HPLC法測定復方桐葉燒傷油中芝麻素的含量*

覃愛桃，楊德泉，韓湘云，徐玉輝

(1.湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000；2. 湘西宏成制藥有限責任公司，湖南 吉首 416000)

復方桐葉燒傷油，是在土家傳統(tǒng)燙瘡藥的基礎上研制的治療燒燙傷藥物，是第一個獲“國藥準字號”的治療燒燙傷土家藥品[1]，載于《國家藥品標準新藥轉正標準》第77冊[2]，復方桐葉燒傷油主要由桐葉和麻油制成，功效為清熱解毒、消腫止痛、祛腐生肌，臨床上常用于治療面積小于29%的燒燙傷.標準中含量項為薄層掃描法檢測熊果酸的含量.楊德泉等[3]用HPLC法，建立了復方桐葉燒傷油中熊果酸和齊墩果酸含量的測定方法.麻油是芝麻科植物芝麻(SesamumindicumL.)的成熟種子通過壓榨法獲得的脂肪油，主要含有不飽和脂肪酸、蛋白質、芝麻素、芝麻林素、甲氧芝麻素、芝麻明酚、羥基芝麻素、芝麻酚等成分[4-10]，其中C18∶1，C18∶2，C18∶3等不飽和脂肪酸含量達85%左右，芝麻素含量也較豐富，一般在0.1%～1%[11].楊德泉等[12]用薄層色譜方法定性鑒別了芝麻油中的芝麻素.由于市場上麻油摻偽情況時有發(fā)生[13]，檢驗檢測技術人員針對麻油摻偽進行了定性定量鑒別的研究，方法有氣相色譜法、紫外分光光度法、化學顯色法、指紋圖譜相似度法等[14-17].麻油是本制劑的處方組成成分，所以對復方桐葉燒油制劑建立麻油的定量控制，具有十分重要的意義.目前尚未見復方桐葉燒傷油的麻油定量控制方法，本研究為達到制劑中麻油質量的定量可控目的，擬參考有關文獻方法[18-22]，建立高效液相色譜法(HPLC)測定復方桐葉燒傷油中芝麻素含量，以期為芝麻素含量的檢測和質量控制提供參考.

1 儀器、試藥和樣品

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，色譜柱YMC C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm，編號HS12S05-2546WT，YMC公司)；安捷倫液相色譜儀Agilent 1260(Agilent科技(中國)有限公司)，色譜柱JADE-PAK AF-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，P/N:037-2546，廣州太瑋生物科技有限公司)；電子天平AB135-S(METTLER TOLEDO，精度為十萬分之一)，電子天平ML304T(METTLER TOLEDO，精度為萬分之一)；超聲波清洗器(型號：KQ-3008，昆山美美超聲儀器有限公司)；多試管渦旋混合器(Multi-Tube Vortexer UMV-2)；離心機(Centrifuge 5810R,Eppendorf AG)；臥式轉換冷藏/冷凍箱(型號：BC/BD-405D，合肥晶弘電器有限公司).

1.2 試藥和樣品

芝麻素對照品(批號：110742-201823，質量分數(shù)以99.9%計)購于中國食品藥品檢定研究院，使用前減壓干燥12 h，供含量測定用.甲醇的純度為色譜純，水為純凈水.12批復方桐葉燒傷油樣品由湘西宏成制藥有限責任公司提供.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：JADE-PAK AF-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(體積比80∶20)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：287 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL.

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芝麻素對照品20.18 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，作為芝麻素的標準儲備溶液，質量濃度為0.403 6 g/L.

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品0.5 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混勻5 min，超聲(200 W，40 kHz)5 min，5 000 r/min條件下離心5 min，取上層甲醇溶液；下層溶液另加入20 mL甲醇，重復前面的操作步驟；下層溶液再加入10 mL甲醇，重復前面的操作步驟.將3次上層甲醇溶液合并到50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，置于臥式轉換冷藏/冷凍箱-18 ℃下冷凍30 min，取出，過0.22 μm濾膜，濾液即為供試品溶液.

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取2.2節(jié)下溶液，按2.1節(jié)色譜條件測定，記錄色譜峰的理論板數(shù)，芝麻素是6 496，分離度為3.23，符合要求.取2.3節(jié)下溶液測定，供試品色譜中，在與對照品色譜峰相應位置上檢出色譜峰.對照品、供試品色譜圖見圖1、圖2.

圖1 芝麻素對照品色譜圖Fig. 1 Chromatogram of Sesamin Reference

圖2 復方桐葉燒傷油中芝麻素色譜圖Fig. 2 Chromatogram of Sesamin in Compound Tongye Burn Oil

2.5 線性關系考察

精密吸取2.2節(jié)下標準儲備溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含芝麻素0，0.020 18，0.040 36，0.080 72，0.121 1，0.201 8，0.403 6 g/L的溶液，即得系列對照品溶液.

分別精密吸取上述系列對照品溶液10 μL，按2.1節(jié)下色譜條件進樣分析，以進樣量X(單位：g/L)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸處理，得芝麻素的回歸方程：Y=15 562X+9.37，R2=1.結果表明，芝麻素在0.020 18～0.403 6 g/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，見圖3.

圖3 線性關系考察圖Fig. 3 Linear Relationship Investigation Diagram

2.6 精密度試驗

取樣品批號為20210801的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得芝麻素峰面積的RSD為0.58%.

2.7 重復性試驗

按2.3節(jié)方法，取樣品(批號：20201105)6份，制備成供試液，分別按樣品測定方法測定.測得6份樣品的芝麻素含量分別為8.705 5，8.754 0，8.749 5，8.760 7，8.774 6，8.706 2 mg/g，平均含量為8.741 7 mg/g，RSD為0.33%.

2.8 耐用性試驗

取20191002，20210703，20201105三批樣品分別用液相色譜儀(1)Agilent 1260Ⅱ，色譜柱Agilent C18(250 mm×4.6 mm×5 μm，編號 588905-902，Agilent公司)和(2)LC-20AT，色譜柱YMC C18(250 mm×4.6 mm×5 μm，編號HS12S05-2546WT，YMC公司)測定，理論塔板數(shù)按芝麻素計，均能達到5 000以上，芝麻素含量測定值的RSD分別為1.2%，0.3%，1.1%.結果表明，本方法耐用性良好.

2.9 穩(wěn)定性試驗

分別取放置0，1，2，4，8，12，24 h后的供試品溶液(批號：20210901)，進樣測定芝麻素的峰面積，結果的平均RSD為0.047%，表明供試品溶液中的芝麻素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.10 加樣回收率試驗

稱取0.25 g樣品(批號：20201105，已測得0.25 g樣品中含芝麻素2.185 4 mg)6份，分別按已測得含量的80%，100%，120%，對應加入芝麻素對照品1.703 5，2.129 4，2.555 2 mg，按供試液制備方法制備成為供試液，按2.1節(jié)色譜條件進行測定，結果顯示：在80%加樣限度下，芝麻素平均加樣回收率為105.83%，RSD為0.33%；在100%加樣限度下，芝麻素平均加樣回收率為102.84%，RSD為0.53%；在120%加樣限度下，芝麻素平均加樣回收率為100.98%，RSD為1.5%(表1).

表1 芝麻素加樣回收試驗結果

2.11 樣品中芝麻素含量的測定

精密稱取樣品0.5 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混勻5 min，超聲5 min，5 000 r/min條件下離心5 min，取上層甲醇溶液；下層溶液另加入20 mL甲醇，重復前面的操作步驟；下層溶液再加入10 mL甲醇，重復前面的操作步驟.將3次上層甲醇溶液合并到50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，置于臥式轉換冷藏/冷凍箱-18 ℃下冷凍 30 min，取出，過0.22 μm濾膜，濾液即為供試液.按2.1節(jié)色譜條件進樣檢測，測定芝麻素的峰面積，用回歸方程計算芝麻素的含量，12批樣品含量測定結果見表2.

表2 復方桐葉燒傷油中芝麻素的含量

3 討論

復方桐葉燒傷油為油劑，含麻油.麻油中除了含有芝麻素、芝麻林素等木脂素成分外，還含有甘油酯等雜質.劉春梅等[23]認為，芝麻木脂素的分析檢測方法以高效液相色譜法應用最為廣泛，其樣品的前處理方法為溶劑提取法，操作簡單、應用廣.盧躍鵬等[18]采用甲醇提取芝麻油中的芝麻素和芝麻林素，將提取液冷凍除去甘油酯等雜質后過膜上機測定，方法前處理簡單、分離效果好、結果準確，并且具有可有效除去麻油中甘油酯等雜質的優(yōu)點.本研究結合文獻方法，采用甲醇為提取溶劑，以200 W/40 kHz超聲條件提取，經(jīng)渦旋混勻→超聲→離心提取處理后，將所得甲醇提取液定容，置于臥式轉換冷藏/冷凍箱-18 ℃下冷凍30 min除去甘油酯等雜質，取出，過0.22 μm濾膜，制備供試品溶液.HPLC色譜圖顯示，在芝麻素峰部位無雜質干擾，芝麻素與雜質的色譜峰分離效果良好.

麻油可食藥兩用，因市場價格較高，摻假現(xiàn)象頻出[24-25].本研究將復方桐葉燒傷油的處方組分麻油的主要成分芝麻素作為控制含量的指標性成分，進一步完善了復方桐葉燒傷油的定量質量控制手段，對全面保障產(chǎn)品質量具有重要的實際意義.

4 結論

本研究建立了HPLC法測定復方桐葉燒傷油中芝麻素含量，此方法的線性關系、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率、耐用性均良好，表明方法可行.此外，應用HPLC法可將復方桐葉燒傷油中芝麻素與其他成分完全分離，HPLC法可用于復方桐葉燒傷油中芝麻素含量檢測和質量控制.