固相萃取法聯(lián)用UPLC-Triple-TOF/MS法鑒定花菜中自由和結(jié)合態(tài)植物甾醇

馮思敏，吳思杰，江佳萍，廖 杰，孫培龍，2，邵 平，2*

（1 浙江工業(yè)大學食品科學與工程學院 杭州 310014 2 中國輕工業(yè)食品大分子資源加工技術(shù)研究重點實驗室（浙江工業(yè)大學） 杭州 310014 3 浙江華才檢測技術(shù)有限公司 浙江紹興 311800）

花菜（Brassica oleracea L.var.botrytis L.），又名花椰菜、菜花、洋花菜，為十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種[1]。其適應(yīng)性強，在我國分布廣泛，主要集中于福建、浙江、江蘇等沿海地區(qū)，以及河北、云南等地區(qū)[2]。花菜中含有豐富的維生素、碳水化合物、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，以及蘿卜硫素[3]、多酚、芥子油苷[4]、植物甾醇[5]等生物活性物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值。

植物甾醇（Phytosterol）是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架的天然活性物質(zhì)[6]，其結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，然而功能完全不同，廣泛存在于各種植物油、堅果及其它植物性食物中。Han 等[7]發(fā)現(xiàn)蔬菜中總植物甾醇含量為1.1～53.7 mg/100 g，其中最高濃度出現(xiàn)在豌豆、花椰菜、西蘭花和生菜中。在已報道的200 多種植物甾醇中，谷甾醇、豆甾醇、麥膠甾醇最為常見。有研究表明，植物甾醇具有降低膽固醇[8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]等功效，F(xiàn)eng 等[12]指出植物甾醇能調(diào)節(jié)膽固醇、脂肪酸、TG 和BA，從而緩解非酒精性脂肪肝、炎癥性腸病和肥胖癥等不同疾病。由此可見，植物甾醇在疾病防治方面具有重要作用，使其在醫(yī)學、生命科學、食品等領(lǐng)域日益受到重視，具有廣闊的開發(fā)前景。然而植物甾醇結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，國內(nèi)對該領(lǐng)域的研究與開發(fā)較國外相對滯后，用于分析不同類型、形態(tài)植物甾醇的方法尚不完善[13]，尚需深入研究。

甾醇的生理活性可能受其結(jié)構(gòu)的影響[14]。為進一步擴大植物甾醇在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用，對其純度應(yīng)有更高的要求。對不同形態(tài)植物甾醇的分離、純化，定量、定性分析以及結(jié)構(gòu)鑒定，具有重要意義。本研究采用固相萃取法（SPE）分離花菜中4 種結(jié)合狀態(tài)的植物甾醇，用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜 （UPLCTriple-TOF/MS）鑒定其甾醇的種類，分析其結(jié)構(gòu)，為進一步研究花菜及其它蔬菜中植物甾醇提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花菜，當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，熱風干燥后粉碎待用。

異丙醇（特級色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷（特級色譜純）、乙腈（特級色譜純），天津市四友精細化學品有限公司；Silica固相萃取柱（500 mg/3 mL），Phenomenex 公司；Diol固相萃取柱 （500 mg/3 mL），GL Sciences Inc 公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

AY220 型電子天平，日本島津公司；AcquityTM ultra 型超高效液相色譜儀，美國Waters公司；Triple TOF 5600+三重四極桿-高分辨飛行時間質(zhì)譜儀 （配有大氣壓力化學電離源），美國ABSCIEX 公司；752N 紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；RE-2000A 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海研承儀器有限公司；miVac 真空離心濃縮儀，英國GeneVac 公司；GZX-9076MBE 電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CR21N 高速冷凍離心機，日本日立工機株式會社；FS-1200pv 超聲波處理器，上海生析超聲儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制 配制豆甾醇標準溶液：稱取100.0 mg 豆甾醇標樣，加入適量無水乙醇，溶解后定容至100 mL。準確吸取10 mL 并用無水乙醇定容至100 mL，此時的溶液作為標準液。

配制磷硫鐵顯色劑：準確稱取10 g 三氯化鐵（Ⅲ）六水合物，加入適量濃磷酸（85%），溶解后定容至100 mL。吸取1.5 mL 上述溶液于100 mL 棕色容量瓶，用濃硫酸定容。

稱量100.0 mg 豆甾醇標樣，加入適量無水乙醇，溶解后定容至100 mL。使用時取10 mL，用無水乙醇定容至100 mL，此時的溶液作為標準液。分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 標準液于試管，加入無水乙醇補充至4 mL，再加入2 mL 磷硫鐵顯色劑顯色15 min，于520 nm 波長下測定吸光度，以豆甾醇含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程y=0.063x-0.0066，R2=0.9965，表明豆甾醇質(zhì)量濃度在0～62.5 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 花菜中植物甾醇的提取及總甾醇含量的測定 稱取500 mg 花菜粉，各加入2.5 mL 氯仿和甲醇，搖勻，超聲20 min，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，45 ℃旋蒸至干，復(fù)溶于10 mL 無水乙醇。取1 mL 樣品溶液和3 mL 無水乙醇于試管中，按上述方法測其吸光度，得到總甾醇含量。

1.3.3 固相萃取法分離植物甾醇

1.3.3.1 游離甾醇、甾醇酯和?；薮继擒?、甾醇糖苷分離 準確稱取花菜粉1.000 g，加入各5 mL 氯仿和甲醇，提取方法如上所述，45 ℃旋蒸，加1 mL 氯仿復(fù)溶。硅膠柱中加入5 mL 氯仿活化，上樣1 mL，先用氯仿洗脫游離甾醇（FS）和甾醇酯（SE），干燥后，加入1 mL 己烷復(fù)溶；再加入丙酮-異丙醇（體積比1∶1）洗脫酰化甾醇糖苷（ASG）和甾醇糖苷（SG），干燥后，加1 mL 庚烷-異丙醇（體積比95∶5）復(fù)溶。

1.3.3.2 洗脫 硅膠柱中加入5 mL 己烷活化，將

1.3.3.1 節(jié)中的第1 個洗脫組分加入柱內(nèi)，先用己烷-乙醚（體積比99∶1）洗脫SE，再加入己烷-乙醚（體積比85∶15）洗脫FS。

Diol SPE 柱（500 mg，3 mL）加入5 mL 庚烷活化，將1.3.3.1 節(jié)中的第2 個洗脫組分加入柱內(nèi)，庚烷-異丙醇（體積比97∶3）洗柱后，先加入庚烷-異丙醇（體積比92∶8）洗脫ASG，再加入庚烷-異丙醇（體積比85∶15）洗脫SG。

分別用3，4，5，6，7，8 mL 的溶劑按照上述流程洗脫甾醇。

1.3.3.3 各組分甾醇含量的測定 按1.3.2 節(jié)的方法測定吸光度，記錄分析不同體積洗脫液對甾醇洗脫量的影響。

1.3.4 UPLC-Triple-TOF/MS 檢測分析

1.3.4.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent eclipseplus C18 柱 （4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A：90%甲醇，B 相：乙腈-異丙醇（體積比1∶1）；流速：0.6 mL/min；檢測器：紫外可見光；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相梯度洗脫見表1。

表1 液相梯度洗脫條件Table 1 Liquid gradient elution conditions

1.3.4.2 質(zhì)譜條件 掃描方式：正離子模式（AP-CI），一級全掃描，加自動二級掃描；電噴霧電壓：+5.5 kV；掃描范圍：m/z 100～1 000；離子源溫度：600 ℃；輔助氣Gas1 壓力：344.75 kPa；輔助氣Gas2 壓力：344.75 kPa；最大允許誤差：±5 ppm 范圍內(nèi)；去簇電壓（DP）：100 V；聚焦能量：10 V。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

除液質(zhì)分析外，試驗所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用2 次及以上平行試驗，數(shù)據(jù)表示方法為“平均值±標準差”。使用Peakview 軟件進行質(zhì)譜圖分析鑒定，使用Origin 2019 進行數(shù)據(jù)處理及分析，使用Chem-Draw Professional 17 繪制甾醇結(jié)構(gòu)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 花菜中總甾醇含量

甾醇提取液與磷硫鐵試劑顯色反應(yīng)后，在520 nm 紫外光波長下測吸光度，結(jié)果取平均值，總甾醇含量為（5.034±0.097）mg/g，RSD=1.733%。

2.2 SPE 不同體積洗脫液對甾醇洗脫量的影響

由圖1（a，b）可知，SE 洗脫量隨著洗脫液體積增加呈先增加后穩(wěn)定的趨勢，在5～6 mL 內(nèi)，洗脫量顯著增加（P＜0.05），6 mL 后隨著洗脫液體積增加，SE 洗脫量無明顯變化（P＞0.05）；FS 洗脫量在洗脫液體積小于5 mL 時呈下降趨勢，6 mL 時洗脫量顯著增加（P＜0.05），在7 mL 時又下降。通過FS 和SE 圖像對比分析可知，洗脫液體積小于5 mL 時，SE 未完全洗脫，導(dǎo)致FS 洗脫液中SE 的存在。由此可以解釋5 mL 之前FS 洗脫量隨洗脫體積增加而下降，在6 mL 之后SE 洗脫量沒有發(fā)生明顯上升，說明在6 mL 左右SE 已洗脫完全，則可將6 mL 定為SE 的最佳洗脫體積，計算此時SE的洗脫量為（334.69±18.09）μg。而FS 洗脫量在6 mL 時出現(xiàn)一個峰值，可將6 mL 定為FS 的最佳洗脫體積，此時FS 的洗脫量為（695.64±31.50）μg。

由圖1（c，d）可知，ASG 的洗脫量隨著洗脫液體積的增加，在6 mL 處出現(xiàn)最大值，在4～5 mL內(nèi)，洗脫量顯著增加（P＜0.05），洗脫液體積大于6 mL 后，洗脫量差異不顯著（P＜0.05）；SG 的洗脫量在洗脫液體積為3～5 mL 時顯著減少（P＜0.05），5～6 mL 時上升，且之后差異不顯著（P＞0.05）。通過ASG 和SG 圖像對比分析可得，洗脫液體積小于6 mL 時ASG 未完全洗脫，導(dǎo)致SG 中混有ASG，ASG 洗脫量在6 mL 之后變化不大，可認為此時ASG 已洗脫完全，可取6 mL 為其最佳洗脫體積，此時ASG 洗脫量為（1 856.69±38.22）μg。SG 在洗脫液體積為5 mL 時洗脫量最少，5～6 mL 時開始上升，此時應(yīng)是SG 逐步洗脫的表現(xiàn)，在7 mL 后洗脫量基本不變，可將7 mL 定為其最佳洗脫條件，此時SG 洗脫量為（828.66±32.78）μg。

圖1 洗脫液體積對SE（a）、FS（b）、ASG（c）、SG（d）洗脫量的影響Fig.1 Effects of eluent volume on the elution amount of SE （a），F(xiàn)S （b），ASG （c） and SG （d）

2.3 UPLC-Triple-TOF/MS 分析結(jié)果

2.3.1 花菜中植物甾醇總離子流色譜圖及解析 花菜中4 種結(jié)合狀態(tài)的甾醇經(jīng)UPLC-Triple-TOF/MS 分析檢測，總離子流圖見圖2。分析圖中各峰，并結(jié)合文獻中各甾醇二級質(zhì)譜的特點，篩選出豐度較高且可能是甾醇母離子的離子進行檢索，最后通過精確分子質(zhì)量與實測質(zhì)荷比的對比，對誤差范圍在±5 ppm 以內(nèi)的分子式進行篩選。經(jīng)篩選得到4 個游離甾醇峰（圖2a），1～4 分別為豆甾醇、菜油甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇；3 個甾醇酯峰（圖2b），1～3 分別為菜油甾醇亞油酸酯、豆甾醇油酸酯、β-谷甾醇油酸酯。2 個甾醇糖苷峰（圖2c），1～2分別為菜油甾醇葡萄糖苷、β-谷甾醇葡萄糖苷。5個?；薮继擒辗澹▓D2d），1～5 分別為菜油甾醇葡萄糖苷棕櫚油酸酯、菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、豆甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯。

圖2 花菜中甾醇UPLC-Triple-TOF/MS 總離子流色譜圖Fig.2 UPLC-Triple-TOF/MS total ion current chromatogram of phytosterols from cauliflower

2.3.2 游離甾醇（FS）質(zhì)譜解析 FS 各峰具體信息見表2，對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖如圖3所示，分析圖中碎片離子峰，并與相關(guān)文獻比對，得到其結(jié)構(gòu)式。對化合物1 的[M+H-H2O]+離子峰m/z 395.3368 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 121.1012，m/z 147.1163，m/z 161.1325，m/z 175.1474，m/z 257.2260，m/z 297.2565，m/z 353.3215，m/z 379.3372，m/z 395.3668 等碎片離子峰（圖3a），根據(jù)相關(guān)文獻[15]，與豆甾醇裂解規(guī)律相符，因此推斷化合物1為豆甾醇（C29H48O）。Mo 等[16]選擇[M+H-H2O]+的一個豐富的產(chǎn)物離子作為定量劑，除油菜素甾醇和豆甾醇分別從C17 側(cè)鏈上除去84 和98 個質(zhì)量單位形成m/z 297 產(chǎn)物離子外，大多數(shù)片段離子是通過切割甾醇C 環(huán)形成，還檢測到m/z 161 的產(chǎn)物離子，對應(yīng)于油菜素甾醇和豆甾醇的碳環(huán)斷裂。對化合物2 的[M+H-H2O]+離子峰m/z 383.3668 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1017，m/z 133.1011，m/z 147.1165，m/z 161.1325，m/z 173.1325，m/z 215.1796，m/z 243.2097，m/z 287.2738，m/z 383.3668 等碎片離子峰（圖3b），參考相關(guān)文獻[14，16]，其裂解規(guī)律與菜油甾醇一致，因此推斷化合物2為菜油甾醇（C28H48O）。對化合物3 的[M+H-H2O]+離子峰m/z 409.3822 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1015，m/z 121.1013，m/z 137.1319，m/z 149.1321，m/z 163.1476，m/z 175.1484，m/z 245.2257，m/z 259.2412，m/z 353.3205，m/z 409.3822 等碎片離子峰（圖3c），其裂解規(guī)律與羽扇豆醇相符，因此推斷化合物3 為羽扇豆醇（C30H50O）。Khatal 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在APCI 陽離子模式下，羽扇豆醇在m/z 409.5 處有一基峰[M+H-H2O]+，二級質(zhì)譜顯示m/z 137.3 是一個突出的產(chǎn)物離子。對化合物4 的[M+H-H2O]+離子峰m/z 397.3821 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 133.1018，m/z 135.1165，m/z 147.1173，m/z 203.1791，m/z 215.1793，m/z 243.2105，m/z 255.2100，m/z 287.2723，m/z 397.3821 等碎片離子峰（圖3d），其裂解規(guī)律與β-谷甾醇一致[16]，因此推斷化合物4 為β-谷甾醇（C29H50O）。

表2 FS 一級質(zhì)譜圖表Table 2 FS first-order mass spectrometry chart

圖3 FS 各峰二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrogram of each peak of FS

2.3.3 甾醇酯（SE）質(zhì)譜解析 甾醇酯在APCI 正離子模式下形成[M-FA+H]+碎片離子[18]，可通過甾核母離子[M-FA+H]+的質(zhì)荷比，區(qū)分不同甾醇核的酯。對化合物1 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1017，m/z 133.1011，m/z 135.1169，m/z 147.1167，m/z 189.1644，m/z 203.1787，m/z 243.2105，m/z 257.2261，m/z 281.2482，m/z 301.2899，m/z 383.3671，m/z 663.6085 等碎片離子峰（圖4a），m/z 383.3671為菜油甾醇特征峰，m/z 281.2484 為亞油酸（C18H32O2）特征峰，m/z 663.6085 為分子離子峰，根據(jù)相關(guān)文獻[19]，與菜油甾醇亞油酸酯分子質(zhì)量理論值相當，因此推斷化合物1 為菜油甾醇亞油酸酯（C46H78O2）。Rocha 等[20]采用ESI-MS 和串聯(lián)質(zhì)譜對菜籽油中的甾醇酯進行分析，質(zhì)譜結(jié)果顯示SE的銨加化合物（[M+NH4]+）是基峰，串聯(lián)質(zhì)譜顯示了[（M+NH4）-NH3]+（m/z 663.7）片段的形成，特別是甾醇片段離子[（M+NH4）-NH3-FA]+（m/z 383.4）的形成，可鑒定該化合物為18∶2-菜油酯。對化合物2 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 105.0704，m/z 147.1161，m/z 187.1481，m/z 189.1632，m/z 203.1788，m/z 243.2102，m/z 255.2110，m/z 283.2644，m/z 363.3059，m/z 395.3674，m/z 677.6236 等碎片離子峰 （圖4b），m/z 395.3674 為豆甾醇特征峰，m/z 283.2644 為油酸（C18H34O2）特征峰，m/z 677.6236 為分子離子峰，與豆甾醇油酸酯分子質(zhì)量相符，因此推斷化合物2 為豆甾醇油酸酯，分子式為C47H80O2。Tan 等[21]以響應(yīng)性、信噪比和線性度為選擇標準研究植物甾醇酯的最佳特性離子，選擇了m/z 394，m/z 255，m/z 43 作為豆甾醇油酸酯的特征離子。對化合物3 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 161.1331，m/z 175.1490，m/z 189.1631，m/z 203.1786，m/z 257.2258，m/z 261.2564，m/z 283.2622，m/z 315.3060，m/z 355.3364，m/z 397.3824，m/z 679.6389 等碎片離子峰 （圖4c），其中m/z 397.3824 為β-谷甾醇特征峰，m/z 283.2622 為油酸（C18H34O2）特征峰，m/z 679.6389 為分子離子峰，參考相關(guān)文獻[22]，與β-谷甾醇油酸酯分子質(zhì)量相當，因此推斷化合物3 為β-谷甾醇油酸酯（C47H82O2）。

表3 SE 一級質(zhì)譜圖表Table 3 SE first-order mass spectrometry chart

圖4 SE 各峰二級質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectrogram of each peak of SE

2.3.4 甾醇糖苷（SG）質(zhì)譜解析 在SG 的最常見形式中，糖單體（通常是D-吡喃葡萄糖）連接到甾醇的C3 羥基上，SG 可水解生成甾醇[23]。SG 各峰具體信息見表4，為獲得更多結(jié)構(gòu)信息，需對其進行二級質(zhì)譜裂解分析。對化合物1，裂解得到m/z 109.1009，m/z 135.1164，m/z 161.1324，m/z 175.1482，m/z 189.1645，m/z 203.1794，m/z 215.1804，m/z 243.2099，m/z 257.2264，m/z 273.2574，m/z 301.2880，m/z 383.3674，m/z 563.4326 等碎片離子峰（圖5a），與相關(guān)文獻[24-25]比對，甾醇糖苷的甾核母離子為菜油甾醇，m/z 563.4326 為分子離子峰，因此推斷化合物1 為菜油甾醇葡萄糖苷（C34H58O6）。化合物2 的[M+HGlc]+離子峰m/z 397.3832 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得 到m/z 107.0854，m/z 147.1164，m/z 161.132，0，m/z 189.1630，m/z 203.1787，m/z 215.1794，m/z 243.2099，m/z 257.2259，m/z 261.2568，m/z 287.2730，m/z 315.3052，m/z 397.3832，m/z 577.4461 等碎片離子峰（圖5b），結(jié)合相關(guān)文獻[24，26]其裂解規(guī)律與β-谷甾醇相符合，甾醇糖苷的甾核母離子為β-谷甾醇，m/z 577.4461 為分子離子峰，因此推斷化合物2 為β-谷甾醇葡萄糖苷（C35H60O6）。Munger 等[14]對以上3 種甾醇糖苷的研究表明，MS/MS 譜中主要的特征峰為m/z 147 和m/z 161，表示它們的△5 結(jié)構(gòu)，谷甾醇糖苷和菜油甾醇糖苷側(cè)鏈的缺失導(dǎo)致的特征峰為m/z 257，而豆甾醇糖苷的特征峰為m/z 255 表示C22 不飽和側(cè)鏈。豆甾醇葡糖苷的進一步特征是m/z 297 的顯性出現(xiàn)，這是區(qū)分不飽和側(cè)鏈甾醇和飽和側(cè)鏈甾醇的另一個特征。

表4 SG 一級質(zhì)譜圖表Table 4 SG first-order mass spectrometry chart

圖5 SG 各峰二級質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrogram of each peak of SG

2.3.5 ?；薮继擒眨ˋSG）質(zhì)譜解析 D-葡萄糖單體通過糖苷鍵與甾醇體中C3 的羥基結(jié)合，糖部分的C6 羥基進一步被脂肪酸?；?，從而形成ASG。ASG 各峰具體信息見表5，對化合物1 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1010，m/z 135.1174，m/z 161.1331，m/z 175.1473，m/z 243.2115，m/z 257.2262，m/z 273.2581，m/z 301.2888，m/z 383.3673，m/z 799.6435 等碎片離子峰（圖6a），m/z 383.3673 為[M+H-Glc-FA]+離子峰，甾核為菜油甾醇，m/z 799.6435 為分子離子峰[M+H]+，因此推斷化合物1 為菜油甾醇葡萄糖苷棕櫚油酸酯（C50H86O7）。Usuki 等[27]在對發(fā)芽糙米麩皮中?；薮继擒战Y(jié)構(gòu)分析中，m/z 818.3 的MS/MS 譜圖中，前體離子（m/z 818.3）為[棕櫚?；擞王?基 β-葡萄糖苷+NH4]+，m/z 401.2 和m/z 383.2 分別為[棕櫚?；?葡萄糖-H2O+H]+和[菜油甾醇-H2O+H]+。對化合物2 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1012，m/z 135.1167，m/z 161.1319，m/z 189.1643，m/z 203.1787，m/z 215.1792，m/z 273.2573，m/z 383.3670，m/z 855.7095等碎片離子峰 （圖6b），m/z 383.3670 為[M+HGlc-FA]+離子峰，裂解規(guī)律同化合物1，甾核為菜油甾醇，m/z 855.7095 為分子離子峰[M+H]+，因此推斷化合物2 為菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯（C54H94O7）。對化合物3 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 107.0852，m/z 147.1166，m/z 161.1318，m/z 173.1323，m/z 187.1747，m/z 201.1640，m/z 257.2253，m/z 273.2578，m/z 395.3676，m/z 835.6471等碎片離子峰 （圖6c），m/z 395.3676 為[M+HGlc-FA]+離子峰，甾核為豆甾醇，m/z 835.6471 為分子離子峰[M+H]+，因此推斷化合物3 為豆甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯（C53H86O7）。對化合物4 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1016，m/z 135.1166，m/z 147.1169，m/z 189.1644，m/z 203.1784，m/z 257.2265，m/z 287.2744，m/z 315.3036，m/z 397.3837，m/z 869.7251 等碎片離子峰（圖6d），m/z 397.3837 為[M+H-Glc-FA]+離子峰，其裂解規(guī)律與β-谷甾醇相符，甾核為β-谷甾醇，m/z 869.7251為分子離子峰[M+H]+，因此推斷化合物4 為β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯（C55H96O7）。對化合物5 進行二級質(zhì)譜裂解分析，得到m/z 109.1015，m/z 133.1007，m/z 147.1165，m/z 161.1323，m/z 203.1795，m/z 215.1785，m/z 355.3371，m/z 397.3829，m/z 837.6576 等碎片離子峰（圖6e），m/z 397.3829 為

表5 ASG 一級質(zhì)譜圖表Table 5 ASG first-order mass spectrometry chart

圖6 ASG 各峰二級質(zhì)譜圖Fig.6 Secondary mass spectrogram of each peak of ASG

[M+H-Glc-FA]+離子峰，甾核為β-谷甾醇，m/z 837.6576 為分子離子峰[M+H]+，因此推斷化合物5為β-谷甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯 （C53H88O7）。Yamauchi 等[28]采用LC-MS 法從紅甜椒中檢測出β-谷甾醇基（6'O-亞麻酸?；┢咸烟擒?，得到如下質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z 859（[M+Na]+），m/z 411（[C29H47O]+），m/z 397（[C29H49]+），m/z 215（[C16H23]+），m/z 261（[R]+），[R]+為脂酰部離子。其裂解規(guī)律與化合物5 基本符合，m/z 859（[M+Na]+-Na+H）即為m/z 837（[M+H]+）。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取法（SPE）分離花菜中4種結(jié)合狀態(tài)的植物甾醇，再用UPLC-Triple-TOF/MS 法分析鑒定其甾醇的種類與結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，通過紫外分光光度法粗測花菜中甾醇含量為（5.034±0.097）mg/g。固相萃取法分離純化4 種結(jié)合狀態(tài)的甾醇最佳洗脫條件為6 mL 己烷-乙醚（99∶1）洗脫SE，6 mL 己烷-乙醚（85∶15）洗脫FS，6 mL 庚烷-異丙醇（92∶8）洗脫ASG，7 mL 庚烷-異丙醇（85∶15）洗脫SG。在最佳洗脫條件下得到的甾醇的洗脫量分別為SE：（334.69±18.09）μg，F(xiàn)S：（695.64±31.50）μg，ASG：（1856.69±38.22）μg，SG：（828.66±32.78）μg。花菜中主要含有的游離甾醇（FS）有豆甾醇、菜油甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇，含有的甾醇酯（SE）有菜油甾醇亞油酸酯、豆甾醇油酸酯、β-谷甾醇油酸酯，含有的甾醇糖苷（SG）有菜油甾醇葡萄糖苷、β-谷甾醇葡萄糖苷，含有的?；薮继擒眨ˋSG）有菜油甾醇葡萄糖苷棕櫚油酸酯、菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、豆甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷亞麻酸酯。