微液液提取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)葡萄酒9種農(nóng)藥殘留

黨富民，李自芹，劉長勇，唐宗貴，楊濤，趙志永★

（1新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心，新疆 石河子 832000；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵而成的飲料，適量飲用還能預(yù)防多種疾病，增強(qiáng)體質(zhì)[1-2]。但是在葡萄生產(chǎn)過程中，大量殺蟲劑[3-4]、殺菌劑[5-6]和除草劑[7]等農(nóng)藥噴施會(huì)殘留在葡萄及葡萄酒中。人長期進(jìn)食后，就會(huì)在體內(nèi)積累，引起慢性中毒[8-10]。由于葡萄酒產(chǎn)地廣泛，各地區(qū)使用農(nóng)藥種類不一，加上復(fù)配農(nóng)藥的大量使用，使得葡萄酒中農(nóng)藥殘留由單一種類向多種方向發(fā)展。為保證葡萄酒產(chǎn)品的食用安全，提高我國食品安全監(jiān)管水平[11-12]，保障公民身體健康，促進(jìn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，研究一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的葡萄酒中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法是非常必要的。

目前，國內(nèi)外酒類農(nóng)藥殘留前處理方法主要有液液萃取法[13-14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法[17]等，但這些前處理方法繁瑣、成本高，有毒有害化學(xué)試劑用量大[18-20]，對(duì)環(huán)境造成污染大。本文研究了微液液提?。∕LLE）技術(shù)作為樣品前處理方法，使樣品前處理簡單快捷，省去大量有毒試劑，節(jié)約成本，利于環(huán)保，適用于液體樣品的分析。通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正方法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足農(nóng)殘分析要求，方法可用于葡萄酒中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B/7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；N-EVAP111型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（美國Organomination公司）；TG16-WS型高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SK型快速混勻器（江蘇正基儀器有限公司）。丙酮為色譜純；乙腈、正己烷、氯化鈉均為分析純；敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.9%）。葡萄酒樣品均購自本地超市。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液：9種農(nóng)藥用丙酮配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋配制成基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱初始溫度：70℃保持1min，然后以30℃·min-1程序升溫至130℃，5℃·min-1升溫至250℃，10℃·min-1升溫至300℃，保持3min；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；柱流量：1.2mL·min-1（恒流模式）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：高純氦。

1.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊源：70eV；EI離子源溫度：230℃；MS接口溫度：280℃；測(cè)定模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式（MRM）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集通過Agilent Mass Hunter Acquisition軟件完成，數(shù)據(jù)處理利用Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis軟件完成。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確吸取5.0mL樣品置于50mL聚丙烯具塞離心管中，加入10mL乙腈，用液體混勻器在2500·r·min-1均質(zhì)提取1min。加入2～3g氯化鈉，再均質(zhì)1min，將離心管放入離心機(jī)，在6000·r·min-1離心3min，取上清液5mL，在50℃下氮吹濃縮至近干，用一定體積比的正己烷丙酮混合溶液定容至1mL（如樣品有雜質(zhì)經(jīng)0.2μm濾膜過濾），供氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 MLLE法提取條件的優(yōu)化

傳統(tǒng)的LLE法是在分液漏斗中進(jìn)行，耗時(shí)費(fèi)力，且成本較高。而本研究開發(fā)的MLLE法是在50mL離心管中進(jìn)行，快捷方便，節(jié)約成本，利于環(huán)保，適用于液體樣品的分析。農(nóng)藥殘留常見的提取劑有乙腈、丙酮、正己烷和乙酸乙酯等。相同條件下采用不同溶劑提取進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)使用乙腈和丙酮提取效果最好。以毒死蜱為例，4種不同溶劑回收率分別為85.3%、80.6%、73.6%、和62.7%，但由于丙酮極性大溶解色素雜質(zhì)比較多，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，而乙腈通用性強(qiáng)，對(duì)農(nóng)藥溶解度較大，可溶入的雜質(zhì)量適中，因此選擇乙腈作為提取溶劑，既保證了農(nóng)殘的提取效率又降低了基質(zhì)干擾。不同提取溶劑對(duì)葡萄酒中有機(jī)磷農(nóng)藥提取效果的比較見圖1。

圖1 不同提取溶劑對(duì)葡萄酒中有機(jī)磷農(nóng)藥提取效果的比較Table 1 Extraction eficlency of pesticides in grape wine samples by different solvents

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)過程中，為了保證定性和定量的準(zhǔn)確，必須對(duì)待測(cè)物的母離子和子離子、碰撞能量、掃描時(shí)間及監(jiān)測(cè)反應(yīng)離子的數(shù)目等一系列參數(shù)和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到最佳的檢測(cè)效果。為優(yōu)化出最佳的質(zhì)譜條件，本實(shí)驗(yàn)在固定色譜條件下，通過優(yōu)化碰撞能量（5～50ev）獲得產(chǎn)物離子，最后采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，按保留時(shí)間分配采集時(shí)間進(jìn)行掃描（MRM參數(shù)見表1），在保證每一種組分都具有良好峰形的前提下，達(dá)到了較高的靈敏度。在上述色譜條件下，得出混合標(biāo)樣的MRM譜圖（見圖2），在MRM模式下，對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行分離，敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷9種農(nóng)藥均可較好地分離。

圖2 9種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）圖Figure 2 MRM chromatogram of standard solution of 9 pesticides standard solution

表1 9種有機(jī)磷農(nóng)藥的MRM參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of 9 organophosphorous pesticides at MRM scan mode

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成濃度0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg·mL-1，在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上述濃度范圍內(nèi)，敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷的濃度分別與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算得到9種有機(jī)磷的檢出限均為0.005mg·L-1。以10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算得到9種有機(jī)磷的定量限均為0.01 mg·L-1，結(jié)果見表2。

表2 9種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和精密度（n=6）Table 2 Recovery and precision of 9 organophosphorous pesticides（n=6）

2.4 方法精密度和回收率的測(cè)定

在陰性葡萄酒的樣品中分別添加3個(gè)濃度的添加水平，分別為0.02mg·L-1、0.10mg·L-1和0.20mg·L-1，對(duì)敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷測(cè)定回收率，每個(gè)水平均平行處理測(cè)定6個(gè)樣，計(jì)算平均回收率及精密度，結(jié)果見表2。經(jīng)測(cè)定，平均回收率在70%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，本方法中農(nóng)藥組分測(cè)試結(jié)果處于可接受范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了葡萄酒中9種農(nóng)藥殘留的快速定性與定量分析，采用MRM模式，對(duì)目標(biāo)物不產(chǎn)生干擾，達(dá)到了較高的靈敏度，葡萄酒空白樣品中添加有機(jī)磷農(nóng)藥的MRM圖見圖3。從圖可知采用本法對(duì)葡萄酒的處理，可以很好的去除色素等雜雜質(zhì)的干擾。

圖3 葡萄酒空白樣品中添加有機(jī)磷農(nóng)藥的MRM圖Figure 3 MRM chromatogram of organophosphorous pesticides standards in blank grape wine amples

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)上的50份葡萄酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，在葡萄酒中檢出甲基對(duì)硫磷和毒死蜱2種有機(jī)磷農(nóng)殘，有機(jī)磷農(nóng)殘含量在0.06～0.22mg·L-1之間，表明所購葡萄中含有有機(jī)磷殘留且經(jīng)發(fā)酵釀酒過程仍有部分農(nóng)藥殘存于酒中。

3 結(jié)論

本研究采用微液液提取方法結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，建立葡萄酒中9種農(nóng)殘的檢測(cè)方法。該方法前處理簡單、快捷，縮短檢測(cè)時(shí)間，減少有機(jī)溶劑的使用量，節(jié)能環(huán)保；采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)減小基質(zhì)干擾，化合物背景噪音更低，響應(yīng)值較高，提高檢測(cè)靈敏度，減少“假陽性”風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)低限可滿足目前法規(guī)中對(duì)葡萄酒中各農(nóng)藥殘留限量的要求。并對(duì)方法的線性范圍、回收率、精密度、檢測(cè)限等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)均符合《殘留分析質(zhì)量控制指南》要求。該方法靈敏、高效，可用于葡萄酒中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速分析檢測(cè)，并為其他葡萄酒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考。