何 旭 胡銀山 徐孫秋 楊 昆 馬春蓉
川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 四川省南充市中心醫(yī)院血液內(nèi)科,四川南充 637000
急性白血病是造血干細胞的惡性克隆性疾病,急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是成人急性白血病常見類型之一,占比達20%~30%,盡管近年來AML 診治取得一定進展,但長期生存率僅為20%~40%[1]。近年來越來越多的研究證實,生物體內(nèi)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微RNA(microRNA,miRNA)等參與AML 發(fā)生發(fā)展[2-3]。lncRNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA,研究報道,lncRNA-MALAT-1在頜下腺腫瘤、皮膚癌等惡性腫瘤中異常表達,與腫瘤細胞惡性進展有關(guān)[4-5]。miR-143 是一種高度保守的miRNA,miR-143在甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中異常表達,也與腫瘤細胞惡性進展有關(guān)[6-7]。本研究就通過檢測AML患者血清中l(wèi)ncRNA-MALAT-1、miR-143 的表達,分析二者與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。
選取2017 年1 月至2019 年4 月四川省南充市中心醫(yī)院(以下簡稱“我院”)收治的87 例AML 患者為AML 組,其中男47 例,女40 例;年齡18~84 歲,平均(57.14±8.33)歲;血紅蛋白:51 例≥80 g/L,36 例<80 g/L;白細胞計數(shù):42 例≥30×109/L,45 例<30×109/L;血小板計數(shù):35 例≥50×109/L,52 例<50×109/L;骨髓原始細胞比率:51 例≥70%,36 例<70%;髓外病變14 例;FAB 分型:M1型8 例,M2型39 例,M4型8 例,M5型27 例,M6型5 例;預(yù)后危險分層[8]:高危10 例、中危45 例,低危32 例。另選取32 名同期于我院體檢的健康者為對照組,其中男17 名,女15 名;年齡18~81 歲,平均(56.57±7.19)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20170214)。
納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查確診為AML,符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血?。┲袊\療指南(2011 年版)》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn);②初次確診;③臨床資料齊全;④患者及家屬知情并簽署同意書。
排除標(biāo)準(zhǔn):①合并骨髓增生異常綜合征;②合并其他部位惡性腫瘤;③年齡<18 歲;④全身性感染性疾??;⑤不能接受隨訪;⑥合并自身免疫性疾?。虎呒毙栽缬琢<毎籽。虎嗳朐呵敖邮苓^抗腫瘤治療。
收集AML 組入院時和對照組體檢時靜脈血3 ml,1 500 g 離心15 min 后分離血清,Trizol 法提取血清總RNA,TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司,編號:RR420A-1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒(北京百邁客生物科技有限公司,編號:RK02001)說明書進行PCR 擴增,引物設(shè)計合成由廣州銳博生物技術(shù)有限公司完成:lncRNA-MALAT-1,正向引物5’-GCCTGGAAGCTGAAAAACGG-3’,反向引物5’-TGGAAAACGCCTCAATCCCA-3’;內(nèi)參GADPH 正向引物5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’,反向引物5’-GTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3’。miR-143 正向引物5’-AGTGCGTGTCGTGGTGT-3’,反向引物5’-GCCTGAGATGAAGCACGTG-3’;內(nèi)參U6 正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’,反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。PCR 反應(yīng)體系共10 μl:cDNA 1 μl,正反向引物各0.5 μl,SYBR Green Master Mix 3 μl,ddH2O 5 μl;反應(yīng)條件:95℃90 s,95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s,循環(huán)40 次后進行熔融曲線分析,2-ΔΔCt法計算血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 相對表達量。
AML 患者入院后參考《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢<毎籽。┲袊\療指南(2011 年版)》[9]接受化療。患者出院后通過門診或電話隨訪3 年。
采用SPSS 28.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組內(nèi)比較采用配對t檢驗或F 檢驗,事后多重比較SNK-q 檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示,比較采用χ2檢驗;Pearson 相關(guān)系數(shù)分析AML組血清lncRNA-MALAT-1與miR-143表達的相關(guān)性;Kaplan-Meier 法繪制AML 患者生存曲線,組間生存率Log-rank χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
AML 組血清lncRNA-MALAT-1 為(2.12±0.56),高于對照組的(1.10±0.24),miR-143 為(1.01±0.22),低于對照組的(1.59±0.36),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.715、8.610,P<0.001)。
AML 組血清lncRNA-MAL AT-1 與miR-143 表達呈負相關(guān)(r=-0.709,P<0.001)。
不同白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞比率、預(yù)后危險分層AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同性別、年齡、血紅蛋白、血小板計數(shù)、髓外病變、FAB 分型AML患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達與臨床特征的關(guān)系()
表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達與臨床特征的關(guān)系()
注 與低危比較,aP<0.05;與中危比較,bP<0.05。AMI:急性髓系白血?。籰ncRNA-MALAT-1:長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1;miRNA:微RNA
87 例AML 患者隨訪4~36 個月,中位隨訪26 個月,失訪6 例,死亡39 例,3 年總生存率為55.17%(48/87)。根據(jù)血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達均值分為lncRNA-MALAT-1 高表達組(≥2.12,45 例)、miR-143高表達組(≥1.01,43 例)和lncRNA-MALAT-1 低表達組(<2.12,42 例)、miR-143 低表達組(<1.01,44 例)。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示,lncRNA-MALAT-1 高表達組3 年總生存率為40.00%(18/45),低于lncRNA-MALAT-1 低表達組的71.43%(30/42);miR-143 高表達組3 年總生存率為67.44%(29/43),高于miR-143 低表達組的43.18%(19/44),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank χ2=10.295、7.338,P=0.001、0.007)。見圖1。
圖1 不同血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達AML 患者Kaplan-Meier 生存曲線
AML 是起源于造血干細胞的惡性腫瘤,由造血干細胞或祖細胞中特定細胞轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳、點突變、遺傳突變等變化轉(zhuǎn)變形成[10-11]。目前國際上對AML 已有較統(tǒng)一的系統(tǒng)治療方案,完全緩解率可達70%~90%,但仍有20%的患者難以達到完全緩解,且大多AML 患者完全緩解后可再次復(fù)發(fā),發(fā)展為復(fù)發(fā)性難治性AML[12-13]。因此還需進一步深入探索AML 相關(guān)調(diào)控機制。
LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本>200 個核苷酸的非編碼RNA,能直接參與基因調(diào)控,也能通過海綿miRNA 間接調(diào)節(jié)miRNA 相關(guān)靶基因表達[14]。lncRNA-MALAT-1定位于人染色體11q13.1,最初于非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn),因此多數(shù)學(xué)者致力于研究其在不同腫瘤中的作用[15]。Ferri 等[16]研究報道,lncRNA-MALAT-1 能海綿miR-423-5p 促進前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。阿小英等[17]研究報道,lncRNA-MALAT-1 能海綿miR-124-3p上調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 促進宮頸癌細胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示,AML 組血清lncRNAMALAT-1 高表達,且不同白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞比率、預(yù)后危險分層的AML 患者血清miR-143 表達存在差異,提示lncRNA-MALAT-1 高表達參與了AML 進展。lncRNA-MALAT-1 在AML 中高表達可能與轉(zhuǎn)錄過程中Sp1 通過結(jié)合啟動子激活和促進lncRNA-MALAT-1轉(zhuǎn)錄有關(guān)[18]。隨著lncRNA-MALAT-1表達上調(diào),能通過上調(diào)C-X-C 基序趨化因子受體4表達促進AML 細胞增殖、遷移和抑制凋亡[19]。同時lncRNA-MALAT-1 表達上調(diào)也能通過與上皮轉(zhuǎn)化生長因子β 相互作用誘導(dǎo)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進腫瘤進展[15]。
miR-143 定位于人染色體5q32,在心臟、骨骼、血管等多種組織細胞中均有表達,最初研究局限于其在心腦血管和炎癥中的作用,近年研究發(fā)現(xiàn),miR-143還參與腫瘤相關(guān)過程[20-21]。Xu 等[22]研究報道,miR-143能靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1α 相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1通路,抑制乳腺癌細胞增殖和遷移。Han 等[23]研究報道,miR-143 能靶向DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3α 降低卵巢癌細胞對順鉑耐藥性,促進卵巢癌細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,AML 組血清miR-143 低表達,且不同白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞比率、預(yù)后危險分層的AML 患者血清miR-143 表達存在差異,提示miR-143 低表達參與了AML 進展。miR-143 在AML 中低表達可能與miR-143 啟動子甲基化有關(guān)[24]。同時miR-143 低表達能通過上調(diào)己糖激酶2 促進AML 細胞糖酵解,通過增強AML 細胞能量代謝促進其遷移和侵襲[25]。進一步分析發(fā)現(xiàn),AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 與miR-143 表達呈負相關(guān),說明二者可能共同參與AML 進展。黃勁龍等[26]通過雙熒光素酶報告實驗證實,過表達lncRNA-MALAT-1 能抑制miR-143 表達,與AML 細胞增殖和凋亡抑制相關(guān)。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示,與lncRNA-MALAT-1 高表達和miR-143 低表達相比,lncRNA-MALAT-1 低表達與miR-143 高表達的AML 患者3 年總生存率升高,提 示lncRNA-MALAT-1、miR-143 與AML 患者預(yù)后密切相關(guān)。
綜上所述,AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 高表達和miR-143 低表達,與白細胞計數(shù)、骨髓原始細胞比率、預(yù)后危險分層和預(yù)后有關(guān)。但本研究結(jié)果還需更多樣本量和更長的隨訪時間進一步證實,并進一步驗證lncRNA-MALAT-1、miR-143 參與AML 進展的機制。