蛇床子催眠活性組分對PCPA失眠大鼠松果體細胞凋亡和相關Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

郭晉良，楊鈐，王若瑜，宋美卿，賈力莉，牛艷艷，仝立國，馮瑪莉

(山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012)

松果體(Pineal gland，PG)被認為是晝夜節(jié)律的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)換器，以高度晝夜節(jié)律的方式產(chǎn)生褪黑激素(Melatonin，MT)，傳播晝夜節(jié)律的信息[1]。褪黑素作為松果體的主要分泌產(chǎn)物，除了具有鎮(zhèn)靜、調(diào)整生物鐘外，還有強大的清除氧自由基和抗氧化功能、保護膜脂質(zhì)、線粒體免受氧化損傷，維持神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能等作用[2-3]。當松果體結構功能損傷后，會影響褪黑素分泌引發(fā)一系列生理紊亂。目前研究認為，松果體組織結構損傷與細胞凋亡關系密切，細胞凋亡導致細胞可控性自我滅亡，當細胞開始受損或不再被機體需要時，會發(fā)生凋亡或稱程序性細胞死亡，為機體生理過程[4]，因此松果體細胞凋亡可能是導致松果體組織發(fā)生不可逆損傷的重要原因，而細胞凋亡由多種凋亡基因調(diào)控，其中對Bcl-2、Bax的研究調(diào)控線粒體凋亡途徑的重要蛋白[5]。

前期研究發(fā)現(xiàn)PCPA制備失眠大鼠導致松果體細胞排列、細胞結構改變，具有顯著催眠作用的蛇床子催眠活性組分對PCPA失眠大鼠致松果體結功能損傷具有改善作用[6-7]。本研究在前期基礎上，觀測CHC對松果體組織細胞凋亡密切相關的Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，基于線粒體介導的細胞凋亡途徑，探討CHC改善PCPA失眠大鼠松果體損傷作用靶點，以期從蛇床子催眠活性成分中發(fā)現(xiàn)保護松果體有效成分及其機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，雄性，4～6月齡，購買自北京華阜康生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0008，合格證號：110322011006905，置恒定溫度(22～24 ℃)與濕度(40%～50%)的實驗環(huán)境中，自由飲水、攝食飼料。

1.2 藥品與試劑

CHC制備：蛇床子600 g粉碎成粗粉，加95%的乙醇加熱回流提取，濾過，干燥，浸膏，通過D101大孔吸附樹脂柱層析，30%～95%濃度乙醇梯度洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得20.5 g，每克折合蛇床子29 g，使用時以2 %吐溫80配制成不同濃度的混懸液；褪黑素(北京Solarbio公司，批號：917D021)。Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物公司，批號：20190730)；TUNEL試劑盒(碧云天，批號：011420200717)；Bcl-2多克隆抗體(abcam公司，批號：CR249198-76)；Bax多克隆抗體(CST公司，批號：9662S)。

1.3 儀器

Navios 10流式細胞儀(美國 Beckman Coulter 公司)；Heated自動染色機(美國Thermo Fisher公司)；Shandon Clearvue自動封片機(美國Thermo Fisher公司)；BX51+DPT2+IPE萬能顯微鏡熒光成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型制備與分組

大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分為空白對照組、模型對照組、MT陽性對照(10 mg/kg)組、CHC高、中、低劑量(60、30、15 mg/kg)組，每組10只。參考PCPA混懸液配制方法[3]改良如下：用時以2%吐溫-80配制碳酸鹽(碳酸鈉/碳酸氫鈉)緩沖液(pH 10.1)，配成4.5% PCPA混懸液。除空白對照組給予等量含2%吐溫的碳酸鹽緩沖液，其余各組大鼠腹腔注射PCPA混懸液0.45 g/kg，每天1次，連續(xù)2 d。造模各組大鼠晝夜節(jié)律消失，出現(xiàn)皮毛枯槁戰(zhàn)栗且易脫落等外觀改變，直立、洗臉、走動等次數(shù)變多，興奮性增高，易驚嚇，易激惹，易攻擊撕咬，表明模型復制成功。各給藥組灌胃給藥，空白對照組、模型對照組灌胃等體積2%吐溫-80，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 指標檢測

2.2.1 記錄體質(zhì)量

在造模前、造模后灌胃前、灌胃后3個時間節(jié)點稱量各組大鼠體質(zhì)量。

2.2.2 松果體組織病理學觀察

末次給藥30 min后，剖取松果體，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

2.2.3 TUNEL凋亡指數(shù)檢測

取松果體組織切片，經(jīng)脫蠟、脫水后，采用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。高倍鏡(×400)顯微鏡觀察細胞核呈棕褐色為陽性細胞，計算松果體細胞凋亡指數(shù)，以凋亡指數(shù)反映各組松果體凋亡的情況，凋亡指數(shù)(Allgroups’apoptosisindex,AI)=視野內(nèi)凋亡細胞個數(shù)/視野內(nèi)所有松果體細胞個數(shù)。

2.2.4 流式細胞術檢測松果體凋亡

同上法剖取松果體，PBS(pH7.2、0.01 mol/L)清洗，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃、20 min，加胎牛血清終止消化，過濾，去除結締組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用Binding緩沖液調(diào)細胞懸液至細胞濃度為5×106/mL，取細胞懸液100 μL，加AnnexinV-FITC及Propidium Iodide各5 μL，避光孵育15 min，加Binding緩沖液0.5 mL，上機檢測。

2.2.5 免疫組化檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達

按中杉金橋兔二步法檢測試劑盒說明書操作，Bcl-2、Bax稀釋度分別為1∶200及1∶100，DAB顯色，陽性表達細胞被染成棕黃色，顯微鏡觀察并拍片。用Image pro plus 6.0進行分析，以積分吸光度和陽性染色面積比值表示蛋白的相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 體質(zhì)量變化

體質(zhì)量變化：對造模前、造模后給藥前、給藥后3個時間節(jié)點的大鼠體質(zhì)量進行分析，與空白對照組比較，造模前各組大鼠體質(zhì)量并沒有差別、較穩(wěn)定，具有可比性；腹腔注射PCPA混懸液后造模各組大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢，模型對照組顯著低于空白對照組(P<0.01)；給藥后模型對照組顯著低于空白對照組(P<0.01)，CHC高、CHC中劑量組顯著高于模型對照組(P<0.01，P<0.05)，給藥各組的體質(zhì)量均數(shù)介于PCPA模型與空白對照組之間，見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

3.2 各組大鼠病理組織學變化

空白對照組松果體細胞排列緊密，細胞核呈圓形，可見明顯的核仁并有較深的著色，胞質(zhì)由于弱嗜堿性而染色較淺，胞膜完整；膠質(zhì)細胞呈梭形或星形少數(shù)，形態(tài)規(guī)則，核仁清晰，整體無明顯細胞損傷表現(xiàn)。模型對照組的松果體細胞數(shù)目明顯減少，細胞界限模糊，細胞體積萎縮變小，排列紊亂疏松，無明顯規(guī)律，胞質(zhì)內(nèi)存在較多大小不一的脂滴，空泡變性明顯增多，細胞核固縮向周邊移動，出現(xiàn)少量凋亡小體，膠質(zhì)細胞減少。MT組松果體細胞紊亂排列，數(shù)目減少，空泡變性增多，細胞界限模糊不清。CHC高、CHC中劑量組的松果體細胞排列輕度紊亂，核固縮，CHC高劑量組的松果體細胞形態(tài)恢復效果最好。CHC低劑量組與模型對照組無明顯差別，見圖1。

圖1 各組大鼠松果體病理組織學變化(HE，×400)

3.3 各組大鼠松果體細胞凋亡情況

3.3.1 TUNEL松果體AI指數(shù)

模型對照組AI指數(shù)顯著高于空白對照(P<0.01)；MT組、CHC高、中劑量組AI指數(shù)顯著低于模型對照組(P<0.01)，見表2。

3.3.2 各組大鼠松果體早期凋亡率

模型對照組大鼠松果體細胞早期凋亡率顯著高于空白對照組(P<0.05)；CHC高劑量組早期凋亡率顯著低于模型對照組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠松果體凋亡指數(shù)、早期凋亡率的比較

3.4 各組大鼠對松果體Bax、Bcl-2表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組Bcl-2陽性表達明顯下降(P<0.05)，與模型組比較，MT組、CHC高、中劑量組Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01，P<0.05)；與空白對照組比較，模型對照組Bax陽性表達顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，MT組、CHC高、中劑量組Bax蛋白表達明顯下降(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠松果體Bcl-2、Bax表達情況

4 討論

PCPA是一種作用于5-HT生物合成中的色氨酸羥化酶的不可逆抑制劑，阻斷5-HT合成，常用于建立大鼠失眠模型，為制備失眠模型的經(jīng)典方法[8]。課題組前期在模型評價時光鏡、電鏡下觀察松果體組織出現(xiàn)明顯病理改變，證實腹腔注射PCPA損傷大鼠松果體結構，本實驗以2%吐溫-80增加PCPA溶解，為PCPA制備失眠造模提供更有效的方法。腹腔注射PCPA混懸液誘發(fā)大鼠松果體損傷及凋亡的機制尚不清楚，未見PCPA化學毒性、神經(jīng)毒性或損傷組織細胞的相關報道。文獻提示長期清醒狀態(tài)下大腦更易受氧化應激的影響，由于腦組織不飽和脂肪酸及蛋白質(zhì)含量較高，代謝旺更易氧化和產(chǎn)生自由基，細胞、組織更易受損[9-11]，PCPA注射后大鼠持續(xù)清醒狀態(tài)可能是松果體受到損傷的一部分原因。本次實驗病理切片顯示,PCPA造模組細胞周圍間隙增寬，細胞數(shù)目減少且形態(tài)不完整，胞體變小，胞核變形不規(guī)則，空泡變性增多，CHC中、高劑量組大鼠松果體細胞數(shù)量、排列規(guī)則、形態(tài)均接近正常大鼠，再次驗證腹腔注射PCPA對松果體結構功能造成一定的破壞，CHC可不同程度改善松果體損傷。

目前在PCPA大鼠模型中關于體質(zhì)量變化的相關統(tǒng)計，結果基本一致，相關實驗證明大鼠注射PCPA后體質(zhì)量延緩增長或降低，但有關體質(zhì)量減低的明顯差異節(jié)點不同。有部分實驗研究提示PCPA注射2 d后體質(zhì)量迅速下降，與空白對照組比較差異十分顯著[12-13]。本次結果顯示，造模前各組大鼠體質(zhì)量與空白對照組比較無差別，各組大鼠的體質(zhì)量相對穩(wěn)定，具有可比性；腹腔注射PCPA 2 d對大鼠體質(zhì)量產(chǎn)生影響，造模后大鼠體質(zhì)量明顯下降，隨7 d灌胃給藥，各組大鼠體質(zhì)量緩慢增長，CHC中、高劑量組體質(zhì)量得到改善，說明CHC可緩解PCPA失眠大鼠體質(zhì)量下降的趨勢。

細胞凋亡是由相關基因經(jīng)過特定的調(diào)控程序、參與細胞生理性死亡的過程。目前已報道有數(shù)十種基因調(diào)控著細胞凋亡過程。比如按照功能區(qū)分為能夠抑制凋亡基因的IAP、Bcl-2、EIB等作為一類,能夠促進凋亡基因的Fas、Bid、Bax、P53等作為一類。還有能夠雙向調(diào)控基因比如Bcl-x、C-mye等[14-15]。在這3類相關調(diào)控基因中，Bcl-2是目前被認識第一個識別為能夠抑制細胞凋亡的特定基因，相關研究指出基因Bcl-2能夠抵抗其凋亡機制的主要原因有直接性的抗氧化、抑制細胞中調(diào)節(jié)蛋白Bak、Bax的促凋亡的細胞毒作用、牽制在線粒體中釋放加速凋亡的相關蛋白質(zhì)比如凋亡誘導因子(AIF)和細胞色素C、以及阻止凋亡蛋白酶激活、維持相關細胞鈣的穩(wěn)態(tài)[16-17]。其中Bcl-2/Bax是能夠抑凋亡和促細胞凋亡的特定基因表達的蛋白。兩對功能相反的基因關系極為密切，因為兩個基因的表達能夠平衡，這決定著相關細胞存活和特定細胞的死亡[18]。

本次實驗研究中應用TUNELAI指數(shù)及流式觀察早期細胞凋亡的計算發(fā)現(xiàn)，說明PCPA模型組大鼠顯著增加了松果體細胞凋亡，MT組同CHC中、高劑量組均能抑制松果體細胞凋亡，證實了CHC對松果體保護作用的實驗驗證。實驗結果同時顯示，模型對照組松果體Bcl-2蛋白表達下降，但Bax蛋白表達增加明顯。通過給予CHC之后，Bcl-2的表達會明顯升高，但Bax 表達會降低明顯，提示CHC通過協(xié)調(diào)Bcl-2/Bax的平衡對PCPA失眠大鼠細胞凋亡進行改善與保護。如果能夠?qū)HC的凋亡機制做更充分和深入的了解，更全面去認識CHC，它可能會成為一個潛在的治療松果體損傷并且能夠改善睡眠的新藥，為失眠患者帶來福音。