急性心肌梗死患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-132、單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

李晶瑾， 翟陽(yáng)， 靳剛， 陳茜， 黃欣**

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710061； 2.陜西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 陜西 西安 710061； 3.西安市華山中心醫(yī)院 影像科， 陜西 西安 710061； 4.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科， 陜西 西安 710061)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種由內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮下脂蛋白潴留引起的動(dòng)脈壁慢性炎癥性疾病，包括單核/巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[1]。最近新發(fā)現(xiàn)的小分子物質(zhì)——微小RNA (microRNA，miRNA) 作為細(xì)胞黏附、增殖、脂質(zhì)吸收和流出以及炎癥介質(zhì)生成等病理生理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究提供了新的分子視角，并提供了新的治療靶點(diǎn)；微小RNA還能夠作為疾病診斷、評(píng)估預(yù)后和治療反應(yīng)的特異性生物標(biāo)志物[2]。miR-132是一種炎癥相關(guān)微小RNA，在炎癥性疾病類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血漿中表達(dá)水平升高[3]，在外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中表達(dá)也明顯升高[4]，在前體脂肪干細(xì)胞中miR-132通過(guò)影響核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的活性來(lái)促進(jìn)促炎細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的表達(dá)[5]。生物信息分析(http://www.targetscan.org)顯示miR-132可以和細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin 1, SIRT1) 3′UTR特異性結(jié)合，同時(shí)有研究也進(jìn)一步證實(shí)miR-132靶向SIRT1 3′UTR并降低其活性[6]。目前研究證實(shí)，SIRT1對(duì)內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)激起保護(hù)作用，低水平SIRT1與心肌梗死的病史顯著相關(guān)，并且能夠預(yù)測(cè)冠心病心肌梗死的發(fā)生[7]。但是，冠心病急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者PBMC中miR-132的表達(dá)是否發(fā)生改變，miR-132是否參與動(dòng)脈粥樣硬化及AMI的發(fā)生，是否能夠成為診斷AMI及評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)目前尚不明確。因此，本研究旨在探討AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1的表達(dá)，與心肌損傷、心衰、左心室重構(gòu)及AMI預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2018年10月—2019年2月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者共174例，其中男124例、女50例?；颊吲R床癥狀、心電圖、心肌損傷標(biāo)志物及冠脈影像學(xué)檢查等均符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[8]及《2020年歐洲心臟病學(xué)會(huì)非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征管理指南》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)為AMI組，共84例；經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CTA排除冠心病患者為非冠心病(non-coronary heart disease, NCHD)組，共90例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1月出現(xiàn)過(guò)明確感染者;(2)重度腎功能不全(基于MDRD方程計(jì)算得出的腎小球?yàn)V過(guò)率估計(jì)值<30 mL/(min·1.73 m2)或長(zhǎng)期接受透析);(3)重度肝功能不全(ALT≥正常高限5倍);(4)近1月有外科手術(shù)史、活動(dòng)性出血史者;(5)合并有結(jié)締組織疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者。AMI組患者隨訪1年，收集主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events, MACE)，包括心源性死亡、非致死性AMI、靶血管血運(yùn)重建以及再住院(復(fù)發(fā)心絞痛和心力衰竭)，按照是否發(fā)生MACE分亞組，1年內(nèi)發(fā)生MACE為預(yù)后不良組，無(wú)MACE為預(yù)后良好組。所有研究對(duì)象均對(duì)相關(guān)研究知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料、臨床生化及左心室重構(gòu)及左心功能指標(biāo) 收集2組患者一般資料(性別、年齡、高血壓及糖尿病史、吸煙史)和臨床生化指標(biāo)[白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、高敏肌鈣蛋白T(hs-cTnT)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]及1年隨訪時(shí)左心室重構(gòu)及左心功能指標(biāo)[左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)及心輸出量(CO)]

1.2.2標(biāo)本采集并提取PBMC 所有患者入院后采集空腹靜脈血5 mL，2 000 r/min離心10 min分離血細(xì)胞和血漿，血細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管加PBS至10 mL混勻。15 mL離心管加人外周血淋巴細(xì)胞分離液5 mL，將血細(xì)胞懸液鋪于人外周血淋巴細(xì)胞分離液面上，室溫下2 000 r/min離心20 min(升降速度均調(diào)為0)，吸取中間云霧狀的淋巴細(xì)胞層即為PBMC，用PBS清洗后無(wú)酶EP管-80 ℃凍存。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) PBMC冰上解凍，采用RNAfast200試劑盒提取總RNA。用Nano Drop 檢測(cè)總RNA的濃度以及純度，選取1.8≤A260/A280≤2.1的樣本，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA及時(shí)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃凍存。miR-132上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAACAGTCTACAGCCA-3′，miR-132下游引物為5′-CTCAACTGG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGACCATG-3′；MCP-1上游引物為5′-AATCAA TGCCCCAGTCACCT-3′，MCP-1下游引物為5′-TCAGCACAGATCTCCTTGGC-3′。分別以 U6、GAPDH為內(nèi)參照，每組數(shù)據(jù)取3個(gè)樣本行RT-qPCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 15 s退火、72 ℃ 10 s延伸，重復(fù)45循環(huán)，Real-time PCR Bio-Rad iQ5采集擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)并自動(dòng)分析，獲得擴(kuò)增曲線、溶解曲線，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得出Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料和臨床生化指標(biāo)

研究共納入174例患者，其中 AMI組 84例，NCHD組90例。2組患者在年齡、性別、合并高血壓、糖尿病及吸煙史方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入院時(shí)2組患者臨床生化指標(biāo)比較，AMI組患者的WBC、LYM、CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP、TG、CHOL、LDL-C均較NCHD組升高、HDL-C較NCHD組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 AMI組和NCHD組患者一般資料和臨床生化指標(biāo)Tab.1 Clinical characteristics of NCHD and AMI groups

2.2 左心室重構(gòu)及左心功能指標(biāo)

1年隨訪時(shí)， AMI組LVESD、LVEDD較NCHD組升高，LVEF、LVFS、CO較NCHD組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 AMI組和NCHD組患者1年隨訪時(shí)的左心室重構(gòu)及左心功能指標(biāo)Tab.2 Cardiac ultrasound indexes of

2.3 PBMC中miR-132和MCP-1的表達(dá)

AMI組患者PBMC中miR-132、MCP-1的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于NCHD組(t=10.37、10.59，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

注：A、B分別為miR-132和MCP-1表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與NCHD組比較，P<0.01。圖1 AMI組和NCHD組患者PBMC中miR-132和MCP-1的表達(dá)Fig.1 Expression levels of miR-132 and MCP-1 in PBMCs of AMI and NCHD groups

2.4 PBMC中miR-132和MCP-1的相關(guān)性分析

AMI患者PBMC中MCP-1與miR-132表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.71，P<0.01)；對(duì)所有患者M(jìn)CP-1與miR-132表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.82，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

注：A為AMI患者，B為所有患者。圖2 不同患者M(jìn)CP-1與miR-132表達(dá)的相關(guān)性Fig.2 Correlation analysis of miR-132 and MCP-1

2.5 AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標(biāo)志物、NT-proBNP及心臟超聲指標(biāo)的相關(guān)性

AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1表達(dá)量，與血清CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP正相關(guān)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與心臟超聲指標(biāo)LVESD、LVEDD正相關(guān)且且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與心臟超聲指標(biāo)LVEF、LVFS、CO負(fù)相關(guān)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 miR-132、MCP-1與心肌損傷標(biāo)志物、NT-proBNP及心臟超聲指標(biāo)的相關(guān)性Tab.3 Correlation analysis of miR-132, MCP-1 with myocardial injury markers, NT proBNP, and cardiac ultrasound indexes

2.6 miR-132和MCP-1對(duì)AMI的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示，PBMC中miR-132表達(dá)量診斷AMI的AUC為0.92(95%CI為0.88～0.96，P<0.01),診斷靈敏度為84.52%、特異度為82.22%；MCP-1表達(dá)量診斷AMI的AUC為0.90(95%CI為0.86～0.95，P<0.01),診斷靈敏度為96.43%、特異度為80.00%。二者聯(lián)合診斷AMI的AUC為0.96(95%CI為0.94～0.98，P<0.01),診斷靈敏度為89.29%、特異度為85.56%。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-132和MCP-1對(duì)AMI的ROC曲線Fig.3 ROC curves of miR-132 and MCP-1 for AMI

2.7 不同預(yù)后AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標(biāo)志物、NT-proBNP及心臟超聲指標(biāo)

AMI患者依據(jù)隨訪1年是否發(fā)生MACE時(shí)間分為預(yù)后不良組(n=24)及預(yù)后良好組(n=60)。對(duì)2個(gè)亞組miR-132、MCP-1、心肌損傷標(biāo)志物，以及反映左室重構(gòu)和左心功能的超聲指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組PBMC中miR-132、MCP-1表達(dá)量升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血清中hs-cTnT、NT-proBNP升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；心臟超聲指標(biāo)LVESD、LVEDD升高，LVEF、LVFS、CO降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 不同預(yù)后AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標(biāo)志物、NT-proBNP及心臟超聲指標(biāo)Tab.4 miR-132, MCP-1，myocardial injury markers, NT proBNP, and cardiac ultrasound indicators in the patients with different

2.8 是否發(fā)生MACE的多因素回歸分析

對(duì)AMI患者隨訪1年發(fā)生MACE的預(yù)后不良組及無(wú)MACE的預(yù)后良好組，兩組間有差異的指標(biāo)進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示miR-132、MCP-1、NT-proBNP，以及心臟超聲指標(biāo)LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS是AMI是否發(fā)生MACE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 MACE相關(guān)危險(xiǎn)因素的多因素回歸分析Tab.5 Multivariate regression analysis of MACE related risk factors

2.9 miR-132和MCP-1對(duì)AMI患者預(yù)后不良的評(píng)估價(jià)值

AMI組1年隨訪發(fā)生MACE提示預(yù)后不良。ROC曲線顯示，PBMC中miR-132表達(dá)量預(yù)測(cè)AMI患者預(yù)后不良的曲線下面積為0.84(95%CI為0.76～0.93，P<0.01)，診斷靈敏度為87.50%，特異度為75.00%； MCP-1表達(dá)量預(yù)測(cè)AMI患者預(yù)后不良的AUC為0.74(95%CI為0.62～0.87，P<0.01),診斷靈敏度為79.17%、特異度為68.33%。二者聯(lián)合預(yù)測(cè) AMI患者預(yù)后不良的AUC為0.85(95%CI為0.76～0.93，P<0.01),診斷靈敏度為79.17%，特異度為73.33%。見(jiàn)圖4。

圖4 miR-132和MCP-1對(duì)AMI預(yù)后不良的ROC曲線Fig.4 ROC curves of mir-132 and MCP-1 for poor prognosis of AMI

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是一種慢性炎癥性疾病[10]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生同代謝紊亂和炎癥直接相關(guān)，微小RNA作為一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子，能夠結(jié)合到靶信使RNA的3′非翻譯區(qū)或特異性抑制翻譯，從而誘導(dǎo)生理過(guò)程或信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、血管生成發(fā)育和脂質(zhì)代謝，直接影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[11-13]。如：miR-145通過(guò)靶向CD137和活化T細(xì)胞的核因子1抑制NLRP3炎癥小體活化[14]；miR-19b可能通過(guò)下調(diào)ABCA1表達(dá)導(dǎo)致膽固醇紊亂[15]；miR-132作為新的血管平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制TRAF作用蛋白的表達(dá)抑制新生內(nèi)膜的形成[16]。微小RNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因，參與病理生理過(guò)程，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[17]。

miR-132是一種炎癥相關(guān)性微小RNA。脂多糖能夠刺激單核細(xì)胞并誘導(dǎo)其高表達(dá)miR-132[18]。角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-132可以抑制NF-κB途徑減少趨化因子的產(chǎn)生和吸引白細(xì)胞的能力，相反miR-132增加了STAT3和ERK通路的活性[19]。SIRT1減輕動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮炎癥改善內(nèi)皮功能[20]，研究發(fā)現(xiàn)miR-132靶向SIRT1 3′UTR并降低其活性，從而導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)劑p53乙?；脑黾覽6]。原代人脂肪干細(xì)胞miR-132過(guò)度表達(dá)足以誘導(dǎo)NF-κB易位、p65乙?；瑥亩せ頝F-κB和IL-8和MCP-1的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致IL-8、MCP-1表達(dá)增加[5]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中miR-132、miR-143、miR-155、MiR-29a、表達(dá)水平明顯升高[21]，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PBMC中觀察到miR-132的表達(dá)明顯升高[22]。miR-132靶向SIRT1 3′UTR可以促進(jìn)動(dòng)脈硬化的進(jìn)展，同時(shí)也可作為炎癥性疾病診斷新的生物標(biāo)志物。

PBMC主要含有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，能夠參與炎癥過(guò)程，在炎癥性疾病的調(diào)控中起到重要的作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生發(fā)展有直接的影響[23]。PBMC、巨噬細(xì)胞在免疫激發(fā)后能夠合成大量NO，以對(duì)某些炎性細(xì)胞因子(包括IFN-γ、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-15)做出反應(yīng)，PBMC相關(guān)的生物標(biāo)志物為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和診斷提供了新的思路[24]。MCP-1作為單核細(xì)胞趨化因子的一員，在單核細(xì)胞募集、遷移，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，直接參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，并且可能影響到動(dòng)脈粥硬化斑塊的穩(wěn)定性[25]，在AMI發(fā)生中具有重要意義。

本研究比較了AMI及NCHD患者PBMC中miR-132及MCP-1表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)miR-132及MCP-1的表達(dá)量在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病AMI患者PBMC中升高，提示二者與AMI的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，miR-132與MCP-1表達(dá)量正相關(guān)，結(jié)合既往研究推測(cè)，二者有可能均通過(guò)SIRT1/NF-κB信號(hào)通路影響AMI的發(fā)生，有待細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。AMI的發(fā)生伴隨著心肌壞死，引發(fā)心室重構(gòu)及心功能下降。本研究分析了反映心肌壞死的心肌損傷標(biāo)志物CK、CKMB、hs-cTnT，反應(yīng)心功能的NT-proBNP、LVEF、LVFS、CO，以及反應(yīng)心室重構(gòu)的LVESD、LVEDD指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AMI組患者CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP、LVESD、LVEDD水平均高于NCHD對(duì)照組，LVEF、LVFS、CO均低于對(duì)照組，提示了AMI患者存在心室的重構(gòu)及心功能下降。對(duì)AMI患者隨訪收集MACE事件，進(jìn)而按預(yù)后進(jìn)行亞組分析顯示，AMI預(yù)后不良亞組miR-132、MCP-1、hs-cTnT、NT-proBNP、LVESD、LVEDD明顯高于預(yù)后良好亞組，LVEF、LVFS、CO明顯低于預(yù)后良好亞組，提示AMI患者預(yù)后不良，與心肌壞死、心功能下降及左心室重構(gòu)有關(guān)。多因素回歸分析顯示miR-132、MCP-1、NT-proBNP、LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS為AMI患者1年是否發(fā)生MACE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步研究顯示，AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1表達(dá)量與心肌損傷標(biāo)志物CK、CKMB、hs-cTnT相關(guān)；與心衰指標(biāo)NT-proBNP、LVEF、LVFS、CO相關(guān)；與左心室重構(gòu)指標(biāo)LVESD、LVEDD相關(guān)，提示miR-132、MCP-1可能與心肌損傷、心功能、左心室重構(gòu)相互影響，從而協(xié)同AMI的發(fā)生、影響AMI的預(yù)后，機(jī)制尚需深入研究證實(shí)。miR-132 、MCP-1診斷AMI的AUC分別為0.92、0.90，聯(lián)合AUC為0.96，兩者聯(lián)合可有效提高AMI的診斷效能；預(yù)測(cè)AMI預(yù)后不良的AUC分別為0.85、0.74，聯(lián)合AUC為0.84，提示miR-132 、MCP-1對(duì)診斷AMI以及預(yù)測(cè)預(yù)后不良均有一定的價(jià)值，為臨床上AMI的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。

本研究提示，miR-132與MCP-1在AMI患者PBMC中表達(dá)量升高，與心肌損傷的程度、左室重構(gòu)及左心功能有關(guān)，有可能作為AMI診斷及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)新指標(biāo)。