俞田田 洪麗華 楊東見 范建霞

人類生殖是哺乳動物物種中最低效的，近15.3%的妊娠會發(fā)生自然流產(chǎn)[1]。妊娠流產(chǎn)相關(guān)文獻報道，孕12周前即妊娠早期發(fā)生流產(chǎn)的概率較高[1-2]。早期妊娠丟失（early pregnancy loss,EPL）是孕期常見的并發(fā)癥之一，是一個多因素參與的過程，其發(fā)病機制目前仍不明確，常規(guī)產(chǎn)前檢測無法預(yù)測。研究EPL病因、病理生理機制、預(yù)防自然流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局有重要意義。Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一種促細胞凋亡的蛋白酶[3]。近年來發(fā)現(xiàn)的Caspase-10是一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的凋亡蛋白酶，Park等[4]研究指出Caspase-10極有可能是細胞凋亡的內(nèi)源性啟動分子。Caspase-10的功能異常與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系[5-8]，但其在EPL中的相關(guān)研究報道不多。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，采用miRNAs array芯片檢測EPL患者蛻膜組織中的差異表達miRNAs，通過生物信息學方法預(yù)測出3個下調(diào)miRNAs（miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p）同時靶向Caspase-10。基于此，本研究對Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中進行Western blot和免疫組化實驗驗證，以期為進一步研究EPL的病因和機制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020年10至12月在上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院計劃生育門診手術(shù)室行早孕人工流產(chǎn)手術(shù)的患者40例，收集廢棄的流產(chǎn)蛻膜組織。患者平均年齡28.7歲，均為孕6～8周。其中EPL接受人工流產(chǎn)手術(shù)者20例，為EPL組；正常早孕要求終止妊娠行人工流產(chǎn)者20例，為對照組。EPL組納入標準：（1）20～40歲健康女性，此次早孕B超檢查提示宮腔內(nèi)未見孕囊或未見胎心搏動；（2）平素月經(jīng)規(guī)律，排除此次早孕期藥物保胎治療的患者；（3）排除復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者；（4）染色體芯片檢查排除此次難免流產(chǎn)由絨毛染色體異常引起；（5）排除因生殖道畸形、自身免疫系統(tǒng)疾病、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的流產(chǎn)；（6）排除吸煙酗酒史。對照組納入標準：（1）20～40歲健康女性，此次早孕B超檢查提示宮腔內(nèi)見孕囊、胚芽及胎心搏動；（2）平素月經(jīng)規(guī)律，無重大疾病史、自身免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病或激素藥物服用史；（3）本次妊娠無先兆流產(chǎn)癥狀；（4）排除吸煙酗酒史。EPL組患者年齡（28.75±0.90）歲，孕齡（45.55±1.14）d；對照組患者年齡（28.60±0.70）歲，孕齡（47.00±1.11）d。本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準，標本的獲取經(jīng)患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 miRNAs array芯片檢測和靶基因預(yù)測 具體方法參照已發(fā)表文獻[9]，檢測EPL患者蛻膜組織中的差異表達miRNAs，并通過生物信息學方法預(yù)測靶基因。

1.2.2 蛻膜組織Caspase-10蛋白表達定量檢測

1.2.2.1 主要試劑 兔抗人Caspase-10多克隆抗體（中國Proteintech公司，貨號：14311-1-AP）;鼠抗人βctin單克隆抗體（中國Proteintech公司，貨號：66009-1-Ig）；山羊抗鼠IgG（H+L）二抗（美國Invitrogen公司，貨號：C31430100）；山羊抗免IgG（H+L）二抗（美國Invitro‐gen公司，貨號：C31460100）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司，貨號：23227）；PVDF膜（美國Millipore公司，貨號：IPVH00010）；ECL顯色試劑盒（美國Pierce公司，貨號：32132）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9018）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：PV-9001）。

1.2.2.2 Western blot法定量檢測蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平

1.2.2.2.1 組織蛋白質(zhì)提取 蛻膜組織用PBS沖洗，加入含1%蛋白酶抑制劑（phenylmethylsulphonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰浴中充分勻漿，冰上靜置40 min。15 000 r/min，4℃離心30 min。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，凍存于-80℃環(huán)境中備用。蛋白質(zhì)含量的測定采用BCA法。

1.2.2.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳（so‐dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 按照蛋白裂解液說明書抽提、濃縮得到組織的蛋白樣本，采用SDS-PAGE，蛋白樣本電泳后，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，加入封閉液，室溫、水平搖床上孵育l h；加入Caspase-10抗體（1∶1 000，用封閉液稀釋）、βactin抗體（1∶5 000,用封閉液稀釋），4℃過夜，分別加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫避光孵育1 h后，增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）法顯影，細胞蛋白條帶的灰度值用Image J圖像分析軟件分析，以Caspase-10蛋白與β-actin的灰度值的比值作為Cas‐pase-10蛋白的表達水平。

1.2.3 免疫組化法半定量檢測蛻膜組織Caspase-10蛋白表達情況

1.2.3.1 免疫組化步驟 蛻膜組織標本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋。切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說明書進行檸檬酸鹽（1∶100稀釋，pH=6）高溫高壓修復(fù)；3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶；5%山羊血清工作液封閉。滴加適當濃度的一抗工作液（1∶100），4℃冰箱孵育過夜；按試劑盒說明書辣根過氧化物酶標記二抗（1∶100,5%山羊血清工作液）；滴加DAB顯色。對照設(shè)計：以非免疫正常山羊血清代替一抗作為陰性對照。

1.2.3.2 免疫組化分析 采用組織學積分H-score方法進行半定量分析，采用雙盲法對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)細胞染色強度分為4級。（1）陰性：細胞無染色或呈均勻一致淺黃色，與背景一致，計0分。（2）弱陽性：細胞顯色為淡黃色顆粒，明顯高于背景，計1分。（3）中度陽性：細胞顯色為棕黃色，計2分。（4）強陽性：細胞顯色為棕褐色，計3分。計算每張切片的平均染色強度得分（H-score），計算公式H-score=∑（I×F）。I為染色強度，F(xiàn)為每一強度級別的細胞數(shù)所占百分比。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25,P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)差異表達miRNAs預(yù)測靶基因Caspase-10的功能分析 本實驗根據(jù)前期基因芯片結(jié)果，結(jié)合基因功能富集（gene ontology,GO）分析和靶基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析，構(gòu)建一個EPL患者蛻膜組織中與凋亡功能相關(guān)的miRNA與相應(yīng)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，3個下調(diào)差異表達miRNAs，包括miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p同時靶向 Caspase-10。通過DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov）靶基因功能分析網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)Caspase-10對細胞凋亡的調(diào)控是通過細胞內(nèi)吞、誘導(dǎo)細胞外信號、蛋白水解、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、T細胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、Wnt信號通路、Hedgehog信號通路等經(jīng)典信號通路參與慢性粒細胞性白血病、腎細胞癌、小細胞肺癌等多種癌癥及凋亡的發(fā)生、發(fā)展。GO分析結(jié)果見表1、圖1；KEGG分析結(jié)果見表2、圖2。

圖1 下調(diào)差異表達miRNA靶基因Caspase-10可能參與的生物學過程GO分析

圖2 下調(diào)差異表達miRNA靶基因Caspase-10可能參與的信號通路KEGG分析

表1 下調(diào)差異表達miRNA靶基因Caspase-10的GO分析結(jié)果

表2 下調(diào)差異表達miRNA靶基因Caspase-10的KEGG分析結(jié)果

2.2 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平比較 EPL組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 EPL組和對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達電泳圖

圖4 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平的點狀箱式分析圖

2.3 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達情況比較 EPL組患者蛻膜組織Caspase-10在蛻膜細胞、腺上皮和腔上皮細胞中強陽性表達，并且主要表達在細胞的胞質(zhì)中，而在對照組中弱陽性表達。通過H-score統(tǒng)計學分析得出，EPL組患者蛻膜組織Caspase-10表達強度較對照組高（P＜0.05），見圖5（插頁）、6。

圖5 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達鏡下所見（免疫組化染色，×400）

圖6 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達強度點狀箱式分析圖

3 討論

近年來，越來越多研究證實細胞凋亡在妊娠相關(guān)疾病中起重要調(diào)控作用[10-11]，在人類子宮內(nèi)膜生理或病理性的調(diào)節(jié)及在胎盤發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用[12-13]。研究者發(fā)現(xiàn)在EPL患者蛻膜組織中同樣存在細胞凋亡現(xiàn)象[14-16]，其發(fā)生機制被認為可能是各種炎癥因子等的作用下，蛻膜組織長期處于缺氧狀態(tài)，這種缺氧狀態(tài)可以促發(fā)多種細胞因子和蛋白酶等發(fā)生失代償性的異常表達，通過泛素-蛋白酶體通路降解，最終引發(fā)細胞凋亡，導(dǎo)致流產(chǎn)。

Caspases是一類半胱氨酸蛋白酶家族，凋亡Cas‐pases主要分為凋亡起始Caspases（Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10）和凋亡效應(yīng) Caspases（Cas‐pase-3、Caspase-6、Caspase-7）。有研究預(yù)測靶基因Caspase-10是 Caspase-3的引發(fā)物，Caspase-3是Cas‐pase-10的執(zhí)行蛋白[12]，Caspase-3需要通過Caspase-10的激活后啟動細胞凋亡。筆者團隊以往研究發(fā)現(xiàn)，在EPL患者蛻膜組織中，miR-378a-3p的下調(diào)增加Cas‐pase-3的表達，導(dǎo)致蛻膜組織細胞凋亡增加，影響了蛻膜細胞的功能，從而參與EPL的發(fā)生[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)在早期自然流產(chǎn)患者的絨毛和蛻膜組織中均存在缺氧狀況，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的修復(fù)功能失代償，從而形成泛素化凋亡，特別是凋亡蛋白酶Cas‐pase-1、Caspase-4、Caspase-12發(fā)揮重要作用[14,17]。

Caspase-10為起始凋亡蛋白酶一種，因其在小鼠內(nèi)缺乏，限制了科學家們對它的研究，至今鮮有Caspase-10在EPL中相關(guān)的研究報道。本實驗筆者團隊通過前期miRNAs array芯片篩查出來的下調(diào)差異表達miRNA與細胞凋亡相關(guān)的靶基因中發(fā)現(xiàn)，miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p同時靶向凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-10。且通過進一步發(fā)現(xiàn)，與選擇性流產(chǎn)患者蛻膜組織相比，Capasae-10蛋白在EPL患者蛻膜組織中表達明顯上調(diào)。同樣地，在免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)，EPL患者蛻膜組織中蛻膜細胞、腺上皮及腔上皮細胞中有較多的棕色或黃色Caspase-10表達顆粒，但在選擇性流產(chǎn)蛻膜組織中棕色或黃色表達顆粒不明顯，并且通過H-score統(tǒng)計學分析得出Caspase-10表達在EPL患者蛻膜組織中表達強度增高，進一步驗證了前期芯片結(jié)果。

本研究結(jié)果表明Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中異常上調(diào)表達，提示下調(diào)差異表達miRNAs（miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p）可能通過直接靶向Caspase-10，導(dǎo)致蛻膜細胞凋亡，繼而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。

綜上所述，本研究成功建立并預(yù)測EPL患者蛻膜組織中與凋亡蛋白相關(guān)的miRNA表達譜，并且靶向到凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-10，同時對Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中進行Westren blot實驗和免疫組化實驗驗證。這一結(jié)果有望為EPL的發(fā)病機制研究提供參考。