL-1的分泌影響不顯著。感染后2周時，相對ALV-A單感染組以及空白對照組，REV單感染組和共感染組的IL-2濃度出現了顯著升高（P＜0.05），但在感染后12周時，各感染組IL-2濃度又極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。2～6周內，相對于空白對照組和REV單感染組，共感染組IL-18濃度升高，但差異不顯著（P＞0.05）。感染2周時，各感染組的IFN-γ濃度相對于空白對照組均顯著下降，共感染組顯著低于空白對照組（P＜0.05）。感染4周后，各實驗組IFN-γ的濃度高于空白對照組，6周后，ALV-A單感染組極顯著（P＜0.01）高于空白對照組，到第10周時REV單感染組顯著高于空白對照組（P＜0.05）。感染2周時，共感染組TNF-α濃度顯著高于其他組（P＜0.05），但在4周時卻顯著低于其他組（P＜0.05）。14周時，各實驗組TNF-α濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。

2.3 REV與ALV-A共感染對雞外周血CD4+及CD8+ T淋巴細胞分群的影響如表3所示，在感染后2周，各感染組較空白對照組的CD4+T淋巴細胞比例均有不同程度升高，其中REV單感染組顯著高于ALV-A單感染組及空白對照組（P＜0.05）；在感染后4～12周內空白對照組CD4+T淋巴細胞比例始終高于各感染組，在第10周時共感染組顯著低于REV單感染組（P＜0.05），更極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。如表4所示，在感染后2周，相對于空白對照組，各感染組CD8+T淋巴細胞比例均呈現不同程度的升高趨勢，其中REV單感染組極顯著高于ALV-A單感染組和空白對照組（P＜0.01），ALV-A單感染組和共感染組顯著高于空白對照組（P＜0.05）；10～14周時，各感染組均高于空白對照組，特別在第12周時，各感染組CD8+T淋巴細胞比例顯著或極顯著高于空白對照組，在第14周時，除了REV單感染組外，ALV-A單感染組和共感染組均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。如表5所示，各組間不同采樣時間節(jié)點CD4+/CD8+比值的差異較明顯，其中在感染后第2周、6周時，共感染組該比值顯著低于空白對照組（P＜0.05）；12周時，各感染組該比值均極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。

2.4 REV與ALV-A共感染對外周血細胞部分Toll樣受體mRNA轉錄水平的影響以表1所列引物分別對外周血淋巴細胞中β-Actin以及多種Toll樣受體進行了Real-Time PCR檢測，以Toll樣受體基因的Ct值與同一樣品β-ActinCt值的比值來表示Toll樣受體相對轉錄水平。如表6所示，在所有時間節(jié)點，各組間chTLR2 type1和chTLR6相對轉錄水平均無顯著性差異（P＞0.05）。對于chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相對轉錄水平，除了感染后10周時ALV-A單感染組極顯著高于對照組外（P＜0.01），各組間其他時間點均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

REV和ALV作為雞群中常見的兩種免疫抑制性病毒，其單獨感染或者共感染后導致的免疫抑制一直是備受關注的問題，特別是導致禽流感和新城疫等疫苗免疫失敗是對家禽生產的重大危害之一[1-2]。此前，對REV和ALV誘導的免疫抑制主要是從疫苗免疫后的抗體滴度等角度觀察兩者單獨感染或者共感染后的免疫抑制作用，對于兩者單獨感染或者共感染對先天免疫反應和細胞免疫反應方面的影響，一直缺乏系統(tǒng)的研究數據。為此本研究通過在動物試驗中對血清中代表性細胞因子的含量、外周血T淋巴細胞分群以及外周血部分Toll樣受體mRNA轉錄水平等多項指標的監(jiān)測與比較，來分析REV和ALV-A兩者單獨或者共感染狀態(tài)下誘導SPF雛雞免疫反應的差異性。

表2 REV與ALV-A單感染及共感染對雞血清細胞因子濃度的影響（±SD，單位：ng/L）Table 2 Influence on concentration of cytokines in chicken serum infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: ng/L）

表3 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD4+細胞比例的影響（±SD，單位：%）Table 3 Influence on percentage of CD4+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: %）

表4 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD8+細胞比例的影響(± SD，單位: %)Table 4 Influence on percentage of CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A (± SD, unit: %)

表5 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD4+/CD8+比值的影響（±SD）Table 5 Influence on ratio of CD4+/CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

表6 REV與ALV-A單感染及共感染雞外周血淋巴細胞chTLRs mRNA相對轉錄水平（±SD）Table 6 Relative transcription level of chTLRs in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

近年來，雞相關細胞因子的研究取得多項進展，如IL-1、IL-2、IL-4等。本研究選擇9種代表性細胞因子進行了測定，結果表明REV與ALV-A單感染或共感染對雞血清中IL-1等9種細胞因子的濃度總體影響不顯著，但在感染后12周或14周時，共感染會使IL-2、IL-4濃度下降且顯著低于空白對照組。IL-2具有非常重要的免疫調節(jié)作用，能調控免疫系統(tǒng)中白血球的細胞活性，促進Th和CTL的增殖，促進B細胞分化及分泌抗體、誘導產生其他細胞因子、增強單核細胞和NK細胞殺傷活性等多種功能[6]。IL-4主要在調節(jié)體液免疫中起重要作用，能刺激活化B細胞增殖和成熟及促進抗體的生成、誘導T細胞增殖和抗凋亡、參與調節(jié)CD4+T細胞分化成TH2型細胞[7]。相關數據證實REV與ALV-A共感染會使IL-2、IL-4濃度下降，其結果必然會進一步影響疫苗免疫抗體的產生。

T淋巴細胞是重要免疫細胞，根據表面抗原結合受體的不同將其分為不同亞群，其中CD4+細胞為輔助性T淋巴細胞（TH細胞），CD8+細胞為細胞毒性T細胞（TC細胞），CD4+和CD8+及其比值是相對穩(wěn)定的，但是也受雞遺傳背景和性成熟程度等多種因素的影響，并受神經和內分泌系統(tǒng)的調控[8]。在病理狀態(tài)下，病毒等感染后上述指標更會發(fā)生顯著變化，其中CD4+/CD8+T細胞比值作為重要的參考指標，已經在多種疾病的診斷方面被廣泛應用[9-10]。本研究發(fā)現，不同實驗組的CD4+與CD8+T細胞數量在感染后2周均明顯升高，但CD4+T細胞在之后較長時間（4～12周）表現為下降，尤其共感染組下降幅度最大。ALV-A單感染組在大部分時間引起的CD8+T淋巴細胞數明顯升高，12周時顯著高于其他各組，14周時顯著高于空白對照組和REV單感染組。第2～12周，與各感染組相比，共感染組引起CD4+/CD8+比值顯著低于對照組，這表明ALV-A和REV共感染導致的細胞免疫水平下降更加顯著。

模式識別受體TLRs是病原微生物激活天然免疫系統(tǒng)的關鍵受體，目前已在雞的基因組中發(fā)現超過10種TLRs，對多個TLRs在雞組織及細胞中的表達已有系統(tǒng)研究報道[11]。多種TLRs在免疫抑制性病毒感染過程中的作用已有相關報道，施蕾等[12]發(fā)現chTLR3參與雞傳染性法氏囊病毒感染。有研究表明chTLR7可能參與了病毒感染早期的天然免疫反應過程[13]。chTLR15是禽類特有的高度保守的TLRs[14]，感染腸炎沙門菌后TLR15的表達水平顯著上調，且與TLR2的表達密切相關。本研究應用熒光定量PCR檢測了多種TLRs的mRNA相對轉錄水平，結果表明僅在感染后10周時ALV-A單感染組的chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相對轉錄水平極顯著高于空白對照組，chTLR15相對轉錄水平顯著高于空白對照組，呈現出與腸炎沙門菌感染后類似的上調規(guī)律。

綜上所述，盡管在個別時間點REV與ALV-A單感染及共感染引起部分細胞因子濃度呈現顯著變化，但變化幅度不大且規(guī)律不明顯，雞血清中各種細胞因子的濃度受REV與ALV-A感染影響小，相對穩(wěn)定。在感染2周后較長時間內，不管是REV與ALV-A單感染還是共感染，其CD4+/CD8+比值均出現了不同程度的下降，共感染組下降尤其明顯，表明不同感染狀態(tài)對細胞免疫有抑制作用，其中共感染明顯加重對雞群的免疫抑制。本研究為加深對REV和ALV-A單感染或者共感染誘導雞群發(fā)生免疫抑制的理解提供了新的數據。