三種蟲生菌協(xié)同毒性及與有機肥耦合效應研究

謝永紅，聶 銘,2，陳 霞，廖敦秀*

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學院，重慶 401329；2.西南大學，重慶 400715）

蚜蟲是繁殖最快的昆蟲之一，主要分布在北半球溫帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)。蚜蟲柔軟的身體無法保護它免受天敵和疾病的侵害，因此蚜蟲發(fā)展出了多種自我保護的防御方式，從而增大了植保難度。根結線蟲是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲[1-2]。對作物病蟲害須嚴格實行“預防為主，綜合防治”植保方針，著重抓好農(nóng)業(yè)、物理防治措施，配合化學及生物防治，才能有效地減輕其危害[3]。目前已有大量關于生防菌防控報道，然而研究發(fā)現(xiàn)平板上抑菌作用明顯的拮抗菌在盆栽和田間試驗中的防病效果不穩(wěn)定[4-5]。大量生防菌施用到土壤后，由于缺少營養(yǎng)來源，不能在土壤形成優(yōu)勢種群，難以有效抑制土傳病害的發(fā)展[6]。由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和含量與土壤環(huán)境截然不同，拮抗菌施入土壤后，缺少足夠的營養(yǎng)資源，不能大量定殖或者不能產(chǎn)生足夠的拮抗物質，進而導致其生防效率不高[7]。在植物根際土壤中存活著大量的微生物，這些微生物中的部分及其自身的代謝產(chǎn)物能夠抑制病原微生物的生長繁殖，使得從土壤中分離拮抗細菌并利用其防治土傳病害成為可能，這不僅能克服使用農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染，而且能避免農(nóng)藥造成的病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題[8-9]，因此日益受到重視。據(jù)報道，用蘋果渣與熒光假單胞桿菌、哈茨木霉和綠色木霉復合使用可以最大限度抑制尖孢鐮刀菌香蕉專化型[10]，用非致病尖孢鐮刀菌與惡臭假單胞菌復合使用可以抑制劍麻枯萎病和黃瓜枯萎病[11-12]。本研究通過培養(yǎng)白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌，研究單獨菌種對病蟲的毒性及協(xié)同作用，尋求高效生防效果的菌株，在此基礎上制備微生物有機肥，研究不同配比有機肥的實際效能，以期為生物有機肥高效防控蟲害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲生真菌為白僵菌（Beauveria）、綠僵菌（Metarhizium）、淡紫紫孢菌（Purpureocilliumsp.），均由重慶微核生物科技有限公司提供；選擇2 日齡的蚜蟲、地蠶、根結線蟲作為蟲生真菌的防殺對象。

1.2 試驗方法

1.2.1 三種蟲生真菌毒性試驗

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA 培養(yǎng)基，對白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌進行活化，獲得生長旺盛的三種蟲生真菌菌種。培養(yǎng)基配制參照文獻[13]進行。以150頭2日齡蚜蟲為寄主，設置孢子懸浮液含量共五個水平，分別為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu·mL-1，各處理噴施3 d 后每隔2 d 用顯微鏡觀察蚜蟲死亡頭數(shù)，每個水平3 次重復，共計45 個毒性觀察試驗。利用最小二乘法擬合各蟲生菌處理濃度與蚜蟲死亡率的回歸模型。

1.2.2 三種蟲生真菌拮抗性試驗

配制PPDA 培養(yǎng)基，采用平板對峙法，將活化的三種原菌打成6 mm 菌餅，置于PPDA 培養(yǎng)基遠離中心4 cm 的圓周上等分間隔分布，3 次重復，平放于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，5 d 后觀察三種蟲生真菌在PPDA 培養(yǎng)基上的生長情況及抑菌帶的寬度。

1.2.3 三種蟲生菌協(xié)同殺蟲試驗

對活化后的三種蟲生菌進行組合，組合方式設置為“白僵菌+綠僵菌”“綠僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+綠僵菌+淡紫紫孢菌”四種，菌劑濃度為1×109cfu·mL-1，對蚜蟲、地蠶、根結線蟲進行毒性測定，11 d 后觀察試驗結果；以單獨的三種蟲生菌作為對照。根據(jù)校正死亡率減去理論致死率計算得到協(xié)同毒力指數(shù)。

1.2.4 生防菌群與有機肥耦合增效試驗

通過設置不同白僵菌-淡紫紫孢菌組合菌群與油餅、有機肥配施水平，觀察生防菌與有機肥耦合效應。設置的處理分別為“5%油餅+95%有機肥”“清水+5%菌劑”“5%油餅+95%有機肥+2%菌劑”“5%油餅+95%有機肥+5%菌劑”“5%油餅+95%有機肥+10%菌劑”“10%油餅+90%有機肥”“10%油餅+90%有機肥+2%菌劑”“10%油餅+90%有機肥+5%菌劑”“10%油餅+90%有機肥+10%菌劑”“15%油餅+85%有機肥”“15%油餅+85%有機肥+2%菌劑”“15%油餅+85%有機肥+5%菌劑”“15%油餅+85%有機肥+10%菌劑”，共計13 個處理，以“5%油餅+95%”有機肥為對照。將各處理與試驗土壤充分混合，選擇100株植物進行根結線蟲感染觀察。并用響應曲面法進行試驗數(shù)據(jù)分析，求出最優(yōu)有機肥與真菌配比。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2013 進行整理與統(tǒng)計，利用SPSS 19.0進行方差和回歸分析，利用Design expert 8.0進行響應面試驗回歸及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 三種蟲生菌對蚜蟲的毒性

以150 頭2 日齡蚜蟲為寄主，觀察1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu·mL-1孢子懸浮液濃度下蚜蟲死亡頭數(shù)，計算出藥后3～11 d的校正死亡率（見表1）。

表1 白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌菌株對蚜蟲的毒力

藥后11 d，對照的蚜蟲正常死亡率為6.67%～9.33%；由低至高不同濃度的白僵菌菌株對蚜蟲的校正死亡率分別為28.57%、38.57%、66.43%、79.29%、85.71%，綠僵菌對蚜蟲的校正死亡率分別為12.14%、26.43%、49.29%、63.57%、77.14%，淡紫紫孢菌對蚜蟲的校正死亡率分別為17.86%、45.71%、58.57%、69.29%、80.00%。三種蟲生菌株均隨著孢子濃度增加，對蚜蟲的致死率越高；其中白僵菌、淡紫紫孢菌孢子濃度大于1×107cfu·mL-1時，蚜蟲死亡率均大于50%，綠僵菌孢子濃度為1×107cfu·mL-1時，蚜蟲死亡率接近50%。

以濃度為變量，11 d 后蚜蟲的死亡率為響應量，采用最小二乘法建立回歸模型，結果見表2。白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌的濃度與蚜蟲致死率之間均服從對數(shù)函數(shù)，其相關系數(shù)分別為0.934 7、0.953 6、0.997 5，回歸模型為極顯著，說明得到的擬合模型是有效的，能夠很好地預測不同濃度對蚜蟲的致死率。通過回歸方程得到白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對蚜蟲50%致死濃度分別為5.048×106、1.155×107、6.962×106cfu·mL-1，說明三種蟲生真菌對蚜蟲的毒力大小為白僵菌＞淡紫紫孢菌＞綠僵菌。

表2 白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌菌株對蚜蟲的毒力回歸方程

2.2 拮抗試驗

觀察三種蟲生真菌在PPDA 培養(yǎng)基上的生長情況，發(fā)現(xiàn)三種蟲生真菌的菌落都能正常生長，菌落交界處都沒有產(chǎn)生任何抑菌帶，說明白僵菌、綠僵菌和淡紫紫孢菌菌株三種蟲生真菌菌株相互之間都沒有生長拮抗性，可用于組合殺蟲菌群。

2.3 生防菌群協(xié)同殺蟲效果

將不同蟲生真菌菌株進行組合后殺蟲，測定不同組合的協(xié)同殺蟲效果（見表3、表4、表5），結果發(fā)現(xiàn)組合菌群的殺蟲效果均優(yōu)于單一菌株的殺蟲效果。白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對蚜蟲、根結線蟲的校正死亡率分別為96.69%、94.48%，分別大于其84.23%、90.17%的組合理論致死率；對蚜蟲、根結線蟲的協(xié)同毒力指數(shù)分別為3.66、4.77，具有一定的協(xié)同殺蟲效果。其他組合菌群對蚜蟲、根結線蟲的校正死亡率均低于組合理論致死率，協(xié)同毒力指數(shù)均為負值。白僵菌+綠僵菌組合菌群對地蠶的校正死亡率為91.16%，大于組合理論致死率（84.2%）；對地蠶的協(xié)同毒力指數(shù)為8.23，具有一定的協(xié)同殺蟲效果。其他組合菌群對地蠶的校正死亡率均低于組合理論致死率，協(xié)同毒力指數(shù)均為負值。白僵菌+綠僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對蚜蟲、地蠶、根結線蟲的致死率均較高，但均未超過其組合理論致死率，無協(xié)同殺蟲效果。

表3 不同菌群對蚜蟲的協(xié)同殺蟲效果

表4 不同菌群對地蠶的協(xié)同殺蟲效果

表5 不同菌群對根結線蟲的協(xié)同殺蟲效果

2.4 生防菌群與有機肥耦合效應

由生防菌協(xié)同殺蟲效果得到白僵菌+淡紫紫孢菌組合的協(xié)同毒力指數(shù)最高，因此以該菌群與油餅、有機肥配施，設置配比試驗。由表6結果可見，不同有機肥配比提升白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群根結線蟲防效5.3～26.4 個百分點。在15%油餅添加比例范圍內，有機肥C/N與組合菌群的殺蟲效果呈負相關，在10%油餅添加比例有機肥提高根結線蟲平均防效16.5%。綜合考慮有機肥載體成本和防治效果，以10%油餅+90%有機肥組合作為適宜的組合菌群有機肥載體。在有機肥載體中，白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群濃度與殺蟲效果呈正相關，5%菌劑添加量對根結線蟲的防效達到70%以上。

表6 白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群在不同有機肥載體中的殺蟲效果

為獲得優(yōu)化的菌肥耦合配比，通過響應面設計試驗方案，因子分別為有機肥、油餅、白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌劑，試驗觀察指標為根結線蟲殺蟲率。由表7 結果可見，第11 組即“85%有機肥+10%油餅+10%菌劑”組合對根結線蟲的防效最高，達到74.58%。

根據(jù)表7 的試驗結果，通過Design-Expert 軟件中Analysis 模塊進行方差分析可確定回歸方程。分析得到白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群與油餅、有機肥配施對根結線蟲防效的多元二次回歸方程為：

表7 菌肥耦合響應面試驗設計及結果

（1）式中，y為根結線蟲防治效果，單位為%；A為有機肥比例，%；B為油餅比例，%；C為菌劑濃度，%。

由一次項系數(shù)大小可以看出，C因素（菌劑濃度）對菌肥耦合殺蟲效果的影響最為顯著，A因素（有機肥比例）次之，B因素（油餅比例）最弱。通過方差分析表明，A因素和C因素對菌肥耦合殺蟲效果的影響達到極顯著水平，B因素和C因素交互作用對菌肥耦合殺蟲效果的影響達到顯著水平。利用Design-Expert 軟件繪出模型中AB、AC和BC交互項的響應曲面（見圖1），響應曲面的陡峭程度，反映了因素對試驗的影響程度，如果曲面陡峭程度高，說明該因素對試驗結果影響大，反之，則對試驗結果影響小。

圖1 ABC因素交互作用對根結線蟲防治效果的響應

通過數(shù)學模型對菌肥耦合條件進行優(yōu)化，利用Design-Expert 軟件中Optimization預測優(yōu)化功能分析可得到菌肥耦合優(yōu)化條件，最優(yōu)線蟲防效達到80.5%，此時的菌肥優(yōu)化配比為有機肥80.5%、油餅14.3%、“白僵菌+淡紫紫孢菌”組合菌劑8.4%。綜合考慮生產(chǎn)成本和殺蟲效果因素，確定有機肥中添加10%油餅和8%組合菌群作為優(yōu)化的生防菌群與有機肥耦合增效配比。

3 結論與討論

據(jù)報道，解淀粉芽孢桿菌能夠有效抑制灰霉病、青霉病等真菌病害[14]，但目前國內外尚未發(fā)現(xiàn)利用白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌防治蚜蟲和根結線蟲的報道。本文通過試驗得到白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對蚜蟲50%致死濃度分別為5.048×106、1.155×107、6.962×106cfu·mL-1，說明三種蟲生真菌對蚜蟲的毒力大小為白僵菌＞淡紫紫孢菌＞綠僵菌。白僵菌、綠僵菌和淡紫紫孢菌菌株三種蟲生真菌菌株相互之間都沒有生長拮抗性，可用于組合殺蟲菌群，白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對蚜蟲、根結線蟲的協(xié)同毒力指數(shù)分別為3.66、4.77，白僵菌+綠僵菌組合菌群對地蠶的協(xié)同毒力指數(shù)為8.23，具有一定的協(xié)同殺蟲效果，其余為負值，說明協(xié)同效果降低。生物有機肥產(chǎn)品的質量直接影響使用效果，而產(chǎn)品質量的關鍵指標是產(chǎn)品的有效活菌數(shù)。生物有機肥的活菌數(shù)量決定于產(chǎn)品生產(chǎn)工藝，而供微生物生長的有機質載體是其重要的決定因素。有機肥比例和菌劑濃度對菌肥耦合殺蟲效果的影響達到極顯著水平，油餅比例、有機肥比例和菌劑濃度交互作用對菌肥耦合殺蟲效果的影響達到顯著水平，有機肥與蟲生菌耦合效果影響因子大小為有機肥比例＞菌劑濃度＞油餅比例。相較于對照，在配制一定的生物菌后其防病能力都顯著提高，更加說明了增加生防菌營養(yǎng)載體的重要性。曹亮亮等研究同一功能菌株添加不同有機載體制成的生物有機肥時，發(fā)現(xiàn)添加膨化羽毛粉制成的生物有機肥不及添加菜粕制成的生物有機肥對香蕉的促生作用顯著[15]，這一研究結果給我們的一個重要啟示是，在篩選生防菌資源時，應以產(chǎn)品開發(fā)為主導，根據(jù)不同的有機載體，篩選并獲得具有較大潛力的功能菌株。本文通過數(shù)學建模分析表明，當有機肥80.5%、油餅14.3%、白僵菌-淡紫紫孢菌組合菌劑8.4%時，對根結線蟲防效達到最優(yōu)，其值為80.5%。