遼寧省玉米品種種質(zhì)SSR分子多樣性分析

朱志成

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心省種業(yè)發(fā)展中心,遼寧 沈陽 110034)

玉米是遼寧省第1大作物，優(yōu)質(zhì)玉米品種是實(shí)現(xiàn)玉米產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效的重要基礎(chǔ)，也是產(chǎn)前技術(shù)的核心，種質(zhì)基礎(chǔ)是選育玉米新品種的根基，正確分析與評價(jià)遼寧省品種種質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)新和突破現(xiàn)有的育種水平提供依據(jù)[1]。本文研究玉米品種SSR分子聚類分析，以期使分子標(biāo)記輔助育種得到實(shí)際應(yīng)用。因此，利用SSR分子技術(shù)對玉米品種種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，對雜種優(yōu)勢群的劃分、種質(zhì)創(chuàng)新及新品種的選育等具有指導(dǎo)意義[2]。

玉米品種的分子鑒定技術(shù)經(jīng)過十多年的系統(tǒng)研究和鑒定實(shí)踐，從RAPD標(biāo)記技術(shù)，到目前基于SSR標(biāo)記技術(shù)日趨成熟。SSR標(biāo)記技術(shù)相比RFLP、RAPD和AFLP等標(biāo)記，具有多態(tài)性高、共顯性遺傳和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[3]，應(yīng)用在禾谷類、豆類、薯類和蔬菜類等作物的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、基因定位和分子輔助育種等領(lǐng)域。國內(nèi)外學(xué)者以玉米品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過20～70個(gè)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測到上百個(gè)等位基因變異位點(diǎn)，表明具有豐富的多態(tài)性信息，可以進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、雜種優(yōu)勢群劃分、QTL定位和分子輔助育種等研究[4]。

本研究利用SSR分子技術(shù)對目前遼寧省主要推廣的20個(gè)玉米品種進(jìn)行分子鑒定，為更好地利用遼寧省優(yōu)質(zhì)玉米品種種質(zhì)，以及分子標(biāo)記輔助育種提供遺傳信息奠定基礎(chǔ)。

1 材料

供試材料為20種不同玉米品種，由遼寧省種子管理局提供。品種名稱見表1。

表1 供試玉米品種名稱

2 方法

2.1 玉米品種基因組DNA提取

采用CTAB法提取玉米種子DNA[5]。

2.2 玉米品種SSR引物合成

根據(jù)國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，考慮引物多態(tài)性，并評價(jià)其在均勻地分布在染色體上，篩選20對SSR核心引物[5]，見表2，由大連TaKaRa生物工程公司合成。

2.3 玉米品種PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)終濃度組成為1×PCR Buffer，Mg2+2.5mmol·L-1，dNTPs 0.15mmol·L-1，雙向向引物0.25μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0U，DNA模板2μL，總體積達(dá)到20μL。

反應(yīng)程序：94℃時(shí)預(yù)變性5min，94℃時(shí)變性40s，60℃時(shí)退火35s，72℃時(shí)延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增35次，72℃時(shí)延伸5min，4℃時(shí)保存待測。

表2 20對SSR核心引物

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離電泳

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在94℃變性5min后，用4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。預(yù)電泳恒功率為90W，時(shí)間為20min；電泳分離恒功率為80W，時(shí)間為40min。用10%冰醋酸，固定時(shí)間為5min，用0.2%AgNO3溶液，染色時(shí)間為5min；雙蒸水漂洗凝膠2次，每次時(shí)間10s；用1.5% NaOH、0.4%甲醛配制顯影液，顯影；10%冰醋酸對凝膠定影。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將不同玉米品種在同一引物擴(kuò)增的所有DNA譜帶統(tǒng)一排序，按照擴(kuò)增片段從小到大順序，在相同遷移位置有譜帶的記錄“1”，沒有譜帶的記錄“0”，缺失記錄“9”，聚類分析0-1數(shù)據(jù)系統(tǒng)，距離系數(shù)為Nei,Lix系數(shù)，Cs=1-2a/(2a+b+c)按UPGMA方法進(jìn)行聚類。所有的數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft Excel 2013和Microsoft Word 2013，對玉米品種SSR分子鑒定結(jié)果進(jìn)行聚類分析采用DPS 7.05。

3 結(jié)果

3.1 玉米品種的SSR分子鑒定結(jié)果

如圖1所示，PCR產(chǎn)物在電泳分離顯影后，DNA擴(kuò)增條帶清晰可辨，具有良多態(tài)性，可以將結(jié)果記錄統(tǒng)計(jì)。將引物擴(kuò)增的所有DNA譜帶統(tǒng)一排序，按照擴(kuò)增片段從小到大順序，有譜帶的記錄“1”，沒有譜帶的記錄“0”，缺失記錄“9”,形成統(tǒng)計(jì)表用于聚類分析。

SSR分子技術(shù)分析中選取20對引物，在供試材料中共檢測到118譜帶，即118等位基因變異，選取清晰可辨的多態(tài)性片段83條用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

3.2 玉米品種SSR聚類分析結(jié)果

圖1 不同SSR引物擴(kuò)增玉米的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

本研究20對SSR核心引物中，電泳譜帶清晰且穩(wěn)定，平均分布在每一條染色體上，滿足玉米品種SSR分析。共檢測出83個(gè)等位基因。從圖2可知，各品種間遺傳距離系數(shù)為0.13～0.79，選取0.57為閾值，20個(gè)品種依據(jù)閥值可以劃分為4個(gè)類群，其中品種“乾坤1101”、“金剛98”、“鄭單958”、“連科8號”、“遼禾308”、“丹玉336號”、“乾坤528”等7個(gè)供試樣品劃為第Ⅰ類群；品種“東單60”劃為第Ⅱ類群；品種“錦成九”、“鐵南2號”、“鐵研818”、“郁青1號”、“遼單452”、“致泰6號”、“千松101號”、“佳昌689”、“鐵旭1843”、“郁青123號”等10個(gè)供試樣品劃為第Ⅲ類群；品種“元鈺66”、“富友1號”等2個(gè)供試樣品劃為第Ⅳ類群。

圖2 玉米品種SSR鑒定聚類樹狀圖

通過雜種優(yōu)勢模式的分析，可知旅黃改系統(tǒng)的品種全部劃分在第Ⅰ類群中，群內(nèi)品種之間的遺傳距離為0.14～0.66；“東單60”單獨(dú)成1個(gè)群，為旅大紅骨系統(tǒng)，同第Ⅰ類群親緣關(guān)系較近；第Ⅲ類群的群內(nèi)品種絕大部分是瑞德系統(tǒng)改良的品種，品種之間的遺傳距離為0.18～0.64；品種“元鈺66”、“富友1號”等2個(gè)供試樣品獨(dú)立成群，與其它品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明，遼寧主栽玉米品種中，旅黃改系統(tǒng)的應(yīng)用有明顯增加的幅度，同時(shí)，瑞德系統(tǒng)改良的品種也有上升趨勢，說明遼寧玉米品種種質(zhì)具有一定的遺傳多樣性。

4 討論

遼寧省位于東北平原，其地貌類型復(fù)雜多樣。東南部以山地丘陵沿海為主，中北部以平原內(nèi)陸為主，由于地勢和環(huán)境等因素，當(dāng)?shù)匮永m(xù)下來品種經(jīng)過長期的實(shí)踐選擇，具有一定的品種種質(zhì)多樣性。同時(shí)，本研究選取的品種數(shù)量有一定的局限性，若增加供試品種數(shù)量，聚類分析劃分的類群會更細(xì)致些。

本文選取20對SSR引物進(jìn)行研究，對其結(jié)果聚類分析，通過品種間的血緣關(guān)系遠(yuǎn)近，劃分不同的類群。對試驗(yàn)進(jìn)一步增加所選SSR引物，也可增加類群數(shù)量，但劃分類群過細(xì)，也不利用類群內(nèi)挑選適當(dāng)遺傳距離的目標(biāo)株系。通過下一步與配合力測定及評價(jià)相結(jié)合，拓寬遼寧省的玉米遺傳基礎(chǔ)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論參考，為更好地利用遼寧省優(yōu)質(zhì)玉米品種種質(zhì)，以及分子標(biāo)記輔助育種提供遺傳信息奠定基礎(chǔ)。