奶嚼克中產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選研究

李春冬郭元晟王福超徐偉良蘇圣琳郭梁

(1.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000； 3.錫林郭勒盟食品科學與檢測實驗中心/錫林郭勒盟農(nóng)畜產(chǎn)品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000； 4.延邊大學農(nóng)學院食品與生物科學系，吉林 延吉 133002)

蒙古族傳統(tǒng)乳制品源遠流長，其風味獨特且營養(yǎng)豐富，是蒙古族飲食和祭祀中不可缺少的一部分，因此在中國傳統(tǒng)乳制品的加工歷史上占有重要地位[1]。蒙古族傳統(tǒng)奶食品種類繁多，其中以卓禾(俗稱嚼克)、浩乳德(俗稱奶豆腐)、楚拉(俗稱奶渣子)等為代表的錫林郭勒傳統(tǒng)奶制品工藝獨特、加工方法獨具一格，曾是歷代皇家奶食的上等貢品[2]。蒙古族傳統(tǒng)乳制品含有大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及鈣、磷、鋅等營養(yǎng)成分，而且碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等經(jīng)自身含有的微生物發(fā)酵分解，可產(chǎn)生風味肽、脂肪酸、乙醛、雙乙酰、丁二酮等多種風味營養(yǎng)物質(zhì)，是天然的佳品[3]。其中，雙乙酰是構(gòu)成高脂類乳制品中奶油香味的主要組分，而乙醛、丁二酮、揮發(fā)性脂肪酸等則是酸奶中主要呈香物質(zhì)[4]。在蒙古族傳統(tǒng)乳制品中深受大眾喜歡的嚼克，也被人稱為嚼口，蒙語名字為“卓禾”。嚼克是一種口感略酸的高油脂類乳制品，其獨特的食用口感和高營養(yǎng)價值，使其成為蒙古族人民招待賓客的必備食物。蒙古族發(fā)酵奶嚼克和下層凝乳是利用環(huán)境中的微生物進行低溫自然發(fā)酵而成，保留了乳品自身風味的同時還可以含有豐富的微生物資源[4]。

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)，也被稱為三?；视退饷福宋镔|(zhì)可以進行直接水解等反應，產(chǎn)生甘油和脂肪酸或者進行催化水解，從而生成甘油一酯，如酯化、酯交換、醇解和酸解反應等[5,6]。在傳統(tǒng)生產(chǎn)方法中脂肪酶是從動物或者植物的組織中分離獲得，而目前脂肪酶主要通過微生物發(fā)酵的方式來生產(chǎn)。由于微生物的種類多且繁殖快，其產(chǎn)生的脂肪酶具有較廣的pH適應性、底物特異性以及選擇性。微生物脂肪酶一般為胞外酶，適合在工業(yè)中生產(chǎn)，因此微生物發(fā)酵是工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來源[7]。近年來，雖有學者對油脂污染的土壤、飯店下水道、污水和鹽湖等環(huán)境中分離得到產(chǎn)脂肪酶菌株[8-10]，但對蒙古族傳統(tǒng)奶嚼克中脂肪酶的分離和酶活測定還未見報道。為加強開發(fā)利用本地區(qū)微生物資源，本實驗通過對蒙古族傳統(tǒng)奶嚼克樣品中脂肪酶菌株進行分離、篩選、脂肪酶活性檢測及鑒定，以期為本地區(qū)產(chǎn)脂肪酶微生物更廣泛的應用提供一定基礎。

1 實驗器材與試劑

1.1 材料

對錫林浩特市傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的奶嚼克進行采樣，共采集5份奶嚼克作為實驗樣品。

1.2 培養(yǎng)基及乳化液

營養(yǎng)瓊脂加羅丹明B培養(yǎng)基：三丁酸甘油酯10mL，蛋白胨(Peptone)10g，牛肉膏(Beef Extract)3g，瓊脂(Agar)18g，氯化鈉(NaCl)5g，羅丹明B 0.5g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌30min。

液體種子培養(yǎng)基：氯化鈉(NaCl)5g，蛋白胨(Peptone)10g，牛肉膏(Beef Extract)3g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏0.5%，(NH4)2SO40.5%，KH2PO40.2%，NaCl 0.3%，MgSO47H2O 0.05%，橄欖油2%，121℃滅菌30min。

乳化液：將40g聚乙烯醇加入800mL蒸餾水中，置于沸水浴中加熱，攪拌至聚乙烯醇全部溶解，溶液自然冷卻后定容至1000mL(使用前使用干凈雙層紗布進行過濾)。取150mL上述聚乙烯醇濾液，加入50mL橄欖油后用勻漿機剪切6min，剪切后乳白色溶液即為聚乙烯醇乳化液。

1.3 試劑

三丁酸甘油酯(C15H26O6)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羅丹明B(C28H31CIN2O3)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；橄欖油(甘油三油酸酯)，國藥集團化學試劑有限公司；TaKaRa快速提取試劑盒(Code No.9164)，寶生物工程(大連)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器與設備

2720 Thermal Cycler PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機，德國艾本德股份公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國Thermo Fisher公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 產(chǎn)脂肪酶微生物的分離及初篩

采用羅丹明B法進行產(chǎn)脂肪酶微生物篩選，在無菌條件下稱取1g奶嚼克樣品，將稱取的奶嚼克樣品加入生理鹽水中進行梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)。使用移液槍分別吸取0.1mL稀釋液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將涂布的篩選營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d。培養(yǎng)完成后觀察菌落周圍是否有透明光圈出現(xiàn)，由此初步篩選出產(chǎn)脂肪酶菌株，將有透明光圈的菌株進行分離并保存。

2.2 產(chǎn)脂肪酶微生物的復篩

將初篩獲得的產(chǎn)脂肪酶菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速設置為150r·min-1。將培養(yǎng)結(jié)束后的菌液移至15mL的離心管中，8000r·min-1，4℃低溫離心10min，上清液為粗酶液，取上清液進行酶活力測定。

2.3 脂肪酶活力測定

實驗具體步驟參照GB/T 23535-2009的規(guī)定對脂肪酶進行酶活測定[11]。每個樣品取2個100mL三角瓶，取磷酸緩沖鹽溶液5mL與底物溶液4mL，在水浴鍋中將反應體系溶液預熱5min后立即加入1mL粗酶液混勻，將得到的混勻溶液加入15mL的乙醇溶液進行終止反應。之后利用0.05mol·L-1的NaOH標準溶液分別滴定酶作用后的空白對照和底物溶液，根據(jù)消耗的堿溶液體積計算其酶活力，脂肪酶制劑的酶活力計算公式：

式中，X為樣品的酶活力，U·mL-1；V1為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2為滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；C為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol·L-1；0.05為氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05mol·L-1氫氧化鈉溶液1mL相當于脂肪酸50μmol；N1為樣品的稀釋倍數(shù)；1/15為反應時間15min，以1min計；所得結(jié)果表示至整數(shù)。

2.4 產(chǎn)脂肪酶菌株分子鑒定

產(chǎn)脂肪酶菌株DNA提取使用Takara快速提取試劑盒。取5μL菌懸液液于滅菌的PCR管，加入50μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于PCR管中并吸打混勻，將PCR管置于金屬浴上80℃加熱15min，加熱后8000rpm低速離心5min得到上清液，上清液即為產(chǎn)脂肪酶菌株總DNA。

產(chǎn)脂肪酶菌株分子鑒定選用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)；反應體系為20μL，模板DNA 1μL、引物各1μL、Easy Taq PCR Super Mix 10μL、無菌ddH2O 7μL；PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min，共30循環(huán)，72℃末端延伸10min。

擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，條帶清晰的擴增產(chǎn)物進行測序(北京睿博生物科技有限公司)，測序結(jié)果經(jīng)過拼接后，在美國國立生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology formation. NCBI)進行BLAST同源比對。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)脂肪酶微生物的分離純化

經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂加羅丹明B培養(yǎng)基上分離的產(chǎn)透明圈菌落，如圖1所示，根據(jù)菌落顏色、邊緣是否整齊、表面是否光滑等篩選菌株，每個樣品分離5株菌株，共獲得25株產(chǎn)脂肪酶菌株，并命名為J2-1～J6-5。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株菌落形態(tài)

3.2 產(chǎn)脂肪酶微生物的復篩

對在蒙古族傳統(tǒng)乳制品奶嚼克中篩選的25株產(chǎn)脂肪酶菌株進行復篩，通過測定粗酶液酶活力的大小，進一步檢測菌株產(chǎn)脂肪酶活力，測定結(jié)果如表1所示。

表1 產(chǎn)脂肪酶菌株酶活測定結(jié)果

由表1可知，奶嚼克樣品中產(chǎn)脂肪酶菌株的脂肪酶活范圍在0～4.00U·mL-1，其中菌株J4-2酶活最高為4.00U·mL-1。劉曉麗等[12]在甘肅省蘭州市區(qū)餐館周邊采集油脂污染土壤樣品初篩的1株高產(chǎn)中性脂肪酶枯草芽孢桿菌，其初始酶活最高為3.74U·mL-1，又進行正交試驗對菌株產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的產(chǎn)脂肪酶酶活可達到7.58U·mL-1，比優(yōu)化前提高了2.03倍。而本實驗菌株酶活普遍偏低，其原因可能為菌株產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件未進行優(yōu)化。

3.3 產(chǎn)脂肪酶微生物的分子鑒定

將篩選出的25株具有產(chǎn)脂肪酶能力的單菌株(J-2-1～J-6-5)提取基因組DNA，PCR擴增后獲得的片段長度為1500bp，如圖2所示；16S rDNA共鑒定出17個單菌株，Ident均為100%，但有8株菌未鑒定出，鑒定結(jié)果如表1所示。其中，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)6株、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)4株、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)2株、隆德假單胞菌(Pseudomonas lundensis)1株、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)1株、單不動桿菌(Acinetobacter soli)1株、奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)1株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)1株。其中J-4-2為鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)。

圖 2 部分產(chǎn)脂肪酶菌株的電泳結(jié)果注：M為Marker。

表2 產(chǎn)脂肪酶細菌分子鑒定結(jié)果

熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)形狀呈桿狀且有鞭毛，歸屬于假單胞菌屬，是革蘭氏陰性需氧菌。熒光假單胞菌不但能產(chǎn)生抗生素、水解酶等代謝產(chǎn)物而且能分泌出色素，且發(fā)出黃綠色熒光。研究表明，假單胞菌屬和液化沙雷菌是原料乳中的優(yōu)勢嗜冷菌，其分泌的耐熱脂肪酶可分解乳脂中的脂肪，產(chǎn)生游離脂肪酸[13]。逄淑召等[14]利用正交實驗法對熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence 5963)進行了產(chǎn)脂肪酶條件篩選。張維清[15]在原料奶中分離得到1株產(chǎn)耐熱脂肪酶的熒光假單胞菌，并研究了其酶學特征，建立了一種高效可行的分離純化策略。

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是一種專性需氧型革蘭氏陰性桿菌，其在自然界中分布十分廣泛[16]。龐建勛[17]對自然界中多種含油脂植物樣本中分離篩選的不動桿菌屬菌株進行脂肪酶活的測定和脂肪酶的分離純化；鄭小梅[18]對在冰川土樣中分離獲得的不動桿菌進行脂肪酶和特異折疊酶的功能以及兩者之間的蛋白互作進行研究。

4 結(jié)論與討論

本實驗通過羅丹明B平板法和脂肪酶活力測定從5份奶嚼克中篩選出25株產(chǎn)脂肪酶菌株，測得菌株酶活范圍在0～4.00U·mL-1，其中J-4-2酶活力最高達到4.00U·mL-1，經(jīng)序列分析鑒定其為鮑曼不動桿菌。通過序列分析共鑒定出17株菌株，其中熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)6株、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)4株、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)2株、隆德假單胞菌(Pseudomonas lundensis)1株、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)1株、單不動桿菌(Acinetobacter soli)1株、奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)1株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)1株，均為報道過的產(chǎn)脂肪酶菌株。因此通過研究表明，蒙古族傳統(tǒng)奶嚼克制品不僅含有大量營養(yǎng)成分和特色風味營養(yǎng)物質(zhì)，更蘊含著能夠生產(chǎn)脂肪酶的微生物資源，這為豐富脂肪酶資源庫提供了有利條件，不但可以改善傳統(tǒng)奶嚼克的口感風味，還可以開發(fā)利用至工業(yè)方面。脂肪酶作為第3大酶制劑，在工業(yè)化應用方面非常廣泛。而本研究所篩選的產(chǎn)脂肪酶菌株，可用于生產(chǎn)特色低脂乳制品，為迎合市場趨勢和滿足消費者喜好及健康要求方面，提供新的開發(fā)潛能，同時也可以進一步開發(fā)為商業(yè)化脂肪酶制劑，具有廣泛的工業(yè)開發(fā)應用前景。